LAM 2001;12(2):140-2.

BIOTECHNOLÓGIA

Molekuláris diagnosztika: várakozások és reális lehetőségek

Holló Zsolt

A Humán Genom Projekt (HGP) befejezése után egy évvel a laikus is érdeklődéssel fordul a genetikai eredmények felé, és kíváncsian várja például az emberi klónozással kapcsolatos híreket. Bár a közvélemény a HGP vagy a többi lenyűgöző genetikai kutatási eredmény lényegét kevéssé érti, mégis sokan megsejtették, hogy ezek az eredmények a közeli jövőben jelentősen megváltoztatják majd életünket. Némileg hasonló a helyzet az orvostudományban is: egyre többen vannak azok, akik várakozással tekintenek az új genetikai információkra és a kibontakozó technológiai fejlődésre, bár egyelőre nincs közvetlen tapasztalatuk a változások várható dinamikájával kapcsolatban. Ez az írás egyrészt a reálisan hozzáférhető molekuláris diagnosztikai lehetőségeket villantja fel a teljesség igénye nélkül, másrészt igyekszik néhány példával illusztrálni azt a paradigmaváltást, amely a genetikai kérdésfeltevésből kiindulva elkerülhetetlenül átalakítja az orvosi ténykedés teljes spektrumát, a diagnosztikától egészen a terápiáig.

 

Kétségkívül a Humán Genom Projekt az orvosbiológiai vonatkozású kutatások eddigi leggrandiózusabb vállalkozása, de a projektből kibontható információk széles körű alkalmazására még várni kell. A gének működésének precíz megértése gyakran sokkal komplikáltabb, mint eredetileg várták. A multiplex etiológiájú betegségekre (például szív- és érrendszeri betegségekre) hajlamosító minor genetikai tényezők pontos listája és e tényezők eredő hatásai sem ismertek egyelőre. Másfelől azokat a módszereket, amelyekkel ezek a genetikai tényezők nagy számban (több mint 5000-10000 paraméter egyszerre), rutinszerűen, gyorsan és olcsón vizsgálhatók, még a fejlesztőlaboratóriumok ajtaja rejti el előlünk. (Ez még akkor is igaz, ha például a sokat emlegetett DNS-csiptechnológia is látványos fejlődésen ment keresztül az utóbbi 2-3 évben és mellesleg olcsóbbá is vált.) A változások dinamikáját tehát nehéz megjósolni, de várhatóan 3-5 év múlva most még meglepőnek számító összetett kérdésekre kaphatunk majd választ.

Mi is az a molekuláris diagnosztika?

Mielőtt elmerülünk néhány részletben, érdemes meghatározni vagy talán minél pontosabban körülírni, mit szoktak általában a molekuláris diagnosztika gyűjtőkörébe sorolni. A molekuláris diagnosztika mindenképpen egy nukleinsavak manipulációjával összekapcsolódó fogalom. Első megközelítésben dezoxiribonukleinsav- (DNS-), másrészt ribonukleinsav- (RNS-) preparátumok előállítására irányul, majd ezek speciális tulajdonságait igyekszik felderíteni érzékeny molekuláris biológiai eljárások segítségével. A molekuláris diagnosztika tehát sajátos eszköz és megközelítési mód, amely az egyes tudományos diszciplínák, például a molekuláris patológia vagy az orvosi mikrobiológia területén felmerülő kérdések megválaszolására alkalmazható. A molekuláris patológia területén a molekuláris diagnosztika eszközeivel a genetikai elváltozásokat a klinikai fenotípussal összekapcsoló mechanizmusokra igyekszünk fényt deríteni. Manapság a molekuláris mikrobiológia esetében rendkívül kis mennyiségű kórokozó gyors és specifikus kimutatása a leggyakoribb cél.

A mikrobiológiai diagnosztikába a molekuláris biológiai módszerek azokon a pontokon csatlakoznak be, ahol a klasszikus tenyésztési, biokémiai és szerológiai módszerek nem eléggé érzékenyek, lassúak, kicsi a specifikusságuk vagy az új terápiás megközelítések támogatására már nem alkalmasak. A tenyésztési problémák kiküszöbölésére terjedtek el a szexuális úton terjedő betegségek diagnosztikájában a Chlamydia trachomatis és a Neisseria gonorrhoeae PCR-vizsgálatok. A Chlamydia trachomatis-átfertőzöttség jelentős a szexuálisan aktív, felnőttkorú populációban. A PCR-diagnosztika bevezetése, a módszer szenzitivitása és robosztussága tette lehetővé a populációszintű Chlamydia trachomatis-szűrési programok sikeres megvalósítását az egyes országokban, például Kanadában. A Mycobacterium tuberculosis esetében a molekuláris biológiai módszerrel rendkívül gyorsan, akár néhány napon belül nyerhető válasz biztosítja a gyors terápiás döntés lehetőségét. A humán papillomavírus időbeni molekuláris diagnosztikai kimutatásával a potenciálisan cervixrákká fejlődő folyamat terelhető pozitív irányba. A molekuláris diagnosztika az egyéb klinikai adatokkal kombinálva ebben az esetben a megelőző sebészi beavatkozást indokolja vagy teszi feleslegessé. A legkorszerűbbnek számító és az elmúlt két évben Magyarországon is látványosan terjedő valós idejű (real-time) fluoreszcens PCR-rendszerek segítségével sürgős esetben a mikrobiológiai mintavételtől számított 3-5 órán belül adható megbízható laboratóriumi eredmény.

Éppen az érzékenység és a megfelelő specifikusság kombinációja miatt vált nemzetközileg elfogadottá a vérkészítmények előállításához használt donorvér hepatitis B, C és HIV-vírus vizsgálatainál a PCR-alapú módszerek alkalmazása. Sajnos, a szerológiailag (még) negatív donorok között akut vírusfertőzött személyek is lehetnek, ilyen esetben kizárólag a molekuláris biológiai módszerrel végzett víruskimutatással zárható ki a fertőzés potenciális átvitele. Ezek a módszerek alkalmasak az automatizálásra, szimultán nagyszámú minta vizsgálatára (2-3 óra alatt egyszerre akár 100 minta vizsgálható), így nagy tömegű szűrés céljára is jól felhasználhatók. Hazánkban egyelőre azonban csak szerológiai módszerekkel szűrik a donorvért, és a molekuláris biológiai szűrőmódszerek rutinszerű bevezetése még várat magára.

Az individuális terápia lehetősége

A molekuláris biológiai módszerek előretörése miatt a mikrobiológiai diagnosztikai kérdésfeltevésben is gyors váltás várható. Egyes kórokozók terápia iránti érzékenysége, az antibiotikum-rezisztencia molekuláris biológiai módszerekkel is vizsgálhatók. Ennek egyik legmeggyőzőbb példája a HIV-terápia korszerű megközelítéséhez kapcsolódik. A HIV-vírus genomját egy reverz transzkriptáz enzim reprodukálja a vírus szaporodása során. Minden egyes replikáció során több mutáció is képződik, a mutációk következtében a vírussal szemben korábban hatékonynak bizonyult gyógyszerek elveszítik hatásukat. Az új megközelítésben egy rendkívül érzékeny „nested” PCR-reakciót követően először fluoreszcens DNS-szekvenálással pontosan meghatározzák a vírusgenom terápiás szempontból legfontosabb 2 génjének, a HIV-proteáz és a reverz transzkriptáz gének szekvenciáját1. Ezt a szekvenciát összehasonlítják egy HIV-adatbázisban tárolt adatokkal. Az adatbázisban a genetikai variánsok adatai összevethetők a különböző variánsok esetében leghatékonyabbnak bizonyult gyógyszer-kombinációkkal is. E komplex összehasonlító elemzőmunka végeredményeként a betegben található HIV-vírust leghatékonyabban pusztító gyógyszer-kombináció állítható össze. Az individuális terápia még tovább finomítható: ha a beteg, illetve a szervezetében található HIV-vírus rezisztenssé válik az alkalmazott gyógyszerekre, egy újabb genotipizálást követően váltani lehet az újabb, leghatékonyabb gyógyszer-kombinációra.

A molekuláris biológiai módszerrel nyert információ segítségével számos súlyos fertőző betegség kezelését lehet célzottá, valóban individuálissá tenni olyan esetekben is, ahol a klasszikus tenyésztési stb. módszerek egyáltalán nem adnak választ a klinikus legfontosabb kérdéseire. A mikrobiológiai diagnosztikában a genotípus-fenotípus összefüggések vizsgálata közül a fertőző betegségekre hajlamosító genetikai tényezők vizsgálatai is nagy érdeklődésre tarthatnak számot. Svéd kutatók anyakönyvi regiszterek, valamint a múlt századig visszanyúló svéd rákregiszter és az országos családfaregiszter analízise alapján azonosítottak egy svéd családokban előforduló genetikai hajlamot, amely a perzisztáló humán papillomavírus-fertőzésre, illetve a cervixrák kialakulására hajlamosít2.

Az OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man)3 adatbázisában már megközelítőleg 8000, emberi betegségekben szerepet játszó génszekvencia variánsait gyűjtötték össze. E variánsok hatása gyakran ismeretlen és túlnyomó többségük egyelőre a polimorfizmus jelzővel vár további funkcionális vizsgálatokra. A monogénes betegségekhez kapcsolódó azonosított mutációk száma is gyors iramban bővül. Gyakran a molekuláris diagnosztikában rutinszerűen alkalmazott módszerek kapacitása szab határt a szimultán vizsgálható paramétereknek. Diagnosztikai szempontból rendkívül fontos a vizsgálni kívánt fehérjék, illetve gének esetében az adott populációra különösen jellemző alapító (founder) mutációk vizsgálata. Az alapító mutációk problémája a több gyakori mutációt hordozó gének esetében kiemelt jelentőségű, hiszen az adott betegséghez kapcsolódó mutációs spektrum legalább 95%-os felderítése az optimális esetben elérendő cél. Hazánkban például a BRCA1 gén leggyakoribb magyarországi mutációs változatait a kutatások eredményeként alaposan ismerjük4. Más gének esetében, például a cisztikus fibrózis gén (CFTR) teljes magyar mutációs spektrumának feltérképezése még folyamatban van.

A molekuláris diagnosztika alkalmazása az onkohematológiai betegségek esetében is fontos segítséget nyújthat a terápia hatékonyságának monitorozásához. A legújabb diagnosztikai irányelv alapján a betegek tumorsejtjeiben meghatározzák a betegség kialakulásában központi szerepet játszó kromoszómaelváltozásokat (például azonosítják a kromoszómatranszlokáció pontos molekuláris szerkezetét). Ezeket az információkat a későbbiekben felhasználva kvantitatív valós idejű fluoreszcens PCR-rendszerben vizsgálható a leukémiás sejtek mennyisége a betegektől nyert mintákban. Az egész eljárás célja, hogy a minimális reziduális betegség a korábban alkalmazott módszereknél sokkal érzékenyebben és precízebben monitorozható a molekuláris diagnosztika módszereinek felhasználásával. E rendszer bevezetése rendkívüli körültekintést és felkészültséget kíván a laboratóriumtól, így Európában egy nemzetközi konzorcium keretében 11 ország több független laboratóriuma dolgozik közösen a módszerek standardizálásán, az egységes értékelés alapelveinek lefektetésén5.

A tumorgenetikával foglalkozó kutatók számára az egyik legfontosabb célkitűzés, hogy megkeressék az adott tumor különböző formáival, biológiai viselkedésével kapcsolatba hozható géneket és jellemezzék e génkészlet aktivitását. E génkészlet aktivitása nemcsak a tumor klinikai megjelenési formáit határozza majd meg, hanem a terápiára adott választ is befolyásolja. Az adott tumor viselkedésének megértéséhez akár egyszerre 10000 gén aktivitását kell megvizsgálni, és e feladathoz nyújtanak segítséget a gyakran emlegetett DNS-csipek. A DNS-csip (microarray) felületén sűrűn elhelyezett (rövid) DNS-szálak képesek az aktív génekről átíródó mRNS-molekulák megkötésére, így az aktív gének azonosítására. A 10000 gén vizsgálatával nyert genetikai profil rendkívül egyedi, jellemző az adott tumorra és összekapcsolható a tumorok agresszivitására, terápia iránti érzékenységére vonatkozó klinikai adatokkal. Ezeknek az összefüggéseknek a tisztázása segít majd az indokolt esetekben az agresszív kemoterápia vagy radioterápia alkalmazásában, másrészt az indokolatlan esetekben csökkenti a súlyos mellékhatások veszélyét. Ilyen jellegű vizsgálatokat eddig elsősorban emlőtumorok6 és limfómák esetében végeztek. Ezek az eredmények rendkívül ígéretesek, de a módszer rutinszerű alkalmazásához olcsóbb technológiára és számos klinikai tanulmányra van még szükség.

Fejlődési lehetőségek

A molekuláris diagnosztika még számos tekintetben manufakturális jellegű jegyeket visel magán. Bár egyre több gyárilag összeállított, validált teszt áll rendelkezésre, gyári rendszerek hiányában a laboratóriumok saját vizsgálati rendszereket fejlesztenek ki. Akár gyári rendszerek alkalmazásáról van szó, akár saját vagy irodalmi rendszerek bevezetéséről, a manufakturális jelleg miatt a külső minőségbiztosítási programokban (körvizsgálatokban) való részvétel különösen fontos a laboratórium teljesítményének megítélése szempontjából. Az automatizálás egyre több paraméterre fog kiterjedni, de a hihetetlen technológiai heterogenitás miatt a saját fejlesztésű molekuláris biológiai vizsgálatokat még hosszú időn keresztül megtaláljuk majd a laboratóriumok palettáján. A fejlődésnek már ebben a fázisában is különösen fontos a módszerek alkalmazására vonatkozó szakmai irányelvek, diagnosztikai algoritmusok rendszeres összeállítása és a nemzetközi tendenciáknak megfelelő frissítése.

A molekuláris diagnosztika honi perspektíváit rendkívül pozitívan befolyásolják a kutatási projektekhez kapcsolódó technológiai fejlesztések, a legkorszerűbb műszerek beszerzésének lehetősége. De hosszú távú esélyeinket tekintve nem ez a perdöntő, hiszen a technológiai fejlődés idejétmúlt lépcsőit viszonylag egyszerű átugrani. A legdöntőbb kérdéssé a molekuláris diagnosztikai képzés meghonosítása vált, mert a fejlett országokban a molekuláris diagnosztika határterületeit hosszú évek óta önálló diszciplínaként oktatják a tudomány- és orvosegyetemeken. Hazánkban a megfelelő programok már beindultak az orvosegyetemi PhD-képzésben, de a graduális képzésben halaszthatatlan az önálló tárgyként történő bevezetés (ahol ez még várat magára), másrészt a posztgraduális képzésben az önálló rezidens programok beindítása. Ehhez kell kapcsolódnia egy korszerű genetikai tanácsadó képzésnek, amely különösen a komplex betegségek (például tumorok) genetikai hátterének szakértőit biztosítja az egészségügyi ellátórendszer számára. Ezek a képzett szakemberek elégíthetik majd ki a közvélemény genetikával kapcsolatos várakozását és interpretálhatják az egyre bonyolultabb diagnosztikai eredményeket.

Jegyzetek

  1. Elbeik T et al. Reproducibility of Drug Resistance Genotype in Research Studies of Patient Samples with Low virla load, 5th Int. Congress on Drug Therapy in HIV Infection, Glasgow, United Kingdom, Oct 22-26, 2000
  2. Int J Cancer 2000 Dec 1;88(5):698-701, Heritability of cervical tumours. Magnusson PK, Lichtenstein P, Gyllensten UB.
  3. www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/omim
  4. Van der Looy, Szabó C, Besznyak I, Liszka G, Csokay B, Pulay T, et al. Prevalence of founder BRCA1 and BRCA2 mutations among breast and ovarian cancer patients in Hungary. Int J Cancer 2000;86(5):737-40.
  5. RQ PCR for early diagnosis of relapse risk in leukemia – Europe Against Cancer Program
  6. van’t Veer LJ et al. Gene expresion profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature 2002; 415:530-36.