EREDETI KÖZLEMÉNYEK
A hepatitis G- és TT-vírus diagnosztikájának bevezetése Magyarországon
Takács Mária, Rusvai Erzsébet, Brojnás Judit, Tóth Gábor, N. Szomor Katalin, Tóth Etelka, Szendrői Andrea, Mezey Ilona, Berencsi György
 
 
 
 

dr. Takács Mária, dr. Rusvai Erzsébet, Brojnás Judit, N. Szomor Katalin, Tóth Etelka, Szendrői Andrea, dr. Mezey Ilona, dr. Berencsi György: Johan Béla Országos Epidemiológiai Központ, Virológiai Főosztály; 1097 Budapest, Gyáli út 2-6.
dr. Tóth Gábor: Eötvös Loránd Tudományegyetem, Genetikai Tanszék, Budapest.

LAM 2001;11 (4): 274-282.

Érkezett: 2001. február 8.
Elfogadva: 2001. április 11.



ÖSSZEFOGLALÁS

BEVEZETÉS - A vírushepatitisek döntő többségét öt hepatitisvírus okozza (A, B, C, D, E). 1995-ben három új flavivírust fedeztek fel (GBV-A, GBV-B, GBV-C/HGV), 1997-ben pedig a TT-vírust. Az irodalmi adatok alapján feltételezhető, hogy az ismeretlen eredetű hepatitises megbetegedések egy részének hátterében az újonnan felfedezett hepatitis G- és TT-vírus áll. A kutatás fő célja annak megállapítása volt, hogy ez a két vírus előfordul-e Magyarországon.

BETEGEK ÉS MÓDSZEREK - A hepatitis G-vírus RNS-ének kimutatásához az ismeretlen eredetű hepatitisben szenvedő betegek savójából vírus-RNS-t izoláltunk, majd ebből a szakirodalomban leírt primerekkel reverz transzkripció után PCR-terméket amplifikáltunk. A TT-vírus (TTV) DNS-ének kimutatásához seminested PCR-t alkalmaztunk. Meghatároztuk a PCR-termékek szekvenciáját. A hepatitis G-vírus elleni ellenanyagot ELISA-módszerrel mutattuk ki.

EREDMÉNYEK - A vizsgált 408 egészséges, 60 év feletti személy vére közül 113-ban találtuk meg a hepatitis G-vírus (HGV) elleni ellenanyagot. 51, ismeretlen eredetű hepatitisben szenvedő beteg savója közül 20 esetben mutattunk ki aHGV-ellenanyagot és négy esetben HGV-RNS-t. A megvizsgált 213 beteg savójából 26 esetben tudtuk kimutatni a HGV-RNS-t. A betegek többsége politranszfundált, hepatitisben, illetve aplasticus anaemiában szenved. Nyolc betegből származó vírus-RNS esetén a nukleotidsorrendet is meghatároztuk. Mindegyik szekvencia kismértékben különbözött. 154, ismeretlen eredetű hepatitisben szenvedő beteg savóját teszteltük TTV-DNS jelenlétére. 72 savót találtunk pozitívnak. Hét PCR-terméknek határoztuk meg a nukleotidsorrendjét. Kimutattuk, hogy Magyarországon a 2-es genotípus a leggyakoribb.

KÖVETKEZTETÉSEK - A kapott eredmények azt mutatják, hogy mind a hepatitis G-vírus, mind a TT-vírus kimutatható Magyarországon, egyik sem tekinthető ritka vírusnak. További vizsgálatokat kell végezni annak tisztázására, hogy a vírusok mely genotípusai állnak kapcsolatban a hepatitises megbetegedésekkel.

hepatitis G-vírus, TT-vírus, májgyulladás, polimeráz láncreakció, nukleotidsorrend-vizsgálat


Számos vírusról tudjuk, hogy hepatitist okoz, mégis mindmáig találkozunk olyan fertőző hepatitises megbetegedésekkel, amelyek nem hozhatók kapcsolatba a rutinszerűen vizsgált vírusokkal. Az ilyen megbetegedések egy részének hátterében valószínűleg az újonnan felfedezett hepatitis G-vírus (HGV) és TT-vírus (TTV) áll. Ezeknek a vírusoknak a vizsgálata az utóbbi években az egész világon elterjedtté vált. Magyarországi előfordulásukról azonban csak igen kevés adattal rendelkezünk. Célunk az volt, hogy megvizsgáljuk a fenti két vírus magyarországi előfordulását, meghatározzuk a Magyarországon előforduló vírusok jellegzetességeit, és az eredményeket összehasonlítsuk a nemzetközi szakirodalomban leírt adatokkal.
 

Irodalmi háttér

A máj vírus okozta gyulladása, a vírushepatitis a legrégebben ismert megbetegedések közé tartozik. A hepatitis A-vírus (HAV) a picornavírusok közé tartozik; egyszálú RNS-vírus, többnyire enteralisan terjed, kizárólag akut megbetegedést okoz. A hepatitis B-vírus (HBV) a Hepadna víruscsalád tagja; DNS-vírus, parenteralisan (leggyakrabban szexuális érintkezéssel, vérrel, vérkészítményekkel és vertikális úton) terjed. Tünetmentes vírushordozás és krónikus megbetegedés is gyakran bekövetkezik. A hepatitis D-vírus (HDV, régebben delta-ágens) defektív vírus. Valamennyi gazdaélőlényben csak a hepatitis B-vírus jelenlétében képes szaporodni. Genomja cirkuláris RNS. Mindazokat a vírushepatitiseket, amelyeknek etiológiája tisztázatlan volt, korábban non A-non B-hepatitisnek nevezték. A non A-non B-hepatitisek létezése majdnem három évtizede ismert (1).

Az elmúlt évtizedben jelentősen bővültek ismereteink a hepatitisvírusokról és az általuk okozott megbetegedésekről. A differenciálás lehetőségét a molekuláris klónozás, majd a rekombináns technológia felhasználásával kidolgozott szerológiai vizsgálatok teremtették meg. Így fedezték fel a nem tenyészthető hepatitis C-vírust (HCV) (2), és bebizonyították, hogy a parenteralisan terjedő non A-non B-hepatitisek nagy részéért ez a vírus felelős (3, 4). A hepatitis C-vírus a flavivírusok közé tartozik. Pozitív polaritású, egyszálú RNS-vírus, váladékokkal és parenteralisan terjed. A fertőzött egyének 40-60%-ánál krónikus megbetegedést okoz (5). A hepatitis C (HCV) felfedezésével sem sikerült azonban egyértelműen tisztázni valamennyi inokulációs vírushepatitis okát (6).

A hepatitis A-vírustól különböző, enteralis úton terjedő, hepatitist okozó vírus létezésére jóval felfedezése előtt egyértelmű bizonyíték volt (7). A hepatitis E-vírust (HEV) 1989-ben fedezték fel molekuláris módszerekkel (8, 9). Az enteralisan terjedő vírus leginkább a calicivírusokra hasonlít. Genomja pozitív polaritású, egyszálú RNS.

A GB-vírusok felfedezésének története a hatvanas évekre nyúlik vissza, bár magukat a vírusokat csak napjainkban sikerült azonosítani. Egy akut non A-non B-hepatitisben szenvedő sebész (nevének kezdőbetűi: G. B.) vérével fertőztek újvilági, szélesorrú majmokat (tamarinokat), ami akut hepatitist idézett elő náluk, míg az ugyanezzel a vérrel beoltott csimpánzok nem betegedtek meg (10). Később bebizonyították, hogy a GB-ágens nem azonos a hepatitis C-vírussal, mert az a csimpánzokat megbetegíti, viszont a tamarinokat nem. Két különböző vírust izoláltak, ezeket GBV-A-nak és GBV-B-nek nevezték el. Az új vírusok flavivírus természetét 1995-ben publikálták (11).

További, polimeráz láncreakcióval (PCR) végzett vizsgálatokkal egy szerkezetileg hasonló vírust sikerült felfedezni, a GBV-C-vírust. A GBV-C-t egy nyugat-afrikai betegből azonosították (11). A GBV-C-RNS-t kimutatták már számos, klinikai tünet alapján hepatitisesnek tartott betegnél, valamint a hepatitis szempontjából fokozott rizikójú csoportokban (hemofíliások, intravénás kábítószert használók, politranszfundáltak). Ez a vírus nagyon hasonlónak bizonyult az 1995-ben klónozott hepatitis G-vírushoz (HGV) (12). A hepatitis G-vírust Linnen és munkatársai (12) két betegből mutatták ki: egyikük tisztázatlan eredetű hepatitisben szenvedett, a másik betegnél a hepatitis G-vírus mellett a hepatitis C-vírus jelenlétét is kimutatták. Igazolták, hogy a GBV-C és a HGV között nagy a hasonlóság, nukleotidszinten 86%, aminosavszinten 95%. Ma a GBV-C-t és a HGV-t ugyanazon vírus két variánsának tartják (13), míg a GBV-A és a GBV-B a természetes gazdafajok, a célsejtek, és a szekvencia különbözősége alapján különálló vírusok. A két utóbbi (GBV-A és GBV-B) vírusról bebizonyosodott, hogy nem humánpatogének.
 

 
 
1. ábra. A hepatitis G-vírus genomja. Az 5' végen leolvasatlan régió található, ezt egy feltételezett poliprotein követi, majd a 3' végen szintén leolvasatlan régió helyezkedik el. Az egyes fehérjék kódolóhelyeit az ábrán bejelöltük 
nt: nukleotid 
NTR: nem transzeálódó (leolvasatlan) régió
 

A hepatitis G-vírus is pozitív szálú RNS-t tartalmaz, és génszerkezete hasonlít a többi flavivírushoz (1. ábra). A HCV-hez hasonlóan a hepatitis G-vírus genomja is az 5' végén egy 458 nukleotid hosszúságú, fehérjét nem kódoló leolvasatlan régiót tartalmaz, amelyet egy hosszú leolvasási keret követ. A genom 3' végén is egy 315 nukleotid hosszúságú, leolvasatlan régió található. A feltételezett poliprotein a következő fehérjéket tartalmazza: E1- és E2-burokfehérjék a genom 5' végén, majd ezeket követik a nem szerkezeti (non-structural) proteinek (NS2, NS3, NS4, NS5). Igen érdekes, hogy a hepatitis G-vírus genomja nem tartalmaz olyan teljes mag- (core-) gént, amely a nukleokapszidot kódolná (14). Mivel a hepatitis G-vírus aminosav-szekvenciájának változékonysága kicsi, a hepatitis G-vírust típusok és altípusok helyett csoportokba és alcsoportokba sorolják (15). Négy csoport (1, 2, 3, 4), továbbá a kettes csoporton belül két alcsoport (2a és 2b) létezik: Az 1-es alcsoportba tartozó vírust Nyugat-Afrikában mutatták ki, a 2-est Észak-Afrikában, Európában és Indiában, a 3-ast Ázsiában. A 4-es csoportba tartozó vírus egy kínai betegből származik (13, 15).

Jelenleg nem ismert olyan szerológiai eljárás, amellyel az akut HGV-fertőzést ki lehetne mutatni. Az E2-proteinre alapozott ELISA-eljárás a hepatitis G-vírus-ellenanyagot csak későn, egyes esetekben fél évvel a fertőzés után mutatja ki. Így a friss fertőzések igazolására csak az RT-PCR (reverz transzkripciót követő polimeráz láncreakció) jöhet szóba. Az NS-régiókra több primerpárt terveztek (16, 17). Érdekes, hogy egyes vizsgálatok szerint majdnem minden, anti-E2-t tartalmazó szérumnál negatív eredményt kaptak hepatitis G-vírus-RNS-re (13). Ez azt jelenti, hogy az anti-E2 megjelenése összefügg a hepatitis G-vírus termelődésének megszűnésével. Az anti-E2 jelenléte azt mutatja, hogy a beteg találkozott a hepatitis G-vírussal.

Sok országban leírták a hepatitis G-vírus-RNS előfordulását a véradók körében. Magas az előfordulási arány Thaiföldön (4,3%), Vietnamban (5,7%), Németországban (4,7%), Dél-Afrikában (14,2%), de alacsony Japánban (0,6-0,9%), Kínában (0,7-2,0%) és az Egyesült Államokban (0,8-1,7%) (12, 18-24). A nagy kockázatú csoportokban a hepatitis G-vírus RNS-ének előfordulása igen gyakori: intravénás kábítószert élvezők esetében 4-38%, fizetett véradóknál 5-26%, hemodializált egyéneknél 3-10%, hemofíliás betegek körében 14-38%. Magyarországon vesetranszplantált és dializált betegek 3-17%-ánál mutatták ki a hepatitis G-vírus RNS-ét (25). A szakirodalmi adatok szerint poszttranszfúziós akut hepatitisben szenvedők 19-40%-ánál mutatták ki a hepatitis G-vírus RNS-ét, míg a sporadikus esetekben csak 0-9%-ban. A rendelkezésre álló adatok szerint a hepatitis G-vírus valószínűleg nem okoz hepatocellularis carcinomát (26, 27); kapcsolatba hozzák viszont az aplasticus anaemia kialakulásával. Olyan elmélet is ismert, hogy csak az egyik alcsoportba tartozó vírus áll kapcsolatban az aplasticus anaemiával (28, 29).
 

 
2. ábra. A TT-vírus genomja. Az egyszálú TTV-DNS két lehetséges leolvasási keretet kódol (ORF1 és ORF2)
 

Japánban 1997-ben egy ismeretlen eredetű poszttranszfúziós hepatitisben szenvedő beteg szérumából DNS-vírust mutattak ki (30, 31). A beteg nevének kezdőbetűi (T. T.) alapján a vírust TT-vírusnak nevezték el; genomját a 2. ábra szemlélteti. A TT-vírus egyszálú, cirkuláris DNS-vírus, a genom hoszsza a genotípustól függ. Az 1-es genotípus 3853 nukleotidból áll. A TT-vírus DNS-e 1,2 kilobázis (kb) nem kódoló és 2,6 kb kódoló régióból áll. Két, részben átfedő, nyitott leolvasási kerettel rendelkezik (ORF1 és ORF2). Az ORF1 valószínűleg a kapszidfehérjét kódolja. Az aminosav-szekvencia N-terminális részén mintegy 100 aminosavat tartalmazó hidrofil szakasz található, amely nagyon gazdag argininben. Hasonló szekvenciák fordulnak elő a hepatitis B-vírus mag- (core-) proteinjének C-terminális végén és a hepatitis C-vírus core-proteinjének N-terminális részén (31). Az ORF2 szerepét a prototípus törzs esetében vizsgálták. Azt találták, hogy nem az első, hanem a második ATG-kodonnál kezdődik az átírás. Az ORF2 valószínűleg egy nem szerkezeti (non-struktural) proteint kódol, ami a vírusreplikáció során válik szükségessé (32). Bár kezdetben a TT-vírust a parvovírusokhoz sorolták, kiderült, hogy a TT-vírus a circovírusokra hasonlít. Változékony, eddig már legalább 16 genotípusát azonosították szerte a világon, Európában, Észak-Amerikában, Ázsiában, Afrikában és Óceániában (33-38). A genotípusok közötti szekvenciakülönbség elérheti a 30%-ot is. A nem kódoló régió konzervatív, míg a fehérjét kódoló szakaszok nagyon változékonyak. A TT-vírusnak nincsen burka (31). A vírusfertőzés után nagyon rövid ideig mutatható ki a vírusspecifikus IgM, viszont az IgG egyes esetekben négy évig is kimutatható (32). Bebizonyosodott, hogy nemcsak parenteralisan, hanem ente-ralisan is terjed (39). Felmerült az a gyanú, hogy sok esetben nem a TT-vírus az oka a hepatitises megbetegedésnek (35, 40). Az 1-es genotípusról viszont kiderült, hogy több esetben poszttranszfúziós hepatitist okozott. Egyes betegeknél a szervezet eliminálta a vírust, másoknál hosszú éveken át ki tudták mutatni a vírus-DNS-t a szervezetben (32).
 

Betegek és módszerek

Betegek

A vizsgálatokhoz olyan betegek savóit választottuk, akiknek a kórelőzményében májbetegségre utaló adatok szerepeltek, és a beteg kapott már transzfúziót. 213 olyan beteg savóját választottuk ki, akiknél a májbetegség eredetét nem tudták tisztázni: vérükben sem a hepatitis B-vírust, sem a hepatitis C-vírust nem tudták kimutatni. A betegek átlagéletkora 42 év volt.

A vizsgálatokhoz 479, epidemiológiai szűrésben részt vett egyén savóját használtuk fel. Közülük a vérvétel időpontjában 408 személy 60 éven felüli, 71 személy 60 éven aluli volt.
 

Szerológiai vizsgálatok

A vizsgálatra beküldött vérsavó mennyiségétől függően a következő vírusszerológiai vizsgálatokat végeztük el a kereskedelemben kapható reagensek segítségével: anti-HGV (R&D Systems anti-GBV-C), anti-HBc (Organon Teknika Hepanostika HBsAg UNI-FORM II és Hepanostika anti-HBc UNI-FORM), anti-HAV-IgG és -IgM (Organon Teknika Hepanostika HAV antibody és Hepanostika HAV-IgM), anti-HCV (Pasteur Sanofi Monolisa anti-HCV PLUS), anti-HEV-IgG és -IgM (Biokit Bioelisa HEV-IgG és Bioelisa HEV-IgM).
 

RNS- és DNS-tisztítás vérsavóból, PCR céljára

160 µl savóhoz 395 µl lizálóoldatot (25 mM EDTA, 0,2 M Tris-HCl pH: 7,5, 0,3 M NaCl, 2% SDS) és 4 µl, 20 mg/ml proteináz K-t adtunk, összekevertük, és 60 percre 37 °C-ra tettük. Ezután 395 µl fenolt (amelyet előzőleg 1 M Tris-HCl pH=8 oldattal kiráztunk), és 160 µliter kloroformot adtunk hozzá. Alaposan összekevertük, majd 15 percig +4 °C-on Eppendorf-centrifugában centrifugáltuk. A felülúszót leszívtuk, és azonos térfogatú izopropanolt tettünk hozzá. Egy éjszakán keresztül, -20 °C-on tartott az RNS-kicsapás. Eppendorf-centrifugában 15 percig +4 °C-on centrifu-gáltuk, 70%-os etanollal mostuk, majd újból centrifugáltuk a csapadékot. Az RNS-t és DNS-t száradás után 8 µl bidesztillált vízben oldottuk fel (41).
 

A cDNS-szintézis

A reverz transzkripciós elegy össztérfogata 20 µl volt. A reakcióelegyet a következőképpen állítottuk össze: 2 µl 10-szer koncentrált Perkin-Elmer PCR-puffer (100 mM Tris-HCl pH=8,3, 500 mM KCl), 3 µl bidesztillált víz, 8 µl dNTP (10 mM), 1 µl moloney murine leukemia virus reverz transzkriptáz (50 U/µl), 1 µl RN-áz inhibitor (20 U/µl), 2 µl MgCl2 (25 mM/µl), 1 µl random hexamer (0,5 µM/µl), 2 µliter RNS. Ásványi olajjal lefedve, 15 percig, 42 °C-on történt a reverz transzkripció, majd a mintát 5 percre 99 °C-ra melegítettük.
 

Polimeráz láncreakció

A HGV, a TTV és a HCV kimutatásához polimeráz láncreakciót (PCR) alkalmaztunk. Az irodalomban közölt primereket használtuk (17, 35, 42) (1. táblázat). A primereket az Integrated DNA Technologies Inc. (USA) szintetizálta.
 

1. táblázat. A vizsgálatokhoz felhasznált primerek szekvenciái 
 

Az első PCR-elegy össztérfogata 50 µl volt, amely 0,2 mM dNTP-t, 1 egység Taq polimerázt, és mindkét primerből 20 pmol-t tartalmazott. A cDNS-oldat felét (10 µl) használtuk fel a PCR-hez. A PCR-t minden esetben háromperces, 94-96 °C-on végzett denaturálással kezdtük, és az utolsó ciklus után még 7 percig 72 °C-on tartottuk.

A második PCR-hez az 1. PCR termékéből 1 µl-t használtunk fel. Az egyik primer 5' végére biotint szintetizáltattunk. A másik primer 5' végéhez az "Universal primer" 15 nukleotidját szintetizáltattuk, így minden régió PCR-termékének szekvenciameghatározása lehetővé vált egy fluoreszceinnel jelölt primerrel. A PCR-hez 5 pM primert használtunk fel. 5 µl terméket agarózgélen ellenőriztünk.
 

A nukleotidsorrend vizsgálata

A második PCR termékét streptavidinnel fedett mágneses gyönggyel (Dynal, AB, Norvégia) tisztítottuk, majd meghatároztuk a biotinnal jelölt szál szekvenciáját fluoreszcensen jelölt M13 Universal primer segítségével. A reakciót AutoRead DNA Sequencing kit (Pharmacia Biotech, Svédország) felhasználásával végeztük el. A reakciótermékeket A.L.F. automata DNS-szekvencia-meghatározó készüléken (Pharmacia Biotech, Svédország), poliakrilamid gélen szeparáltuk. A futtatásnál kapott eredményeket az A.L.F. 2.5 verziója segítségével értékeltük ki.

A kapott szekvenciák illesztéséhez a Clustal W programot használtuk (43), a szekvenciák közötti genetikai távolságok számításán alapuló filogenetikai analízishez pedig a PHYLIP programcsomag 3.572c verzióját (44). A filogenetikai fa megbízhatóságának becslésére a nukleotidszekvencia-pozíciók véletlenszerű ismétléses mintavételét és ezt követő faszerkesztést 1000-es ismétlésben alkalmazó bootstrap analízist végeztünk
 

Eredmények

Az aHGV-ellenanyagok meghatározása a népességben

Főosztályunk részt vett az országos szeroepidemiológiai szűrésben. Az ország minden részéről érkezett savókban megvizsgáltuk az anti-HGV-ellenanyagok jelenlétét. A kapott eredményeket a 2. táblázatban foglaltuk össze. Mivel a vizsgált 408, 60 év feletti lakos közül 113 bizonyult pozitívnak, megállapíthatjuk, hogy Magyarországon az idősebb lakosság jelentős része találkozott már a hepatitis G-vírussal. Egyetlen megyében fiatalabb egyéneket is vizsgáltunk, a vártnak megfelelően az aHGV-ellenanyagok előfordulását alacsonyabbnak találtuk: mindössze egyetlen 30 évesnél fiatalabb személy vére tartalmazott aHGV-ellenanyagot.
 

2. táblázat. Az anti-HGV-ellenanyag előfordulása egészséges népességben 
 
Az aHGV-ellenanyag és a HGV-RNS jelenlétének vizsgálata

51, ismeretlen eredetű hepatitisben szenvedő betegnél határoztuk meg az aHGV-ellenanyagot és a HGV-RNS-t. Az eredményeket a 3. táblázatban mutatjuk be.
 

3. táblázat. Az anti-HGV-ellenanyag és HGV-RNS előfordulásának összehasonlítása ismeretlen eredetű hepatitises betegek körében 
 

Az 51 beteg közül 20-nál mutattunk ki aHGV-ellenanyagot. Meg kell jegyezni, hogy legalább fél év kell ahhoz, hogy a savó kimutatható mennyiségű ellenanyagot tartalmazzon, ezért ez a módszer akut betegség diagnózisára nem alkalmas. A 20 savó egyike sem tartalmazott HGV-RNS-t.

HGV-RNS-t négy beteg savójából tudtunk kimutatni, ezek mindegyike aHGV-ellenanyag-negatívnak bizonyult. Így nem találtunk olyan beteget, akinek a savójából mind aHGV-ellenanyagot, mind HGV-RNS-t ki tudtunk volna mutatni. Ezek az eredmények összhangban állnak az irodalomban megjelent közlésekkel (13).
 

A HGV-RNS kimutatása, a nukleotidsorrend meghatározása

Összesen 213 savóban vizsgáltuk meg a HGV-RNS jelenlétét (4. táblázat). A 202, ismeretlen eredetű hepatitisben szenvedő beteg közül 24 esetében mutattuk ki a HGV-RNS-t. Sajnos csak három aplasticus anaemiás beteg savóját tudtuk vizsgálni, ezek közül egy bizonyult pozitívnak.
 

4. táblázat. A HGV RNS-ének előfordulása betegeknél 
 
3. ábra. A hepatitis G PCR-nél kapott nukleotidsorrendjeinek részlete Az ábrán G1-G8 jelöléssel szerepelnek az általunk vizsgált betegekbôl kimutatott vírusnukleotid-szekvenciák. Felettük összehasonlítás céljából a szakirodalomban közölt nyolc hepatitis G-szekvencia megfelelô részét tüntettük fel, a nemzetközi nukleotidszekvencia-adatbázisbeli (GenBank/EMBL) azonosítójukkal együtt. A csillaggal jelölt pozíciókban mind a tizenhat szekvencia azonos nukleotidokat tartalmaz.
 

Nyolc PCR-termék szekvenciáját határoztuk meg. Az így kapott eredmények a 3. ábrán láthatók. A felső nyolc szekvencia az irodalomból származik (12, 17), az alsó nyolc pedig (G1-G8) a betegekből kimutatott vírusok szekvenciájának egy részlete. Mindegyik szekvencia kismértékben különbözik egymástól és az irodalomban közölt szekvenciáktól.
 

A TTV-DNS kimutatása

154, ismeretlen eredetű hepatitisben szenvedő beteg savóját vizsgáltuk meg TTV-DNS jelenlétére. 72 esetben kaptunk pozitív eredményt. Hét PCR-terméknek határoztuk meg a nukleotidszekvenciáját, ebből három kevert szekvenciával rendelkezett. A szekvenciák jelentős különbséget mutattak, egymással és az irodalomban közöltekkel összehasonlítva egyaránt. A jól leolvasható négy szekvencia esetén az irodalomban közölt (45) genotípusok (1-16) alapján filogenetikai fát állítottunk fel (4. ábra). Megállapítottuk, hogy mind a négy betegből (T1-T4) kapott szekvencia a 2-es genotípushoz áll a legközelebb. A bootstrap analízis alapján a 2-es genotípushoz való tartozás valószínűsége 100%. A kevert szekvenciákat klónozni fogjuk.
 

 
4. ábra. A vizsgált TT-vírusok filogenetikai fája. A filogenetikai kapcsolatokat feltüntetô fán számokkal jelöltük az irodalomban (45) közölt 16-féle genotípust. T1-T4 jelöléssel az általunk meghatározott TTV-DNS-szekvenciák láthatók. A szekvenciák közötti genetikai távolságot a PHYLIP programcsomag (44) segítségével, Kimura kétparaméteres módszere alapján becsültük. Két szekvencia közötti genetikai távolság az őket összekötő vonalak vízszintes részeinek együttes hosszúságából olvasható le, a 0,1 genetikai távolságértéket (10% eltérést) reprezentáló szakasz figyelembevételével. Látható, hogy a T1-T4 szekvenciák a 2-es genotípushoz állnak legközelebb
 

Következtetések

Eredményeinket az 5. ábrán összegeztük. Megállapítottuk, hogy Magyarországon a 60 év feletti korosztály jelentős hányadában (28%) kimutatható a hepatitis G-vírus ellen termelődött specifikus ellenanyag. Ez azt jelenti, hogy a hepatitis-G nem ritka vírus, talán érdemes lenne vizsgálni előfordulását a vérkészítményekben is. Fiataloknál sokkal kisebb mértékben fordul elő, mint idősebbek körében; ez azzal magyarázható, hogy a hepatitis G-vírus vérrel, vérkészítményekkel és szexuális úton terjed.
 

 
5. ábra. A hepatitis G- és TT-vírusokkal kapcsolatos vizsgálatok összegzése
 

Az általánosan használt hepatitis G-vírus-primerek (17) alapján nested polimeráz láncreakció segítségével vizsgáltuk, hogy ismeretlen eredetű májgyulladásban szenvedő betegekben és néhány, aplasticus anaemiában szenvedő betegben előfordul-e a hepatitis G-vírus RNS-e. Az ismeretlen eredetű hepatitises betegek mintegy 12%-ánál mutattuk ki a hepatitis G-vírus RNS-ét. A szakirodalommal megegyezően azt tapasztaltuk, hogy a hepatitis G-vírus RNS-e és a vírus ellen termelődött ellenanyag egyetlen mintában sem mutatható ki egyszerre (46). A kapott PCR-termékeknek meghatároztuk a szekvenciáját. Az eddig kapott szekvenciák vizsgálata azt mutatta, hogy a hepatitis G-vírusok vizsgált szakaszán kismértékű szekvenciakülönbségek találhatók. Az azonosság és eltérés a törzsfakészítéssel számszerűsíthető. A törzsfakészítéshez az újabb adatok szerint hepatitis G-vírus esetében legalább 2000 bázispárnyi szekvenciával kell rendelkezni a vírus több különböző régiójából (47), különben félrevezető eredményeket kaphatunk. A jelenlegi vizsgálatokkal csak 400 bázispárnyi PCR-termék áll rendelkezésre, ami nem elegendő a törzsfakészítéshez. Ahhoz, hogy megállapítsuk, milyen genotípusú hepatitis G-vírus fordul elő Magyarországon, további vizsgálatok szükségesek.

Sajnos TT-vírusra specifikus ellenanyag-vizsgálatokat hozzáférhető reagenskészlet hiánya miatt nem tudtunk végezni. A szakirodalomban található szekvenciák és az általánosan használt TT-vírus-primerek (35) alapján polimeráz láncreakcióval vizsgáltuk, hogy ismeretlen eredetű hepatitisben szenvedő betegekben megtalálható-e a TT-vírus DNS-e. A kapott PCR-termékeket nukleotidsorrend-vizsgálattal azonosítottuk. A vizsgált betegek csaknem felénél (47%) mutattuk ki a TT-vírus DNS-ét. A terjedés módja szerepet játszhat abban, hogy a TT-vírus genomja az ismeretlen eredetű hepatitisben szenvedő betegek véréből nagyobb százalékban mutatható ki, mint a hepatitis G-vírus: a TT-vírus nemcsak parenteralisan terjed, hanem bizonyított az enteralis terjedés is. A TT-vírusok heterogenitását (a vizsgált szakaszon) az irodalmi adatoknak megfelelően nagymértékűnek találtuk (32, 35). Ismert, hogy egy betegben több, különböző szekvenciájú vírus is perzisztálhat (32, 45). Hét vizsgált beteg közül háromnál mi is kevert szekvenciát mutattunk ki. Ebben az esetben a PCR-termék szekvenciájának meghatározásával nem kapunk értékelhető eredményt. Ilyenkor a PCR-termék plazmidba történő klónozása és inzert szekvenciájának meghatározása szükséges. A törzsfakészítéshez TT-vírus esetében már viszonylag rövid szekvencia (220-300 bázispár) elég (45). A PCR-rel kapott szekvenciák elemzésekor kimutattuk, hogy a 2-es genotípus fordul elő leggyakrabban Magyarországon.

A hepatitis G-vírus és a TT-vírus etiológiai szerepe egyelőre egyetlen kórkép esetében sem bizonyított. Abban, hogy okoznak-e valamilyen betegséget, nagy valószínűséggel szerepet játszik a vírus genotípusa. Jelenleg egyik vizsgált vírus esetében sem ismeretes olyan primerpár, amely elkülönítené az egyes genotípusokat. Ezért jelenleg a széles körben alkalmazott PCR-technika önmagában, alkalmas primerpárok hiányában, genotípus meghatározására nem alkalmas. Ahhoz, hogy megállapítsuk, a tapasztalt megbetegedéseket milyen genotípusú TT-vírus, illetve hepatitis G-vírus okozta, és milyen genotípusok fordulnak elő Magyarországon, további nukleotidsorrend-vizsgálatok szükségesek.
 

Köszönetnyilvánítás

A kísérletek gondos kivitelezésében nyújtott segítségéért Kerékgyártó-Zalka Cecíliát és Körmendi Sándornét illeti köszönet. A munkát az Egészségügyi Minisztérium az ETT 138/2000, az OTKA a T034470 nyilvántartási számú kutatási szerződéssel támogatta. A nukleotidsorrendet az OTKA III. műszerközpontjában határozták meg. Dr. Takács Mária a Magyar Tudományos Akadémia Bolyai ösztöndíjasa.

Irodalom

  1. Dienstag JL. Non-A, Non-B hepatitis. I. recognition, epidemiology and clinical feature. Gastroenterology 1983;85:439-62.
  2. Choo QL, Kuo G, Weiner AJ, Overby LR, Bradley DW, Houghton M. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science 1989;244:359-62.
  3. Alter HJ, Purcell RH, Shih JW, Melpolder JC, Houghton M, Choo QL, et al. Detection of antibody to hepatitis C virus in prospectively followed transfusion recipients with acute and chronic non-A non-B hepatitis. N Eng J Med 1989;321:1494-500.
  4. Weiner AJ, Kuo G, Bradley DW, Bonino F, Saracco G, Lee CR, et al. Detection of hepatic C viral sequences in non-A, non-B hepatitis. Lancet 1990;335:1-3.
  5. Hammel P, Marcellin P, Martinot-Peignos M, Pham BN, Degott C, Level R, et al. Etiology of chronic hepatitis in France: predominant role of hepatitis C virus. J Hepatol 1994;21:612-23.
  6. Berencsi Gy, Takács M, Garamvölgyi E. A hepatitis C-vírus genetikai és biológiai tulajdonságai. Transzfúzió 1993;26:49-57.
  7. Balayan MS, Andjaparidze AG, Savinskaya SS, Ketiladze ES, Braginsky DM, Savinov AP, et al. Evidence for a virus in non-A, non-B hepatitis transmitted via fecal-oral route. Intervirology 1983;20:23-31.
  8. Reyes GR, Purdy MA, Kim JP, Luk KC, Young LM, Fry KE, et al. Isolation of a cDNA from the virus responsible for enterically transmitted non-A, non-B hepatitis. Science 1990;247:1335-9.
  9. Bradley DW. Enterically transmitted non-A, non-B hepatitis. Br Med Bull 1990;46:442-61.
  10. Deinhardt F, Holmes AW, Capps RW, Popper H. Studies on the transmission of human viral hepatitis to marmoset monkeys. J Exp Med 1967;125:673-87.
  11. Simons JN, Leary TP, Dawson GJ, Pilot-Matias TJ, Muerhoff AS, Schlauder GG, et al. Isolation of novel virus-like sequences with human hepatitis. Nature Medicine 1995;1:564-9.
  12. Linnen J, Wages J, Zhang-Keck ZY, Fry KE, Krawczynski KZ, Alter H, et al. Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus: a transfusion-transmissible agent. Science 1996;271:505-8.
  13. Kiyosawa K, Tanaka E. GB Virus/Hepatitis G Virus. Intervirology 1999;42:185-95.
  14. Simons JN, Desai SM, Shchutz DE, Lemon SM, Mushawar IK. Translation initiation in GB viruses A and C: Evidence for internal ribosome entry and implications for genome organisation. J Virol 1996;70:6126-35.
  15. Smith DB, Cuceanu N, Davidson F. Discrimination of hepatitis G virus/GBV-C geographical variants by analysis of the 5' non-coding region. J Gen Virol 1997;78:1533-42.
  16. Zhang XH, Shinzawa H, Shao L, Takahashi T. Detection of hepatitis G virus RNA in patients with hepatitis B, hepatitis C, and non-A-E hepatitis by RT-PCR using multiple primer sets. J Med Virol 1997;52:385-90.
  17. Khudyakov YE, Cong ME, Bonafonte MT, Abdulmalek S, Nichols BL, Lambert S, et al. Sequence variation within a non structural region of the hepatitis G virus genome. J of Virology 1997;71:6875-80.
  18. Rengsakulrach B, Ong-Aj-Yooth Thaiprasert T. High prevalence of hepatitis G viraemia among kidney transplant patients in Thailand. J Med Virol 1997;53:162-6.
  19. Brown KE, Wong S, Buu M, Binh TV, Be TV, Young NS. High prevalence of GB virus C/hepatitis G virus in healthy persons in Ho Chi Minh City, Vietnam. J Infect Dis 1997;175:450-3.
  20. Heringlake S, Osterkamp S, Trautwein C, Tillmann HL, Boeker K, Muerhoff S, et al. Association between hepatic failure and strain of GBV virus C. Lancet 1996;348:1626-9.
  21. Dawson GJ, Schlauder GG, Pilot-Matias TJ, Mushawar SM. Prevalence studies of GB virus C infection using reverse transcriptase chain reaction. J Med Virol 1996;50:97-103.
  22. Masuko K, Mitsui T, Iwano K, Yamazaki C, Okuda K, Meguro T, et al. Infection with hepatitis GB virus C in patients on maintenance hemodialysis. N Engl J Med 1996;334:1485-90.
  23. Kinoshita T, Miyake K, Nakao H, Tanaka T, Tsuda F, Okamoto H, et al. Molecular investigation of GB virus C infection in haemophiliacs in Japan. J Infect Dis 1997;175:454-7.
  24. Tanaka E, Tacke M, Kobayashi M, Nakatsuji Y, Kiyosawa K, Schmolke S, et al. Past and present hepatitis G virus infection in areas where hepatitis C is highly endemic and those where it is not endemic. J Clin Microbiol 1998;36:110-4.
  25. Szabó A, Uwe H, Müller V, Reusz Gy, Sallay P, Viazov S, et al. Hepatitis G-vírus-infekció vesetranszplantált és dializált gyermek- és felnőtt betegekben. Orvosi Hetilap 1999;140:1619-23.
  26. Kanda T, Yokosuka O, Imazeki F, Tagawa M, Ehata T, Saisho H, et al. GB virus-C RNA in Japanese patients with hepatocellular carcinoma and cirrhosis. J Hepatol 1997;27:464-9.
  27. Brechot C, Jaffedo F, Lagorce D, Gerken G, Meyer Zum Buschenfelde K, Papakonstontinou A, et al. Impact of HBV, HCV and GBV-C/HGV on hepatocellular carcinomas in Europe: Results of a European concerted action. J Hepatol 1998;29:173-83.
  28. Brown KE, Tisdale J, Barrett AJ, Dunbar CE, Young NS. Hepatitis-associated aplastic anemia. N Eng J Med 1997;336:1059-64.
  29. Crespo J, De Las Heras B, Rivero M, Lozano JL, Fabrega E, Pons-Romero F. Hepatitis G virus infection as a possible causative agent of community-acquired hepatitis and associated aplastic anaemia. Postgrad Med J 1999;75:159-60.
  30. Nishizawa T, Okamoto H, Konishi K, Yoshizawa H, Miyakawa Y, Mayumi M. A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Biochem Biophys Res Commun 1997;241:92-7.
  31. Okamoto H, Nishizawa T, Kato N, Ukita M, Ikeda H, Iizuka H, et al. Molecular cloning and characterization of a novel DNA virus (TTV) associated with posttranfusion hepatitis of unknown etiology. Hepatol Res 1998;10:1-16.
  32. Okamoto H, Nishizawa T, Ukita M. A novel unenveloped DNA virus (TT virus) associated with acute and chronic non-A to G hepatitis. Intervirology 1999;42:196-204.
  33. Charlton M, Adjei P, Poterucha J, Zein N, Moore B, Therneau T. TT-virus infection in North America blood donors, patients with fulminant hepatic failure, and cryptogenic cirrhosis. Hepatology 1998;28:839-42.
  34. Simmonds P, Davidson F, Lycett C, Prescott LE, Macdonald DM, Ellender, et al. Detection of a novel DNA virus (TTV) in blood donors and blood products. Lancet 1998;352:191.
  35. Naumov NV, Petrova EP, Thomas MG, Williams R. Presence of a newly described human DNA virus (TTV) in patients with liver disease. Lancet 1998;352:195-7.
  36. Prescott LE, Simmonds P, et al. Global distribution of transfusion-transmitted virus (letter). N Eng J Med 1998;339:776-7.
  37. Tanaka H, Okamoto H, Luengrojanakul P, Chainuvati T, Tsuda F, Tanaka T. Infection with an unenveloped DNA virus (TTV) associated with posttransfusion non-A to G hepatitis in hepatitis patients and healthy blood donors in Thailand. J Med Virol 1998;56:234-8.
  38. Tanaka H, Mizokami M, Orito E, Nakano T, Kato T, Ding X. A new genotype of TT virus (TTV) infection among Colombian native Indians. J Med Virol 1999;57:264-8.
  39. Okamoto H, Akahane Y, Ukita M, Fukuda M, Tsuda F, Miyakawa Y. Fecal excretion of a non enveloped DNA virus (TTV) associated with posttransfusion non-A-G hepatitis. J Med Virol 1998;56:128-32.
  40. Sugiyama K, Goto K, Ando T, Mizutani F, Terabe K, Kawabe Y. Prevalence of ttv dna among children with a history of transfusion or liver disease. J Med Virol 2000;60:172-6.
  41. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, USA. 1989.
  42. Falus A, Hajnal A. Detection of hepatitis C virus (HCV) by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Acta Microbiol Immunol Hung 1995;42:235-6.
  43. Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research 1994;22:4673-80.
  44. Felsenstein J. PHYLIP - Phylogeny Inference Package (Version 3.2). Cladistics 1989;5:164-6.
  45. Okamoto H, Takahashi M, Nishizawa T, Ukita M,  Fukuda M, Tsuda F, et al. Marked genomic heterogeneity and frequent mixed infection of TT virus demonstrated by PCR primers from coding and non-coding regions. Virology 1999;259:428-36.
  46. Nordbo SA, Krokstad S, Winge P, Skejeldestad FE, Dalen AB. Prevalence of GB virus C (also called hepatitis G virus) markers in Norwegian blood donors. J Clin Microbiol 2000;38:2584-90.
  47. Cong ME, Fried MW, Lambert S, Lopareva EN, Zhan M, Pujol FH. Sequence heterogeneity within three regions of the hepatitis G virus genome. Virology 1999;255:250-9.


Introduction of Hepatitis G and TT virus diagnostics is Hungary

Introduction - The majority of the viral hepatitis is caused by five hepatitis viruses (A, B, C, D, E). In 1995, three new flaviviruses were discovered, the GBV-A, GBV-B and GBV-C (also known as HGV) viruses. The TT virus was discovered in 1997. Based on literature data, it is now supposed that a part of the unknown hepatitis cases is caused by the recently discovered hepatitis G or TT virus. The aim of this study was to determine the occurrence of hepatitis G and TT viruses in Hungary.

Patients and methods - To reveal the RNA of the HGV viruses in the sera of patients suffering from hepatitis of unknown origin, RT-PCR was applied using the primers published in the literature. Seminested PCR was used to detect the DNA of TTV. The nucleotide sequences of nested PCR products were determined. Anti-HGV antibodies were detected by ELISA.

Results - The sera of 408 healthy persons older than 60 years were tested for the presence of hepatitis G virus antibodies: 113 tested positive. HGV virus antibodies were found in the sera of patients suffering from hepatitis of unknown origin or aplastic anaemia. 51 sera were tested and 20 were found to be positive for GBV-C antibodies, 4 for HGV RNA. Altogether, 213 sera of patients suffering from hepatitis of unknown origin or from aplastic anaemia were tested for HGV RNA and 26 were found to be positive. Eight PCR products were sequenced, and these sequences were found to be different from each other. 154 sera of patients with hepatitis of unknown origin were tested for the presence of TTV-DNA and 72 of them were positive. Seven PCR products were directly sequenced. Genotype 2 was found to be the most frequent one in Hungary.

Conclusion - Our results show that both HGV and TTV are present in Hungary and none of them can be considered rare. Further studies are needed to reveal the association between the genotypes of these viruses and hepatitis of unknown origin.

Correspondence: Mária Takács, dr. Johan Béla National Center for Epidemiology, Division for Virology
H-1097 Budapest, Gyáli út 2-6.

hepatitis G virus, TT virus, hepatitis, polymerase chain reaction, sequencing