Magy Immunol/Hun Immunol 2004;3(3):12-77.

ABSZTRAKTOK

 

 

 



1. Az Ly77-(GL7-) molekula szerkezeti és funkcionális vizsgálata az scFv-konstrukció segítségével (P15)
Ádori Mónika, Balogh Andrea, Prechl József, László Glória
Eötvös Loránd Tudományegyetem, Immunológiai Tanszék, Budapest
 
Az Ly77 (GL7) a nyugvó, naiv egér T- és B-lymphocytáin az in vitro aktivációt követően 36–48 órával megjelenő, sejtfelszíni glikoproteid. In vivo jelenléte kimutatható a csontvelőben a pre- és éretlen B-sejteken, a thymusban egyes T-sejt-populációkon és a germinalis centrumokban. A molekulát lymphoid és myeloid eredetű sejteken egyaránt 35 kDa molekulatömegűnek találtuk. Az ellenanyagunk által felismert epitóp egy neuraminidázérzékeny szénhidrátoldalláncnak bizonyult.
Az epitóp expressziós mintázata és szénhidráttermészete alapján feltételezzük annak adhéziós szerepét. Konfokális lézerszkenning mikroszkópia segítségével vizsgálva a molekula elhelyezkedését a membránban, azt B-lymphocyta eredetű myelomasejteken a raftokkal asszociálva találtuk. Ugyanezeken a sejteken az ellenanyag kötődése önmagában nem vezetett sem Ca2+-felszabaduláshoz, sem a foszforilációs mintázat megváltozásához.
A molekula kimutatására az expressziós és szerkezeti vizsgálatokban használt ellenanyag egy monoklonális patkány-IgM; ennek fragmentálását nem tudtuk kielégítő hatásfokkal megoldani, ezért – amint arról már korábban beszámol- tunk – az ellenanyagot termelő hibridklónból preparált mRNS felhasználásával scFv-konstrukciót állítottunk elő. A bakteriális rendszerben történő termeltetés során azonban csak igen kis mennyiségű fehérjét tudtunk nyerni. A probléma megoldását keresve a szekvencia analízise során a nehézlánc területén pontmutációra bukkantunk, ezt mutagenezissel javítottuk ki. A tanulságos technikai nehézségek kiküszöbölése után sikerült a konstrukciót megfelelő mennyiségben termeltetni és tisztítani. A funkcionális vizsgálatok alapján a konstrukció megfelelő affinitással és specificitással kötődik a GL7-molekulát expresszáló sejtekhez, és kötődése gátolható az eredeti ellenanyaggal.
Az scFv-konstrukció segítségével tervezett, folyamatban lévő kísérleteink a molekula különböző eredetű sejteken egyes jellegzetes markerekkel való kolokalizációjának, valamint jelátvitelben való részvételének kiderítésére, valamint a feltételezett adhéziós szerep in vivo vizsgálatára irányulnak.
 


Structural and functional study on Ly77 (GL7) by an scFv construction
Ly77 (GL7) is a cell surface antigen originally described on mouse T- and B-lymphocytes after 36–48 hours in vitro activation. Its presence was detected on pre- and immature B-cells in the bone marrow, on certain thymocytes, and in the germinal centers. The molecule was found to be a 35 kDa glycoproteid on both lymphoid and myeloid cells. The epitop recognized by our antibody turned out to be a neuraminidase sensitive sugar side chain. The expressional pattern and the carbohydrate nature of the molecule suggested its possible role in the adhesion.
Using confocal laser-scanning microscope we demonstated that GL7 is raft-associated in the membrane of B-lymphocyte-derived myeloma cells. The binding of the antibody onto the cell surface did not affect either the Ca2+ influx or the phosphorylation pattern of cells.
The antibody, used for the analysis of the expression and the structure of GL7 is a rat monoclonal IgM that we were unable to successfully make the Fab fragments of. For this reason we created scFv construct of the antibody using mRNA prepared from the antibody-producing hybridoma cells but only low amounts of protein was produced in the bacterial system. Sequence analysis showed a point mutation in the heavy chain. This point mutation was corrected by directed mutagenesis. This corrected scFv construct was found to bind to GL7 expressing cells with the appropriate specificity and affinity and this binding could be blocked by the original IgM.
With our ongoing studies by the scFv construct we are in looking at co-localization of GL7 with some characteristic markers on various cell lines. Also, the possible role of GL7 in signal transduction and in cell adhesion is under investigation.



2. FcgRIIb-specifikus, egyláncú ellenanyagmolekula-konstrukció készítése, jellemzése és alkalmazása szisztémás autoimmun betegségek in vitro modelljében
(P59)
Angyal Adrienn, Medgyesi Dávid, Prechl József, Sármay Gabriella
Eötvös Loránd Tudományegyetem, Immunológiai Tanszék, Budapest
 
Az ellenanyagválasz negatív szabályozásában fontos szerepet játszik az érett B-sejteken konstitutívan jelen lévő II. típusú Fcg-receptor (FcgRIIb): a késői immunválasz során a B-sejt-receptorok és a gátló típusú FcgRIIb-immunkomplexek általi keresztkötése a sejtaktiváció gátlásához, az ellenanyag-termelés leállításához vezet.
Autoimmun folyamatok során a szervezet saját struktúrái ellen alakul ki immunválasz; az autoantigént felismerő B-lymphocyták klonális expanziója következtében a szervezetben nagy mennyiségben jelennek meg autoreaktív ellenanyagot tartalmazó immunkomplexek, ezek lerakódása krónikus gyulladáshoz vezet.
Munkánk során előállítottunk egy, a szolúbilis rekombináns FcgRIIb1-et specifikusan felismerő, egyláncú ellenanyag-molekulát (8/12 scFv), majd áramlási citofluorimetriás mérésekkel, valamint ELISA-módszerrel vizsgáltuk annak kötődési sajátságait. Az FcgRIIb1-gyel transzfektált B-sejteken a 8/12 scFv felismerte mind a szolúbilis, rekombináns FcgRIIb1-et, mind a sejtfelszínen megjelenő receptort. A funkcionális tesztek során a BCR és az FcgRIIb-nek a 8/12 scFv által mediált keresztkötése módosította a B-lymphocyták intracelluláris Ca2+-válaszát, az egyláncú ellenanyag-molekula ki tudta váltani az Fcg-receptor-közvetítette gátlást.
Modellrendszerként a könnyűlánc-specifikus monoklonális ellenanyag és a 8/12 scFv konjugátuma segítségével vizsgáltuk a létrehozott komplex hatását a humán B-sejtek in vitro ellenanyag-termelésére. A 8/12 egyláncú ellenanyagot és a modell-autoantigént különböző arányban összekapcsolva, meghatároztuk a gátláshoz szükséges optimális sztöchiometriai viszonyokat. Az FcgRIIb1-specifikus egyláncú ellenanyag és az autoantigén bispecifikus konstrukciója alkalmas lehet az autoreaktív ellenanyag-termelés in vivo gátlására.
 


Characterization of an FcgRIIb1 specific single chain antibody (scFv) and its application in in vitro models of systemic autoimmun diseases
Type II Fcg receptors (FcgRIIb) play an important role in the negative regulation of the antibody response. In the late phase of an immune response crosslinking of the B-cell receptors (BCR) and the FcgRIIb via IgG contaning immune complexes results in the inhibition of cell activation and antibody production.
In case of systemic autoimmune diseases an immuneresponse is induced against self-structures, which is followed by the clonal expansion of the autoreactive B-lymphocytes, leading to the production of autoreactive antibodies forming immune complexes with the autoantigen. Deposition of immune complexes results in chronic inflammation.
We produced an scFv molecule that specifically recognizes the soluble recombinant FcgRIIb receptor. Thereafter we examined its binding characteristics via cytofluorimetry and enzyme linked immunoassay. The scFv molecule recognized the soluble recombinant FcgRIIb as well as its membrane bound form on ST486 cells transfected with FcgRIIb1. The functional assays showed that the 8/12 scFv is able to modify the intracellular Ca2+ response of B-cells upon crosslinking BCR and the FcgRIIb1.
As a model for the autoantigen we applied a k chain specific monoclonal antibody and conjugated with the 8/12 scFv. We examined the effect of the conjugates on human B-cells. We defined the optimal stochiometric ratio necessary for the inhibition. Bispecific conjugates containing FcgRIIb specific scFv and autoantigen may be applied to inhibit autoantibody production in vivo.
 


3. A CD14, TLR2 és TLR4 expressziójának és funkciójának változásai az SLE-ben szenvedő betegek monocytáin, és ezek összefüggése a fertőzéses komplikációk gyakoriságával (P60)

Antal-Szalmás Péter1, Sümegi Andrea1, Szöllősi Ibolya2, Tar Tünde2, ifj. Sipka Sándor2, Kiss Emese2, Szegedi Gyula2
Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum, 1Klinikai Biokémiai és Molekuláris Patológiai Intézet, 2III. Sz. Belgyógyászati Klinika
 
A monocyták, macrophagok felszínén lévő CD14/TLR komplex (TLR: Toll-like receptor) jelentős szerepet játszik a természetes immunrendszer működésében. A CD14 mint mintafelismerő receptor a legkülönbözőbb kórokozók jellegzetes molekuláit képes felismerni, és a bakteriális fertőzések esetében elsősorban a TLR4- és TLR2-molekulák közvetítésével aktiválja ezeket a fagocitáló sejteket. Vizsgálataink során – kvantitatív áramlási citometria segítségével – e molekulák sejtfelszíni expresszióját tanulmányoztuk, gyakori infekciós szövődményekkel jellemezhető (F, n=21), illetve fertőzésmentes (NF, n=13) szisztémás lupus erythematosusban (SLE) szenvedő betegek perifériás monocytáin és granulocytáin. A CD14 által mediált LPS-kötést jelzett endotoxin, míg a sejtek CD14-függő és -független phagocytaaktivitását fluoreszcensen jelzett baktérium és áramlási citometria segítségével teszteltük. Az izolált monocyták által LPS-stimuláció hatására szekretált TNF-a mennyiségét ELISA segítségével mértük. A monocyták felszínén szignifikánsan csökkent CD14- expressziót (F: 86 800±13 100; NF: 100 500±27 700) és TLR4-expressziót (F: 320±120; NF: 500±140) észleltünk a gyakori fertőzésekkel jellemezhető betegeken; ehhez csökkent LPS-kötés társult, de a phagocytaaktivitás és az LPS által indukált TNF-a-szekréció a két betegcsoport között nem tért el. Még jelentősebbnek találtuk a CD14- és TLR4-expresszió csökkenését a fertőzés nélküli betegcsoporthoz képest, ha csak a súlyos infekciós szövődményekkel (pneumonia, endocarditis, n=10) jellemezhető betegek adatait vettük figyelembe (CD14: 83 200±16 800; TLR4: 90±120). Vizsgálataink eredményei azt jelzik, hogy összefüggés állhat fenn a CD14/TLR4 sejtfelszíni receptorkomplex expressziójának csökkenése és a súlyos fertőzéses szövődmények kialakulása között SLE-ben szenvedő betegeken, ennek megerősítése azonban még további vizsgálatokat igényel.
 


lterations in the expression and function of surface-expressed CD14, TLR4 and TLR2 of SLE monocytes and association of these parameters with infections
The CD14/TLR (Toll-like receptor) complex on the surface of monocytes/macrophages plays an important role in the activity of the innate immune system. CD14 as a pattern recognition receptor is able to recognize variable characteristic molecules of several pathogens and in the case of bacterial infections activates these phagocytes mainly via TLR4 and TLR2. In our present work by using quantitative flow cytometry we studied the surface expression of these molecules on monocytes and neutrophils of systemic lupus erythematosus patients characterized by no (NI, n=13) or frequent (I, n=21) infectious complications. The CD14-mediated LPS binding was tested by FITC-labeled endotoxin, while the CD14-dependent and -independent phagocytic activity of these cells was determined by fluorescently-labeled bacteria and flow cytometry. The amount of TNF-a secreted by isolated monocytes upon LPS-stimulation was determined by an ELISA. In the case of patients with frequent infections the CD14-expression (I: 86 800±13 100; NI: 100 500± 27 700) and the TLR4-expression (I: 320±120; NI: 500±140) on monocytes was significantly decreased, which was associated with decreased LPS-binding, while the phagocytic activity and the LPS-induced TNF-a secretion was not different in the two patient groups. This decrease in monocyte CD14- and TLR4-expression compared to the no infection patient group was even more pronounced if only the data of patients with very severe infectious complications (pneumonia/endocarditis, n=10) was taken into count (CD14: 83 200±16 800; TLR4: 290±120). Our results provide evidence for a possible relationship between the decreased surface expression of the CD14/TLR4 complex and the development of severe infectious complications in SLE patients, but more data are needed to prove this hypothesis.

4. Dendritikus sejtek CR3 által közvetített produktív HIV-1-fertőzése (E19)

Bajtay Zsuzsa1, Erdei Anna2, Dierich P. Manfred1
1Department of Hygiene and Social Medicine, Innsbruck Medical University and Ludwig-Boltzman-Institute for AIDS Research, Innsbruck, Austria; 2Eötvös Loránd Tudományegyetem, Természettudományi Kar, Immunológiai Tanszék-MTA, Kutatócsoport, Budapest
 
Ismert, hogy a komplementfragmentumokkal fedett mikroorganizmusok a különböző sejtek felszínén jelen lévő komplementreceptorokhoz (CR) kötődnek. A CR3 és CR4 fontos szerepet játszik a C3-fragmentumokkal fedett partikulumok opszonikus fagocitózisában. Tudott, hogy a T- és B-sejtek, a monocyták és a macrophagok HIV-1-fertőzése nagymértékben fokozódik a vírus komplementfragmentumokkal történő opszonizációja következtében. A primer HIV-fertőzés során elsődleges célsejtek a macrophagok és a dendritikus sejtek (DC). Munkánk során a dendritikus sejtek opszonizált HIV-1-gyel végbemenő fertőzését tanulmányoztuk.
A perifériás vérből izolált CD14+ monocyták in vitro GM-CSF és IL-4 jelenlétében monocyta eredetű éretlen dendritikus sejtekké (imMDC) differenciálódnak. Kísérleteinkben a 92UG037 monotropikus HIV-1 primer izolátumot opszonizáltuk anti-HIV IgG és normális humán szérum jelenlétében; ennek következtében intenzív C3-fragmentum-lerakódást mutattunk ki a vírus felszínén. A kontrollmintákat EDTA jelenlétében – gátolt komplementaktiváció – anti-HIV IgG-vel, vagy médiumban inkubáltuk. A vírus kötődését és fertőzőképességét a p24 nukleokapszid-fehérje – ELISA-módszerrel végzett – meghatározásával jellemeztük.
Kimutattuk, hogy az anti-HIV IgG-vel és komplementtel opszonizált HIV-1 mintegy tízszeresére növelte a monocyta eredetű éretlen dendritikus sejtek produktív infekcióját, az EDTA jelenlétében opszonizált, illetve médiumban inkubált vírushoz képest. A sejtek CR3-a-lánc ligandumkötőhely-specifikus monoklonális ellenanyaggal (TMG6-5) végzett kezelése megakadályozta a produktív fertőzés fokozását, a folyamatban a CR3 kitüntetett szerepére utalva. Mivel fiziológiás körülmények között a HIV komplementfragmentumokkal opszonizált, feltételezhető, hogy in vivo a HIV-fertőzés során hasonló mechanizmus játszik szerepet.
 


Productive HIV-1 infection of dendritic cells via complement receptor type 3
Microorganisms coated with C3-derived fragments acquire the capacity for high binding to C-receptors. Complement receptors CR3 and CR4 are expressed on several cell types, including dendritic cells (DC). The most important role of these receptors is the binding and phagocytosis of pathogens opsonized by C3-fragments. It has been shown that HIV-1 infection of human T- and B-lymphocytes, monocytes and macrophages is greatly enhanced by opsonization of the virus with complement. The main targets of HIV during primary infection are macrophages and DCs. Here we report that CR3 plays a crucial role in the productive infection of DCs by opsonized HIV.
CD14+ peripheral blood monocytes can develop to immature monocyte-derived DC (imMDCs) in vitro by culturing in GM-CSF and IL-4 containing medium. The M-tropic HIV-1 primary isolate 92UG037 (subtypeA/A, R5-tropism) was opsonized in the presence of anti-HIV IgG and normal human serum, resulting in a strong C3 deposition on the viral surface. Control samples were prepared in the presence EDTA (to inhibit complement activation), with anti-HIV IgG or medium only. The binding and infectivity of HIV-1 were estimated by p24 ELISA.
We demonstrated that HIV-1 opsonized by anti-HIV IgG and complement causes up to 10 fold higher productive infection of imMDC than HIV or HIV opsonized by antibody only. Enhanced infection was completely abolished by a monoclonal antibody specific for the ligand-binding site of CD11b, proving the importance of CR3 in this process. Inhibition of complement activation by EDTA also prevented enhanced infection, further demonstrating the role of complement in virus uptake and infection. Since HIV is physiologically opsonized by complement, most probably a similar mechanism plays a role during in vivo spreading of the virus.
 


5. A HSP70-2, a TNF-a és a CD14 gén polimorfizmusainak vizsgálata akut pancreatitisben (P24)

Balog Attila1, Gyulai Zsófia1, Takács Tamás2, Farkas Gyula3, Lonovics János2, Mándi Yvette1
Szegedi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, 1Orvosi Mikrobiológiai és Immunbiológiai Intézet, 2I. Sz. Belgyógyászati Klinika, 3Sebészeti Klinika
 
Célkitűzés: Az akut pancreatitis kialakulásában alapvető szerepet tulajdonítanak a proinflammatorikus citokineknek és a hősokkfehérjéknek (heat shock protein, HSP). Mivel a TNF-a és a HSP70 termelődése genetikailag szabályozott, feltételeztük, hogy a TNF és a HSP70 gének polimorfizmusai befolyásolhatják az akut pancreatitis iránti fogékonyságot, illetve a betegség lefolyását. Az LPS-receptor CD14 gén genetikai polimorfizmusát szintén vizsgáltuk.
Betegek és módszerek:
A különböző etiológiájú akut pancreatitises betegeket (n=77) a Ranson-score alapján a betegség súlyosságának megfelelően csoportosítottuk. A kontrollcsoportot 71 egészséges véradó képezte. A TNF-a-308-polimorfizmust NcoI, a HSP70-2-1267-polimorfizmust PstI RFLP-technikával, a CD14 159-es lokalizációjú promoter polimorfizmusát olvadáspont-analízissel, Light Cycler készülékben végeztük.
Eredmények:
A súlyos akut pancreatitises betegek között a TNF 1/2 genotípus gyakoribb (p=0,046) előfordulását tudtuk kimutatni, az enyhe lefolyású betegcsoporttal szemben. Még kifejezettebb különbséget figyeltünk meg a HSP70-2 G allél gyakoriságában az enyhe és súlyos pancreatitises betegcsoport között (18,9 vs. 53%; p<0,001). Ezzel szemben az A/A homozigóta genotípus jelentősen gyakrabban fordult elő az enyhe lefolyású betegcsoportban (p<0,0001). A CD14-polimorfizmussal kapcsolatban nem találtunk összefüggést a genotípus eloszlása és a betegség súlyossága között.
Következtetés:
A HSP70-2 G és a TNF-a-308 A allélok előfordulása növeli a súlyos klinikai képpel járó akut pancreatitis kockázatát. A genotípus meghatározása fontos prognosztikai marker lehet az akut pancreatitis lefolyásával kapcsolatban.
 


Polymorphic genes of HSP70-2, TNF-a, and CD14 in patients with acute pancreatitis
Aims:
Pro-inflammatory cytokines and heat shock proteins play fundamental roles in the pathogenesis of acute pancreatitis. Since TNF production and the expression of heat shock protein (HSP 70) in individuals has been shown to be genetically influenced, we hypothesized that the polymorphism of the TNF gene locus and of HSP 70 may influence disease susceptibility and course in acute pancreatitis. Moreover, the role of genetic polymorphism of the LPS receptor CD14 could be excluded.
Patients and methods:
Patients with acute pancreatitis (n=77) of mixed aetiology were grouped according to the severity of the disease on the basis of the Ranson scores. Healthy blood donors (n=71) served as controls. TNF-a-308 polymorphism was determined by NcoI RFLP, HSP70-2 polymorphism by PstI RFLP, and CD14-159 polymorphism by melting point analysis.
Results:
There was a moderate increase in the frequency of the TNF1/2 genotype (p=0.046) among patients with severe acute pancreatitis as compared with those with mild disease. A more significant increase was observed in the frequency of the HSP70-2 G allele between groups of patients with mild or severe pancreatitis (18.9% vs. 53%; p<0.001). Conversely, the A/A genotype was markedly more frequent among the patients with mild pancreatitis (p<0.0001). There was no significant correlation between CD14-159 promoter polymorphism and the severity of pancreatitis.
Conclusions:
High frequencies of the HSP70-2 G and the TNF-a-308 A alleles predict severe acute pancreatitis. Genotype assessments may be important prognostic tools to predict disease severity and the course of acute pancreatitis. Genotype assessments may also be used to guide treatment or to identify risk populations for severe pancreatitis.
 


6. A B-sejtek domináns szerepe az egér lép fibroblast-doménjeinek kialakulásában (E9)

Balogh Péter1, Andras K. Szakal2
1Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Immunológiai és Biotechnológiai Intézet; 2VCU MCV Department of Anatomy and Neurobiology, Richmond, VA, USA
 
A perifériás nyirokszövetek fejlődését a hemopoetikus és stromalis sejtkészlet prekurzorai között fellépő kapcsolódásrendszer irányítja, amiben az egyes mikrokompartmentek mesenchymalis alapvázát képező reticularis fibroblastok (RF) is részt vesznek. Munkánkban az egér lép fehér pulpa RF-alcsoportjainak képződéséről és az annak indukciójához szükséges lymphoid elemek azonosításáról számolunk be. A lép RF-alcsoportjaira specifikus antitestek közül az IBL-10 monoklonális antitest eltérő regionális intenzitással reagál a T- és B-sejtes zóna reticularis elemeivel. Az IBL-10hi alcsoportot elsősorban a T-sejt-zóna (PALS) és a folliculusok közötti határterületben mutattuk ki, míg az IBL-10lo RF-készlet egyenletes megoszlást mutatott a fehér pulpán belül. Az IBL-10hi alcsoport a születés utáni első két hét alatt jelent meg, és nem tudtuk kimutatni SCID egérben.
A fehér pulpa IBL-11 antitesttel azonosítható fibroblast-alcsoportja elsősorban a PALS területében és a folliculusnak a marginális zóna felé eső sávjában helyezkedik el. Az IBL-10lo-pozitív alcsoporthoz viszonyítva az IBL-11-pozitív RF sejtek később jelentek meg. Képződésük az antigénreceptort hordozó érett (T-, B-) lymphoid sejtek hatásától függetlennek bizonyult, megoszlásuk viszont SCID egérben eltért a normális nyirokszöveti szerkezettel rendelkező állatokétól. A lim- fotoxin-b-receptor (LTbR-Ig) fúziós fehérjével végzett postnatalis kezelés a normális RF-kompartmentalizációt teljesen gátolta. (B6xBALB/c) F1 egérből izolált érett lymphocyta-alcsoportok bejuttatásával a fehér pulpa reticularis fibroblastjainak részleges helyreállítását váltottuk ki SCID egérben. Ez arra utal, hogy a reticularis fibroblastok ezen előalakjai az érett T- és B-sejtekkel való kapcsolódás hatására a születés után is megtartják differenciációs képességüket. A két inducer sejtcsoport hatásának különbsége a B-sejtek elsődleges jelentőségére utal a lép fehér pulpa RF-morfogenezis szabályozásában, s ebben kitüntetett szerepet tölt be az LTb.
Az ETT 592/2003 által támogatva.


Dominant role of B-cells in the establishment of distinct fibroblastic domains in the mouse spleen
The development of peripheral lymphoid organs is guided by a series of cognate interactions between their hemopoietic and stromal constituents, including the reticular fibroblasts (RF) that form the mesenchymal scaffolding of various tissue compartments. Here we report the development and composition of various RF domains within the white pulp of murine spleen, and identify the lymphocyte pool required for their establishment during postnatal ontogeny. Of the rat monoclonal antibodies (mAbs) raised against splenic RF subsets, IBL-10 mAb displays a heterogeneous labeling pattern against the reticular elements of the T- and B-dependent regions. The IBL-10hi subset was found primarily at the border area between the PALS and follicles, while the IBL-10lo RF subset was evenly distributed throughout the white pulp. The IBL-10hi subset occurred during the first two postnatal weeks, and was absent in SCID mice. The RF subset identified with IBL-11 mAb was enriched in the PALS and the peripheral rim of follicles juxtaposed to the marginal zone. Compared to the appearance of IBL-10lo positive subset, the IBL-11 positive RF cells occurred at a later date. Their formation was independent from the presence of mature antigen receptor-bearing (T/B) lymphoid cells, although their distribution in SCID mice was different from that in normal mice. Administration of lymphotoxin b receptor (LTb-Ig) fusion protein into newborn animals induced the complete block of RF compartmentalisation. Upon the transfer of various lymphocyte subsets into SCID recipients a partial reconstruction of RF domains could be achieved. This indicates that in SCID mice the immature RF precursors retain their ability to compartmentalise upon their encounter with mature T- or B-cells. The differences between the effects of two inducer cell types indicate the predominance of B-cells in the regulation of splenic RF morphogenesis, in which the LTb appears to play a major role.
 


7. A perifériás NK-sejteken kifejeződő CD160 killer aktivációs receptor szerepe az immunválasz jellegének kialakításában (E3)

Barakonyi Alíz1, 3, Rabot Magali1, Bensussan Armand2, Szekeres-Barthó Júlia3, 4, Le Bouteiller Philippe1
1
INSERM U563, Centre de Physiopathologie Toulouse-Purpan, Toulouse, France; 2INSERM U448, Faculté de Médecine de Créteil, Párizs, Franciaország; 3Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Orvosi mikrobiológiai és Immunitástani Intézet, 4MTA, Reproduktív és Tumor-Immunológiai Kutatócsoport, Pécs

A CD160 egy glikofoszfatidil-inozitol-kapcsolt sejtfelszíni molekula; jelen van a humán CD56+dim/CD16+ természetes ölősejtek (natural killer, NK), a legtöbb gd-, keringő citotoxikus CD8+bright- és minden intestinalis intraepithelialis T-sejt felszínén. Ismert, hogy a CD160 felismer bizonyos HLA-I-csoportba tartozó molekulákat (HLA-A2, -B7, -E és -G), de a felismerés funkcionális következményei eddig tisztázatlanok maradtak. Korábbi eredményeink bizonyították, hogy az NK-sejteken jelen lévő CD160-receptor interakcióba lép a HLA-C-molekulával is, s ezt követően citotoxikus választ tud beindítani. Jelen munkánk során – humán NK-sejteket vizsgálva – azt kívántuk tisztázni, hogy a CD160-receptor működése szerepet játszik-e az NK-sejtek citokintermelésében; ha igen, milyen szabályozómechanizmusok kontrollálják azt.
Kísérleteink során egészséges donorok perifériás NK-sejtjein monoklonális antitest-stimuláció, illetve természetes HLA-C-ligand segítségével aktiváltuk a CD160-receptor működését, majd Cytometric Bead Array-módszerrel detektáltuk a citokintermelést. Eredményeink rávilágítottak, hogy az NK-sejtek CD160-aktivációja IL-6-, TNF-a- és igen erős IFN-g-termelődést vált ki; ez utóbbi harmincszorosa volt a pozitív kontrollként alkalmazott CD16-receptor stimulálása során mért értékeknek. Adataink azt mutatják, hogy a CD160-aktiváció nincs hatással a Th2-es csoportba tartozó citokinek termelődésére. A receptor citokinprodukciót befolyásoló funkciójának további vizsgálata során kimutattuk, hogy a CD158b NK-sejt-gátló receptor – ennek ligandja szintén a HLA-C – szerepet játszik annak szabályozó mechanizmusaiban.
Eredményeink alátámasztják, hogy a CD160-receptor működése – a citotoxikus képesség jelentős mértékű növelésén túl – az egyéb immunreakciókat is beindító citokintermelés révén is sokoldalúan segíti az immunológiai folyamatokat, aktívan hozzájárulva a fertőzések, illetve a daganatos állapotok során kialakuló immunválasz sikeres lefolyásához.



The role of CD160 killer activating receptor on NK-cells in developing the character of immunological response

CD160 (also known as BY55) is a glycosylphosphatidylinositol (GPI) -anchored-cell surface molecule which is present on human CD56+dim/CD16+ NK-cells, most TCR gd-expressing lymphocytes, a subset of citotoxic effector CD8bright+ circulating T lymphocytes and all intestinal intraepithelial T lymphocytes. It is also demonstrated, that CD160 could interact with both classical and nonclassical MHC class-I molecules (namely HLA-A2, HLA-B7, HLA-E and HLA-G), and recently we demonstrated that it also recognizes HLA-C. According our observations CD160 engagement by HLA-C molecules mediates citotoxic function. Here, we investigated whether CD160 NK-cell activating receptor could control cytokine production.
Our results show that upon specific activation by the physiological ligand HLA-C, or antibody cross-linking, CD160+ peripheral blood (PB) NK-cells produce IFN-g, TNF-a, and IL-6 without acting on Th2 like cytokine release. The unique effect of CD160-mediated cytokine production differs from the one observed after CD16 engagement whose expression is also restricted to the CD56 dim citotoxic NK-cell subset. As already reported for the CD160-mediated citotoxic effector function, we demonstrate that CD160-mediated cytokine production by PB-NK-cells is negatively controlled by the killer Ig-like NK-cell receptor CD158b.
Thus, CD160 receptor represents a unique triggering surface molecule expressed by citotoxic NK-cells which takes part in immunological responses during infection or malignancy and determines the type of the subsequent specific immunity.



8. Immunregulációs vizsgálatok – különös tekintettel a szuppresszoraktivitásra – Hodgkin-kóros betegeken
(P21)

Baráth Sándor, Aleksza Magdolna, Keresztes Katalin, ifj. Sipka Sándor, Szegedi Gyula, Illés Árpád
Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum, III. sz. Belgyógyászati Klinika
 
Ismert, hogy a Hodgkin-kór patomechanizmusában szerepet játszik az immunreguláció zavara. A tartósan komplett remisszióban lévő Hodgkin-kóros betegeknél vizsgáltuk a szuppresszoraktivitás mértékét (CD4+CD25+-, CD4+IFN-g+-, CD8+IFN-g-, CD4+IL-10+- és CD8+IL-10+-sejtek, valamint IL-4-, IL-10-, IFN-g-, TGF-b-citokin-szintek). Eredményeink szerint e betegek esetén szignifikáns mértékben emelkedett a CD4+CD25high szuppresszor T-sejtek abszolút száma és a szérum IL-10-szintje a kontrollcsoporthoz viszonyítva. Szintén emelkedett mértéket mutat a CD4+IL-10+ és CD8+IL-10+ T-sejtek száma. Ezek az eredmények együttesen kiterjedt szuppresszoraktivitásra utalnak, amely esetleg a Hodgkin-kór kialakulásában is szerepet játszhat.
 


Immunoregulatory investigations – with special regard to suppressor activity – in patients with Hodgkin’s disease
In the pathomechanism of Hodgkin’s disease the complex impairment of immune system can be one of the reasons. Some immunosuppressive parameters (CD4+CD25+, CD4+IFN-g+, CD8+IFN-g, CD4+IL-10+, CD8+IL-10+ cells and IL-4, IL-10, IFN-g, TGF-b cytokine levels) were investigated in patients with Hodgkin’s disease in long lasting complete remission. A domination of immunosuppression could be observed based upon the significant elevation in the absolute number of CD4+CD25high suppressor T-cells and serum IL-10 level in patients with Hodgkin’s disease. In addition, the number of CD4+IL-10+ and CD8+IL-10+ T-cells was also increased. All these factors can contribute to the increased immunosuppressive activity in Hodgkin’s lymphoma playing some role in the appearence of the disease.
 


9. Az ATRA és 4HPR retinoidok által kiváltott kaszpázfüggetlen DNS-fragmentáció és sejthalál humán B-lymphoma-sejtekben (E8)

Barna Gábor1, Sebestyén Anna1, Weischede Silke1, Peták István1, Mihalik Rudolf2, Formelli Franca3, Kopper László1, 2
1Semmelweis Egyetem, I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet, 2MTA-Semmelweis Egyetem, Molekuláris Patológiai Részleg, Budapest; 3Instituto Nazionale Tumori, Chemoprevention Unit, Milánó, Olaszország

Az all-transz-retinsav (ATRA) és szintetikus analógja, a fenretinid (4HPR) hatásos tumorellenes szerek. Kevés adat áll rendelkezésünkre arról, hogy milyen a hatásuk a B-lymphoma-sejtekre. Vizsgálatainkban non-Hodgkin-lymphoma-sejteket kezeltünk all-transz-retinsavval és fenretiniddel. Mindkét szer – idő- és koncentrációfüggően – sejthalált indukált. Fenretiniddel végzett kezelést követően reaktív oxigéngyökök (ROS) fejlődését mutattuk ki, de ezt nem tapasztaltuk az all-transz-retinsavval kezelt sejtekben. A mitochondrium membránjának depolarizációja – mint az apoptózis egyik fontos lépése – az ATRA-kezelt sejtekben korábban következett be, mint a fenretiniddel kezelt sejtekben. Az általános kaszpázgátló z-VAD-fmk csökkentette az all-transz-retinsav által kiváltott DNS-fragmentációt, de közben növelte a nekrózist. Emellett a z-VAD-fmk nem befolyásolta a fenretinid által okozott sejthalált. A kaszpázfüggetlen apoptózis vizsgálatakor sikerült kimutatni, hogy a fenretinid hatására az endonukleáz G kiáramlott a mitochondriumból.
Eredményeinkből kiderült, hogy a természetes retinoid all-transz-retinsav és a szintetikus retinoid fenretinid különböző apoptotikus utakon vált ki apoptózist B-lymphoma-sejtekben. Mindez fontos lehet a különböző lymphomák esetében alkalmazandó retinoidterápiában.
A kutatást támogatta: otka 34892, ett 193/2000, ett 192/2000, fkfp 150/2001, Békésy Alapítvány 118/2001.
 


Retinoids (ATRA and 4HPR) induce caspase-independent DNA fragmentation and cell death in human B-lymphoma cells
All trans retinoic acid (ATRA) and its synthetic analogue fenretinide (4HPR) are potent anticancer drugs. Only few reports are available about the effects of retinoids on B lymphoma cells. In our study non-Hodgkin lymphoma cells (HT58) were treated with ATRA and 4HPR. Both agents induced cell death time and dose dependently. Reactive oxigen species (ROS) production was elevated in 4HPR treated cells but not in ATRA treated cells. The depolarization of mitochondrial membrane as an important step of apoptosis occured earlier after ATRA than 4HPR treament. Z-VAD-fmk, the general caspase inhibitor, decreased the DNA-fragmentation in ATRA treated cells but increased necrosis at the same time. However, z-VAD-fmk did not influence the DNA-fragmentation in 4HPR treated cells. Endonuclease G was released from the mitochondria during 4HPR treatment, which could be an inducer for caspase-independent DNA-fragmentation.
Our results suggest that natural (ATRA) and syntetic (4HPR) retinoids induce different apoptotic pathways in B lymphoma cells which can be an important information for their potential use in leukemia treatment.
The work was supported by otka 34892, ett 193/2000, ett 192/2000, fkfp 150/2001, Békésy Foundation 118/2001.
 


10. A dexamethason nem genomikus úton okoz változásokat a Jurkat-T-sejtek tirozinfoszforilációs mintázatában (P19)

Bartis Domokos, Boldizsár Ferenc, Németh Péter, Berki Tímea
Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Immunológiai és Biotechnológiai Intézet

Napjainkban nagyon széles körben alkalmazzák a glükokortikoid hormon (GC) immunszuppresszív terápiás hatását, bár a pontos biokémiai mechanizmusok részleteikben még nem teljesen felderítettek. A jelenleg elfogadott osztályozás szerint a glükokortikoid hormonok hatásai alapvetően két csoportba oszthatóak: genomikus és nem genomikus hatásokra. A genomikus hatások génexpresszió-változás útján módosítják a sejtek működését, ezek kifejlődéséhez órák szükségesek. A nem genomikus hatások némelyike akár perceken belül létrejöhet. Ez utóbbiak létét sok tapasztalati tény bizonyítja, de a pontos molekuláris hatásmechanizmus szinte teljesen ismeretlen. Kísérleteinkben a glükokortikoid hormonok ezen gyors hatásait tanulmányoztuk in vitro, a Jurkat-T-sejt-vonalon.
Kísérleteinkben öt percig dexamethasonnal (DX, szintetikus GC-agonista) előkezelt Jurkat-T-sejteket aktiváltunk anti-CD3 antitesttel (aCD3). Kontrollként DX-kezeletlen, illetve -aktiválatlan sejteket használtunk. A sejtekben kialakuló Ca2+-jelet Fluo-3AM ionszelektív fluoreszcens indikátorral feltöltött sejteken mértük, áramlási citométer segítségével. A tirozinfoszforilációs mintázatban a dexamethasonkezelés hatására bekövetkező változásokat vizsgáltuk, teljes sejtlizátumokon és egyes fontos jelátviteli fehérjék immunprecipitációjával.
Eredményeink szerint a nagy dózisú (10–5 M) dexamethasonkezelés már öt perc után komplex változásokat okoz a Jurkat-T-sejtek tirozinfoszforilációs mintázatában. A dexamethason általános aktivációt gátló hatásának megnyilvánulásaként a CD3-mal aktivált sejtek teljes lizátumában dexamethasonkezelés hatására foszforilációcsökkenést tapasztaltunk, míg a dexamethasont csak önmagában alkalmazva enyhe foszforilációnövekedést okozott. Dexamethasonkezelés hatására a ZAP-70 és az lck foszforilációja is megnőtt, míg az aktivált mintákban a ZAP-70 foszforilációja tovább növekedett, ezzel ellentétben az lck foszforilációs szintjében csökkenést tapasztaltunk. Vizsgáltuk a dexamethasonkezelés hatását az aktiváció után kialakuló Ca++-jelre is: eredményeink szerint a Jurkat-sejtek Ca++-jelét a dexamethason nem változtatta meg jelentősen.
További célunk, hogy több jelátviteli fehérje precipitációjával azonosítsuk azt a pontos jelátviteli mechanizmust, amelyen a dexamethason rövid idő alatt kifejti a hatását. Kísérleteink hozzájárulhatnak a nem genomikus hatások pontosabb megértéséhez.
 


Dexamethasone causes alterations of the Tyrosine phosphorylation pattern in Jurkat T-cells through a non-genomic pathway
The immunosupressive therapeutic effects of glucocorticoids (GCs) are applied very widely today although the biochemical mode of action is not exactly known. The steroid hormone effects are divided into two groups: genomic and non-genomic pathways. The genomic effects alter the gene expression in the cells. This process needs a few hours. Some of the non-genomic effects occur within minutes. The existece of this latter effects have been observed long ago but the exact molecular mechanism is obscure. The aim of our examinations was to study this rapid GC action on Jurkat T-cells.
In our experiments Jurkat T-cells were pretreated with Dexamethasone (DX, synthetic GC agonist) for five minutes. Then cells were activated with anti-CD3 monoclonal antibody (aCD3 mAb). DX or aCD3 untreated samples were used as controlls. The calcium signal was measured by flow cytometry using the Fluo-3AM fluorescent dye. The alterations of the tyrosine phosphorylation pattern were examined with Western blots using anti-phosphotyrosine mAb on total cell lysates or on immunprecipitates of a few important signalling proteins.
Our results show that high dose (10–5 M) DX caused complex alterations in the tyrosine phosphorylation pattern of Jurkat T-cells. As the outlet of the immunosupressive effect of DX we experienced massive decrease of tyrosine phosphorylation in the aCD3 activated samples while DX in itself induced slight increase of phosphorylation when total cell lysates were examined. ZAP-70 and p56 lck kinases showed increased phosphorylation due to DX treatment. Application of both DX and aCD3 resulted in further rise of ZAP-70 tyrosine phosphorylation but reduced the phosphorylation of p56 lck. We examined the influence of DX treatment on the calcium signal caused by aCD3 activation of Jurkat cells and found that DX treatment had no significant effect on it.
We purpose to design additional experiments to elucidate the exact signalling mechanism mediating rapid GC effects on T-cells. Our studies might contribute to clarify non-genomic steroid effects.
 


11. Hogyan hat a glükokortikoid hormon a T-sejt-differenciálódásra és -aktivációra? (R5)

Berki Tímea, Bartis Domokos, Boldizsár Ferenc, Pálinkás László, Németh Péter
Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Immunológiai és Biotechnológiai Intézet
 
A thymusban fejlődő T-sejt-előalakok (thymocyták) túlélése a pozitív és negatív szelekcióban a T-sejt-receptor (TCR) jelátviteli útjától függ. A T-sejt-receptor és a glükokortikoid hormon (GC) okozta szignál közti párbeszédet már leírták T-sejt-hibridoma-sejteken: a két jelátviteli út önmagában apoptózist okoz, míg együtt a T-sejtek túlélését segítik elő. Mind az endogén, mind a terápiásan alkalmazott glükokortikoid hormon (GC) befolyásolja a T-sejt-fejlődést, apoptózist okozva az éretlen thymocyta-előalakokon. Emellett a glükokortikoid hormonok helyi termelődését is leírták a thymusban; e thymus eredetű glükokortikoid hormonok fiziológiás szerepe a thymocytaérésben és -differenciálódásban még nem teljesen tisztázott. Saját korábbi munkánk alapján a leginkább GC-érzékeny kettős pozitív (DP) thymocyta-alcsoport expresszálja a legalacsonyabb GCR-szintet mind fehérje-, mind mRNS-szinten. Az úgynevezett mutual antagonism modell képviselői leírják, hogy a GC-hatással felfüggeszthető a T-sejt-receptor (TCR) indukálta apoptózis, így a thymocyták pozitív szelekcióját okozva.
Jelen munkánkban a TCR-szignál és a GC-kezelés hatását vizsgáltuk:
– egyrészt a fejlődő thymocyták túlélésére és szelekciós lépéseire egy TCR-AND transzgenikus [galamb citokróm-C- (PCC-) specifikus Vb3-TCR] egérmodellen,
– valamint a T-sejt-receptor jelátviteli út egyes komponenseinek tirozinfoszforilációjára, in vitro tenyésztett T-sejteken.
Eredményeink azt jelzik, hogy az MHC-II-n keresztül bemutatott PCC-peptid-fragmentumok glükokortikoid hormon jelenlétében fokozott pozitív szelekciót eredményeznek (a Vb3-pozitív DP-sejtek érett CD4+ stádiumba jutnak), míg arányában a Vb3-negatív sejtek többsége az éretlen kettős pozitív érési szinten reked. E megfigyelésekből arra következtettünk, hogy a glükokortikoid hormon nem genomikus mechanizmus révén, közvetlenül befolyásolja a T-sejt-receptor jelátviteli utat.
Ennek bizonyítására vizsgáltuk a TCR jelátviteli út egyes komponenseinek (ZAP-70, lck, CD3-komplex) tirozinfoszforilációját nagy dózisú, rövid ideig (percekig) tartó glükokortikoidhormon-kezelés és együttes TCR-aktivációt (anti-CD3-kezelést) követően Jurkat-T-sejteken. A glükokortikoidhormon-kezelés önmagában is megváltoztatta a sejtek tirozinfoszforilációs mintázatát, növelte a ZAP-70- és az lck-tirozinfoszforilációt. A TCR-szignállal együtt alkalmazva a ZAP-70-foszforilációra additív, míg az lck-foszforilációt gátló hatást fejtett ki. A perceken belül kialakuló változások kizárják a GCR genomikus hatásmechanizmusát, ezért a tapasztalt változások a TCR jelátviteli úttal történő közvetlen összekapcsolódást bizonyítják.
 


How does glucocorticoid hormone (GC) influence T-cell differentiation and activation?
The survival of developing thymocytes during positive and negative selection steps depends on the TCR signaling. The crosstalk between TCR-signaling and the GC induced signal was described in T-cell hybridoma cells: independently both signals induce apoptosis, yet together they promote T-cell survival. This so called “mutual antagonism” model was investigated by Ashwell et al. for thymocyte positive selection in an in vitro model. Both endogenous and therapeutically injected glucocorticoid hormones (GC) influence T-cell maturation by inducing apoptosis of immature thymocytes. In addition locally produced GCs were also identified in the thymus. The physiological role of these thymus-derived GCs in thymocyte development and selection is still controversial. In a previous study we have demonstrated that among the different thymocyte subpopulations the most GC sensitive DP thymocytes express the lowest GC receptor (GCR) level both at protein and mRNA level and the lowest Bcl-2 level. In this study our goal was to investigate the antigen (TCR) and GC induced effects for the survival and selection of developing thymocytes using an in vivo TCR-AND transgenic mouse model (pigeon cytochrome-C (PCC) specific Vb3 TCR). An in vitro model was used to detect the alterations of tyrosine phosphorylation of the TcR signal transduction pathway components in the presence of high dose GC.
The administration of PCC or DX resulted in reduced total thymocyte numbers in both cases however combined treatment induced a significantly increased CD4/DP cell ratio. CD69 expression (marker of positive selection) increased on both DP and CD4 SP cells. The ratio of Vb3 TcR bearing DP thymocytes showed no change after DX or PCC administrations alone, but decreased significantly after combined treatment. These results indicate, that MHC-II-bound PCC-peptides in the presence of GCs induced enhanced positive selection (maturation from DP into CD4 SP stage), therefore the Vb3-negative cells remained mostly in the DP immature stage. We conclude that in DP thymocytes the GC induced signaling pathway can influence the antigen induced TCR signal.
Then we investigated the components (ZAP-70, lck, CD3 complex) of the TCR signaling pathway after large dose, short-term (minutes) GC treatment on Jurkat cells. The GC hormone in itself changed the tyrosine phosphorylation of the cells, increased the ZAP-70 and lck phosphorylation. Together with the TCR signal GC had an additive effect on ZAP-70 phosphorylation, while it was inhibitory on lck phosphorylation. These short-term treatments exclude the genomic effects of GCR during T-cell activation and underline the direct interactions of the two signaling pathways.
 


12. A módosított lipoproteinek direkt és CRP-függő komplementaktiváló hatása (E18)

Bíró Adrienn1, Thielens Nicole2, Cervenak László1, Prohászka Zoltán1, Füst György1, Arlaud Gérard J.2
1
Semmelweis Egyetem, III. sz. Belgyógyászati Klinika, Kutató Laboratórium, Budapest; 2Institute de Biologie Structurale Jean Pierre Ebel, Grenoble, Franciaország

Az érelmeszesedést olyan krónikus gyulladásos folyamat eredményének tartják, amelyet a macrophagok, T-lymphocyták, illetve a komplementrendszer aktiválódása okoz. A komplementaktivációban két – az atheroscleroticus laesióban megtalálható – komponens, az enzimatikusan módosított LDL (E-LDL) és a C-reaktív protein (CRP) szerepét emelik ki. Az LDL atherogen származéka kizárólag a kötőszövetben megtalálható enzimek lebontása következtében alakul ki a lipoprotein-részecskékből. Egyes adatok szerint a komplementrendszer aktiválódását a CRP-hez kötődött E-LDL és a lebontott lipoproteinekben lévő, nem észterifikált koleszterin okozhatja. Az atherogenezis során az elsődleges immunológiai károsodást és az endotheldiszfunkció kialakulását a lipidek érfalba vándorlása követi; ezért fontosnak tartottuk a lipidek módosulásának és immunológiai szerepének vizsgálatát.
Bár azt állítják, hogy a CRP opszonizálja a natív LDL-t – ezáltal hozzájárul a habos sejtek kialakulásához –, más adatok szerint a CRP csak az oxidatív és enzimatikus úton módosított LDL-hez képes kötődni, a natív formához nem.
Jelen munkánkban a natív lipoproteinek és az LDL módosított formáinak direkt C1-komplex-aktiváló hatását – valamint a CRP szerepét – vizsgáltuk erre az aktivációs folyamatra. Az E-LDL-t úgy állítottuk elő, hogy az LDL-t egymás után kezeltük egy proteázzal – tripszinnel, proteináz K-val vagy plazminnal –, majd koleszterinészterázzal és neuraminidázzal.
A tisztított C1q-ból, C1r-ből és C1s-ből újraalkotott C1-komplexet használva megállapítottuk, hogy a natív LDL CRP jelenlétében szignifikáns C1-aktivációt okoz (16% aktiváció); ez az alacsony aktivációs szint az LDL oxidatív módosításával fokozható (33% aktiváció). A CRP-függő C1-aktiváció korrelál az oxidáció időtartamával, és így valószínűleg az oxidáció mértékével is.
Csak az E-LDL, és nem a natív vagy oxidált LDL vált ki direkt C1-aktivációt a CRP-től független módon (47% aktiváció). Az LDL koleszterinészterázzal való kezelése kritikus a komplementaktiváló származék kialakulásában. A CRP – az E-LDL magas koncentrációja mellett – nem fokozta az E-LDL C1-aktiváló hatását.
Eredményeink alátámasztják azt a hipotézist, hogy az LDL oxidatív módosítása szerepet játszhat a CRP-függő C1-aktivációban, és az E-LDL direkt C1-aktivációt vált ki. A komplementaktivációnak ez a két útja fontos funkciót tölthet be az érelmeszesedés patogenezisében.
További vizsgálatok szükségesek a lipoproteinek CRP-kötő része(i)nek meghatározásához és a C1-aktivációban szerepet játszó molekulá(k) karakterizálásához.
 


Direct and CRP-dependent complement activation by modified lipoproteins
Atherosclerosis has been suggested to be a consequence of chronic inflammation induced by activation of macrophages, T-lymphocytes and/or complement. Two lesion components have been identified that may be responsible for complement activation: enzymatically degraded LDL (E-LDL) and C-reactive protein (CRP). Transformation of LDL to its atherogenic derivative occurs by degradation of the lipoprotein particle by enzymes that may be ubiquitously present in connective tissues. Some data suggest that CRP-bound E-LDL and exposure of unesterified cholesterol in the degraded lipoprotein may cause activation of complement. During atherogenesis the primer immunological injury and endothel disfunction is followed by lipoprotein uptake by arterial wall, therefore we found it important to study the modification and immunological role of these lipoproteins.
Whereas CRP was reported to opsonize native LDL and cause foam cell formation, other data suggest that CRP only binds to oxidized LDL (oxLDL) and E-LDL but not to native LDL.
In the present work we tested the ability of native lipoproteins and the modified forms of LDL to trigger direct activation of the C1 complex and the effect of CRP on the activation process. E-LDL was prepared by sequential treatment of LDL with a protease (trypsin, proteinase K, or plasmin) and then with cholesteryl esterase and neuraminidase.
Using C1 reconstituted from purified C1q, C1r and C1s, it was shown that native LDL activates C1 to a significant extent (16% activation) in a CRP-dependent manner, and that this low activation level could be increased upon oxidative modification of LDL (33% activation). CRP-dependent C1 activation was correlated with the oxidation time, and hence probably with the extent of oxidation.
E-LDL, but not native LDL or oxidized LDL, was found to trigger direct C1 activation independent of CRP (47% activation). The treatment of LDL with cholesteryl esterase was critical in forming a complement activating E-LDL derivative. CRP did not enhance E-LDL-induced C1 activation at high concentrations of E-LDL.
In summary our data are consistent with the hypothesis that oxidative modification of LDL triggers CRP-dependent C1 activation, and that E-LDL triggers direct C1 activation. These two routes of complement activation may play an important role in the pathogenesis of atherosclerosis.
Further experiments are needed to identify the CRP binding component(s) of LDL, and to characterize the molecule(s) involved in direct C1 activation.


13. Az MHC-régió génjeinek variáns alléljai szignifikánsan csökkentik az ischaemiás stroke kialakulásának kockázatát (P25)

Blaskó Bernadett1, Harcos Péter2, Kiszel Petra1, Széplaki Zoltán3, Laki Judit1, Szolnoki Zoltán4, Kovács Margit1, Melegh Béla5, Széplaki Gábor1, Füst György1
1Semmelweis Egyetem, III. Sz. Belgyógyászati Klinika, Kutatólaboratórium, 2Szt. Imre Kórház, Neurológiai Intézet, 3Semmelweis Egyetem, Klinikai Neurológiai Csoport, Budapest; 4Pándy Kálmán Megyei Kórház, Neurológiai és Neurofiziológiai Intézet, Gyula; 5Pécsi Egyetem, Orvosi Genetikai és Gyermekfejlődéstani Intézet
 
Bevezetés: Az ischaemiás stroke multifaktoriális betegség; kialakulása számos genetikai mutáció és környezeti tényező függvénye. A központi MHC-régió két single nukleotid polimorfizmusának (SNP) variáns alléljait vizsgáltuk, hogy az allélfrekvencia milyen módon változik a betegek körében és az egészséges kontrollcsoportban.
Módszer:
A limfotoxin-a +252 (LTA, báziscsere A-ról G-re) polimorfizmusát és a tumornekrózis-faktor-a promoterrégiója –308 (TNF, báziscsere G-ről A-ra) polimorfizmusát vizsgáltuk; ezeket restrikciósfragmens-hosszpolimorfizmussal (RFLP) határoztuk meg. A stroke-os betegek száma 334, az egészségeseké 190 volt. A stroke-os betegeket – a TOAST-klasszifikáció szerint – három csoportba osztottuk: az első csoportba a nagyérinfarktusos betegek tartoztak, a második csoportba a kisérinfarktusos betegek, a harmadik csoportba pedig az egyéb vascularis állapotokat – például véralvadás zavarok – soroltuk.
Eredmények: A TNF-a –308 A allél gyakorisága az ischaemiás stroke-os betegeknél szignifikánsan csökkent, ugyanakkor a LTA-a G allél előfordulása a stroke-os és az egészséges egyének körében nem különbözött.
Amennyiben a stroke-os betegeket csoportosítottuk, a második csoportba – a kisérinfarktuson átesettek közé – tartozóknál a TNF-a –308 A allél és az LTA-a +252 G allél gyakorisága jelentősen csökkent a kontrollhoz képest.
Az infarktus kiterjedése – teljes, parciális, lacunaris – alapján megállapíthatjuk, hogy a teljes és lacunaris infarktust kapott betegek között nem voltak homozigóta TNF-a –308 A allélt hordozók.
Következtetések: Eredményeink szerint a TNF-a –308 A allél előfordulása jelentősen csökkent a stroke-os betegek körében. Valószínűsíthető, hogy a TNF-a –308 A allél és az LTA-a +252 G allél jelenléte védőhatású a kisérinfarktussal szemben.
 


Carriers of two variant alleles of genes in the central MHC region has a significantly decreased risk for small vessel ischaemic stroke
Introduction:
Ischaemic stroke is a common multifactorial disease that is affected by a number of genetic mutations and environmental factors. We have examined if carriers of variant alleles of two SNPs in the central MHC region have an altered relative risk of the disease.
Methods: Lymphotoxin-a +252 A to G polymorphism as well –308 G to A promoter polymorphism of tumor necrosis factor-a (–308) were examined. The number of stroke patients and healthy control individuals were 334 and 190, respectively. The stroke patients were divided into three groups by a modified TOAST classification: Group 1 represented large vessel infarction, Group 2 represented the small vessel infarction, Group 3 represented the mixed vascular pathology.
Results: 1. We found that frequency of TNF-a –308 A allele was significantly decreased in patients with ischemic stroke whereas the frequency of LTA-a G allele did not significant differ between stroke patients and healthy subjects. 2. The TNF-a and LTA-a genotypes had different effects on risk of subtypes of ischemic stroke according to modified TOAST classification: frequency of TNF-a –308 A allele and LTA +252 G allele are decreased in Group 2 (small vessel infarction), and LTA +252 G allele as well differs from the Group 3.
Conclusion: 1. TNF-a –308 A allele frequency is decreased in stroke patients. 2. Our result suggests that presence of TNF-a –308 A allele and LTA +252 G allele has a protective effect for the small vessel infarction.
 


14. A TT vírus kimutatása autoimmun reumatológiai megbetegedésekben (P22)

Blazsek Antal1, ifj. Gergely Péter1, Weiszhár Zsóka1, Beke Katalin1, Poór Gyula1
Országos Reumatológiai és Fizioterápiás Intézet, Budapest
 
Bevezetés: A rheumatoid arthritis (RA) vagy a szisztémás lupus erythematosus (SLE) ismeretlen eredetű autoimmun reumatológiai megbetegedések; etiopatogenezisükben régebb óta felmerült a vírusok lehetséges szerepe. A TT vírus egy nemrég felfedezett, a különböző populációkban nagyszámban előforduló, egyszálú DNS-vírus, patogenitása ismeretlen; számos biológiai mintából kimutatták, de synovialis folyadékban való előfordulásával kapcsolatban nincsen adat.
Célkitűzés:
Célunk az autoimmun reumatológiai megbetegedésekben (RA, SLE) szenvedő és a nem gyulladásos, degeneratív eredetű reumatológiai (kontroll-) betegségben szenvedők TT-vírus-fertőzöttségének felmérése volt. Kísérleteink során megvizsgáltuk, hogy a vírus jelen van-e a rheumatoid arthritisben, illetve osteoarthritisban (OA) szenvedő betegek synovialis folyadékában.
Módszer:
A vizsgálatok során a TTV-genom jelenlétét betegek (SLE n=95, RA n=97) és kontrolldonorok (n=91) szérumából, valamint a betegek térdízületi synovialis folyadékából (RA n=4, OA=10) mutattuk ki, nested PCR-metodikával. A pozitív eredményeket DNS-szekvenálással ellenőriztük.
Eredmények:
A TTV-pozitivitás aránya hasonló értéket mutatott a rheumatoid arthritisben szenvedők (11,0%) és az egészséges donorok (10,34%) esetén; az SLE-ben szenvedő betegek mintáiban azonban nagyobb százalékban (17%) bizonyítottuk a vírus jelenlétét. Sikerült a vírusnukleinsav jelenlétét igazolnunk a rheumatoid arthritises és az osteoarthritises eredetű synovialisfolyadék-mintákban is. A szekvenciák analízise nagyfokú változatosságot mutatott.
Következtetés:
A TTV gyakoribb előfordulása az SLE-s betegek mintáiban a vírus patogenetikai szerepét veti föl. További vizsgálatok szükségesek a TT vírus jelentőségének tisztázására autoimmun reumatológiai megbetegedésekben.


Detection of TT virus in patients with autoimmune rheumatic diseases

Background: Viruses have long been considered as causative agents in autoimmune rheumatic diseases such as rheumatoid arthtitis (RA) and sytemic lupus erythematosus (SLE). TT virus (TTV) is a recently discovered single-stranded DNA virus with a high prevalence in different populations, especially among patients with hepatitis C. However, its exact role and pathogenicity are still to be determined. Viral TTV DNA has been detected in human samples of different origin including blood, bile or saliva but there is no report whether the virus is present in the synovial fluid.
Objectives: Our goal was to test the hypothesis that patients with RA and/or SLE show a higher percentage of TTV infection. Also, we aimed at investigating whether the virus is present in the synovial fluid in patients with RA and osteoarthritis (OA).
Methods: Prevalence of TTV DNA was evaluated in the sera of patients with SLE (n=95) and RA (n=97) compared to control donors (n=91) and in knee synovial fluid from patients with RA (n=4) and OA (n=10) by nested PCR. DNA sequencing was applied to confirm the results.
Results: Percentage of TTV positivity was similar in rheumatoid arthritis (11.0%) and in healthy donors (10.34%) but patients with SLE showed a higher percentage of TTV infection (17%) than control or RA patients. For the first time we were able to detect TTV DNA in the synovial fluid. Both RA and OA patients contained TT viral DNA in the synovial fluid. Sequence analysis revealed a high genomic variability amongst our subjects.
Conclusion: Our data suggest that increased prevalence of TT virus infection may be important in the etiopathogenesis of SLE. Further studies on larger number of patients and on the clinical correlates are necessary to determine the role of TT virus in autoimmune rheumatic diseases.
 


15. A HLA DRB1 genotípus és az anticiklikus citrullinált peptid (CCP) autoantitest-termelés kapcsolatának vizsgálata rheumatoid arthritisben (P41)

Brózik Márta, Weiszhár Zsóka, ifj. Gergely Péter, Merétey Katalin, Poór Gyula
Országos Reumatológiai és Fizioterápiás Intézet, Budapest
 
A rheumatoid arthritis (RA) az ízületeket érintő, ismeretlen etiológiájú autoimmun betegség. Kialakulásában a genetikai és a környezeti faktorok szerepe egyaránt hangsúlyozott. A genetikai fogékonyság azokhoz az MHC II-molekulákhoz kapcsolható, amelyek bizonyos – shared epitop (SE) néven ismert – konzervált aminosav-motívumot tartalmaznak. Feltételezett, hogy ezek az MHC-molekulák valamilyen arthritogen peptidet kötnek, majd azt bemutatják az autoreaktív T-sejteknek. Citrullinált fehérjékkel reagáló autoantitestek fokozott termelése a rheumatoid arthritisre specifikus jelenség, ezért a deiminált, citrullinná modifikált arginint tartalmazó peptidek ilyen arthritogen, SE-kötő potenciális struktúrák. HLA DRB1*0401 transzgénegér-modellben igazolták, hogy bizonyos peptidekben az arginin cseréje citrullinra jelentősen fokozott, MHC II-függő T-sejt-proliferációt vált ki azáltal, hogy a citrullinált formát az SE-molekula jóval nagyobb affinitással köti.
A fentiek alapján munkánk célja a rheumatoid arthritises betegek DRB1 genotípusa és anti-CCP-antitest-pozitivitása közötti kapcsolat vizsgálata.
A HLA DRB1-genotipizálást PCR-SSP-módszerrel végeztük, DR kis felbontású, valamint DRB1*01 és DRB1*04 szubtipizáló kit felhasználásával. Az anti-CCP-autoantitest-, illetve RF-szinteket ImmunoscanRA Elisa-kittel, illetve nefelometriás módszerrel mértük. Jelenleg 71 rheumatoid arthritises beteg adatai állnak rendelkezésünkre. Ezek szerint az SE-hordozók (n=44) 77,3%-a bizonyult anti-CCP-pozitívnak, míg SE allél hiányában (n=27) az anti-CCP gyakorisága 55,5%.
RF-pozitivitás az SE-hordozók 81,8%-ánál, a nem hordozó betegeknek pedig 66,7%-ánál mutatható ki. Az autoantitestszint átlaga a CCP-pozitív SE-hordozó betegcsoportban 867 U/ml, az allél távollétében 757 U/ml. Ezek az adatok arra utalnak, hogy mind az anti-CCP antitest gyakorisága, mind annak átlagos szintje magasabb az SE-t hordozó betegekben; az eredmények stisztikai kiértékelését a folyamatban lévő további minta adatainak birtokában végezzük el.
A munka az OTKA T037876 pályázat támogatásával készült.

Investigation the relationship between HLA-DR1 genotype and the presence of autoantibody to cyclic citrullinated peptide (CCP) in patients with rheumatoid arthritis

The aetiology of rheumatoid arthritis (RA) has been suggested to be an interaction between genetic and environmental factors. Genetic susceptibility to this disease in most population is associated with MHC II molecules that contain an amino acid motif known as the shared epitope (SE). These MHC molecules may bind arthritogenic peptides for presentation to autoreactive T-cells.The nature of the arthritogenic peptide is not known, but recent studies have identified posttranslationally modified proteins containing citrulline (deiminated arginine) as targets of anti-cyclic-citrullinated peptides (CCP) autoantibodies. It has been shown, that in HLA-DRB1*0401 transgenic mice, the conversion of arginine to citrulline at the peptide side chain position interacting with the shared epitope significantly increases peptide-MHC affinity and leads to the activation of CD4+ T-cells in the transgene mice.
The aim of this work is to investigate the relationship between HLA-DRB1 genotype and the presence of RA specific IgG anti-CCP antibodies in patients with RA.
HLA-DRB1 genotyping was performed using polymerase chain reaction seqence specific primers from DR low resolution kit and DRB1*01, DRB1*04 subtyping kits as well.
IgG anti-CCP antibody levels were measured by ImmunoscanRA elisa kit. Rheumatoid factor was determined by nephelometric method. Preliminary results of 71 patients with RA have been available until now. These data show that the prevalence of anti-CCP autoantibodies is 77.3% in SE carriers (n=44) and 55.5% in non-SE carrying (n=27) patients. Occurrence of rheumatoid factor is 81.8% in SE carriers and 66.7% in non-carriers.
The average of autoantibody level measured in anti-CCP positive patients carrying SE is 867 U/ml while in the absence of SE alleles is 757 U/ml. Result will be statistically evaluated when data of a more extended population has been available.
This work was supported by the grant OTKA T037876.
 


16. T-sejt-reguláció és immuntolerancia (R4)

Buzás Edit
Semmelweis Egyetem, Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet, Budapest
 
Az elmúlt néhány év intenzív kutatómunkájának köszönhetően mind teljesebb betekintést nyerhetünk a szabályozó T-sejtek működésébe. E sejteknek számos altípusát különíthetjük el, és az immunrendszer e közelmúltban ismertté vált főszereplőinek funkcionális jelentőségével kapcsolatban is egyre több adattal rendelkezünk.
A szabályozó T-sejtek működésének megértéséhez elengedhetetlen annak a kérdésnek a megválaszolása, milyen szerepet játszanak a fenti sejtek az immuntolerancia fenntartásában.
Számos kísérleti rendszer adatai utalnak arra, hogy a szövetek saját antigénjeit a regionális nyirokcsomók antigén-bemutató sejtjei feltehetőleg folyamatosan prezentálják a nyugvó autoreaktív szabályozó T-sejtek számára, így azok folytonos aktivációja játszik szerepet a kóros autoimmunitás kialakulásának megelőzésében.
Tekintettel arra, hogy bármely T-sejt-receptor ligandkötése promiszkuus, még az autoreaktív irányban eltolt szabályozó-T-sejt-repertoár is szükségszerűen felismer környezeti eredetű, külső antigéneket is. Egyelőre nincsen információnk arra nézve, hogy az utóbbi kölcsönhatások hogyan befolyásolják az autoimmun megbetegedések kialakulásának megelőzését.
A szabályozó T-sejtek vizsgálatának területén elért eredmények a jövőbeni terápiás célú felhasználás alapjait teremthetik meg.
 


T-cell regulation and immunological tolerance
Intense effort over the past few years has yielded growing insight into the nature of regulatory T-cells. Several subsets have been identified and data are rapidly accumulating on the functional significance of these recently recognized mayor players of the immune system.
Fundamental to our understanding of the functions of regulatory T-cells is the question of what role they play in the maintenance of immunological tolerance.
It has been proposed that tissue self antigens are permanently presented by antigen presenting cells in draining lymph nodes and continuously activate autoreactive resting regulatory T-cells to prevent pathological autoimmunity.
However, considering promiscuous recognition of ligands by any given TCR, even a self antigen-biased regulatory T-cell repertoire would be conceivable to interact with environmentally derived foreign antigens. How such interactions affect the prevention of autoimmune diseases remains to be clearified.
The progress in the field of regulatory T-cells is laying the foundation for exploitation of a regulatroy T-cell-based approach for therapeutic purposes.
 


17. Összehasonlító tanulmány a citokinek és az apoptózis szerepéről, dilatatív és hypertrophiás cardiomyopathiában (E30)

Buzás Krisztina1, Megyeri Klára1, Hőgye Márta2, Csanády Miklós2, Bogáts Gábor2, Mándi Yvette1
Szegedi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, 1Orvosi Mikrobiológiai és Immunbiológiai Intézet, 2II. Sz. Belgyógyászati Klinika és Kardiológiai Központ
 
Abból a célból, hogy mélyebb betekintést nyerjünk a dilatatív és a hypertrophiás cardiomyopathia (DCM és HCM) patogenezisébe, néhány olyan citokin szerepét tanulmányoztuk, amelyek az apoptózis folyamatát szabályozzák.
Módszerek és eredmények: A tumornekrózis-faktor-a (TNF-a), a szolúbilis Fas (sFas), az interleukin-6 (IL-6) és a szolúbilis IL-6-receptor (sIL-6R) koncentrációját plazmából – ELISA-tesztek segítségével – határoztuk meg. Azt találtuk, hogy a dilatatív cardiomyopathiában szenvedő betegek plazmájában emelkedett a TNF-a, az sFas, az IL-6 és az sIL-6R koncentrációja, míg a hypertrophiás cardiomyopathiában megbetegedettek esetében csak az IL-6- és az sIL-6R-értékek voltak magasabbak az egészséges egyéneken mért értékekhez képest. A TNF-a, IL-6, Bcl-2 és Bax proteinek szintjét szívbiopsziás mintákból Western blot-analízis segítségével határoztuk meg. Eredményeink azt mutatták, hogy a dilatatív cardiomyopathiában szenvedő betegek esetében fokozott a TNF-a, IL-6 és Bax proteinek kifejeződése, míg a hypertrophiás cardiomyopathiában szenvedők lizátumaiban csak a Bcl-2 szintje emelkedett. TNF-a-val kezelt H9C2-sejtek Annexin V-kötő esszével végzett vizsgálata azt mutatta, hogy a TNF-a in vitro citotoxicitásában az apoptózis és a nekrózis is szerepet játszik.
Következtetések: Adataink dilatatív cardiomyopathiában a TNF-a és Fas által indukált proapoptotikus jelátviteli utak jelentős aktiválódását, míg hypertrophiás cardiomyopathiában az antiapoptotikus folyamatok túlsúlyát bizonyítják. A cardiomyopathiák patogenezisével kapcsolatban megállapítható, hogy az apoptózis a dilatatív cardiomyopathia esetében tapasztalható diszfunkciók egyik fontos tényezője lehet, az IL-6 pedig a hypertrophiás cardiomyopathiára jellemző hypertrophia kialakulásában játszhat jelentős szerepet.
Készült az NKFP 1/00/1/2001 támogatásával.
 


Comparative study of the roles of cytokines and apoptosis in dilated and hypertrophic cardiomyopathies
Aims: In order to gain more insight into the pathogenesis of dilated and hypertrophic cardiomyopathies (DCM and HCM, respectively), we investigated the roles of certain cytokines that regulate apoptosis.
Methods and results: ELISA tests, performed to determine the plasma concentrations of tumour necrosis factor-a (TNF-a), the soluble Fas (sFas), interleukin-6 (IL-6) and the soluble IL-6 receptor (sIL-6R), revealed that DCM patients exhibit elevated concentrations of TNF-a, sFas, IL-6 and sIL-6R, while HCM patients have only high IL-6 and sIL-6R levels as compared with healthy individuals. Western blot analysis of the levels of TNF-a, IL-6, Bcl-2 and Bax proteins in myocardium samples demonstrated that DCM patients express increased levels of TNF-a, IL-6 and Bax, whereas HCM heart lysates display only elevated levels of Bcl-2. Annexin V binding assay of TNF-a-treated H9C2 cells indicated that the in vitro citotoxicity of this cytokine involves apoptotosis and necrosis.
Conclusion: These data indicate a strong activation of the pro-apoptotic TNF and Fas pathways in DCM patients, and an anti-apoptotic shift in HCM patients. These findings bear on the pathogenesis of cardiomyopathies, since apoptosis may account for certain dysfunctions observed in DCM, while IL-6 may elicit the hypertrophy characteristic of HCM.
This study was supported by Hungarian Research Grant NKFP 1/00/1/2001.
 


18. A hisztamin szerepe a Mycobacterium bovis BCG intracelluláris túlélésében (P18)

Buzás Krisztina1, Megyeri Klára1, Miczák András1, Buzás Edit2, Kovács Lóránd1, Falus András2, Mándi Yvette1
1Szegedi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Orvosi Mikrobiológiai és Immunbiológiai Intézet; 2Semmelweis Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet, Budapest
 
A mycobacteriumok által okozott fertőzések lefolyását és kimenetelét szabályozó faktorok sokrétűek. Komplex kölcsönhatás áll fenn a gazda immunrendszere és a baktériumok túlélési mechanizmusai között. A hisztamin ennek a folyamatnak fontos tényezője lehet, hiszen szerepet játszik a T-sejtek differenciálódásában és különböző citokinek termelődését modulálja.
Vizsgálatainkban a hisztamin szerepét kívántuk tisztázni a Mycobacterium bovis BCG (M. bovis BCG) intracelluláris túlélésében.
Módszerek: Csontvelői macrophagokat izoláltunk hisztidin-dekarboxiláz knockout (HDC-KO) és vad genotípusú (WT) egerekből. A macrophagkultúrák egy részét in vitro aktiváltuk rekombináns interferon-g-val (50 U/ml), másik része aktiválatlan maradt. Ezek után mind az aktivált, mind a nyugvó sejteket M. bovis BCG-törzzsel fertőztük, 5:1 (baktérium:macrophag) arányú multiplicitást alkalmazva. A fertőzött sejteket a nulladik, első, harmadik és ötödik napon lízispufferrel oldottuk; Middlebrook (7H11) táptalajon szélesztéses módszerrel meghatároztuk az intracelluláris baktériumkoncentrációt. Az apoptotikus DNS-fragmentációt és az interleukin-18- (IL-18-) termelést ELISA-kitek segítségével vizsgáltuk.
Eredmények: Az intracelluláris mycobacteriumtiterek az öt nap folyamán fokozatos csökkenést mutattak. Az aktivált macrophagok hatékonyabbnak bizonyultak a mycobacteriumok eliminálásában, mint a nyugvó sejtek. A mycobacteriumtiterek szignifikánsan magasabbak voltak a HDC- KO macrophagokban, mint a WT-sejtekben. Az aktivált macrophagok fertőzése M. bovis BCG-vel a sejtek apoptózisát idézte elő, az apoptózis mértékében azonban nem mutatkozott szignifikáns különbség a HDC-KO és a WT-sejtek között. A M. bovis BCG IL-18-termelést indukált mind az aktivált, mind a nyugvó WT-macrophagokban, míg a HDC-KO-sejtekben nem váltotta ki e citokin termelődését.
Következtetés: Adataink valószínűsítik a hisztamin szerepét a M. bovis BCG intracelluláris túlélésében, továbbá felvetik annak a lehetőségét, hogy a hisztamin a M. bovis BCG által indukált IL-18-termelés egyik fontos mediátora.
Készült az OTKA/T 034820 támogatásával.
 


The role of histamine in intracellular survival of Mycobacterium bovis BCG
The factors that regulate the course and outcome of infection with mycobacteria are multifaceted. There is a complex interplay between the immune system of the host and the survival mechanisms developed by the bacilli. Histamine plays an important role in the regulation of T-cell differentiation and modulates the production of several cytokines.
The aim
of our study was to investigate the role of histamine in the intracellular survival of Mycobacterium bovis BCG (M. bovis BCG).
Methods: Murine bone-marrow macrophages were isolated from histidine-decarboxylase knockout (HDC-KO) and wild-type (WT) mice. The in vitro cultured macrophages were either non-activated or activated with recombinant interferon-g (50 U/ml, 15 h) and then infected with M. bovis BCG at a multiplicity of 5:1 (bacteria per macrophage). The infected cells were lysed at 0, 1, 3 and 5 days, and the intracellular bacteria were counted by plating the lysates on Middlebrook agar (7H11). ELISA kits were used to measure the extent of apoptotic DNA fragmentation and interleukin-18 (IL-18) production.
Results: The titers of intracellular mycobacteria gradually decreased through the 5 days of culture. The activated macrophages were more efficient in eliminating mycobacteria, than the resting macrophages. Mycobacterial titers were significantly higher in HDC-KO macrophages compared to WT-cells. Infection of activated macrophages with M. bovis BCG elicited apoptosis, however there was no significant difference between the HDC-KO and WT-cells. M. bovis BCG induced IL-18 production in both resting and activated macrophages isolated from the WT mice, but not in the HDC-KO macrophages.
Conclusion: These data implicate histamine in the intracellular survival of M. bovis BCG. Furthermore, these experiments suggest that histamine might be an important mediator of M. bovis BCG-induced IL-18 production.
This study was supported by grant OTKA/T 034820 of the Hungarian Scientific Research Fund.
 


19. CRP-szerkezet- és -hatás-vizsgálat endothelsejten (E21)

Cervenak László1, Oroszlán Melinda2, Herczenik Eszter1, Potempa Larry A.3, Karádi István1, 2, Romics László1, 2, Füst György1, 2, Prohászka Zoltán1, 2
1
Magyar Tudományos Akadémia-Semmelweis Egyetem, Anyagcsere és Atherosclerosis Kutatócsoport, 2Általános Orvostudományi Kar, III. Sz. Belgyógyászati Klinika, Budapest; 3Immtech International, Inc. of Vernon Hills, USA
 
A C-reaktív protein (CRP) az utóbbi időben a gyulladásos reakciók tanulmányozásának középpontjába került. Azonkívül, hogy a CRP az akutfázis-fehérjék prototípusa, rendkívül jó markernek bizonyult a coronariabetegségek előrejelzésében. Másrészt egyre több adat áll rendelkezésünkre a CRP konformációjának módosulásáról, és az ezzel párhuzamosan végbemenő szubsztrátfelismerőképesség-változásról.
Célunk az volt, hogy a CRP módosulását modellező három konformációs típus hatását vizsgáljuk endothelsejteken.
Kísérleteinkben ELISA, sejtes ELISA, immunfluoreszcens dekonvolúciós mikroszkópia, konfokális lézer pásztázó mik-roszkópia, PAGE, Western blot és Limulus Amoebocyta Assay módszereket alkalmaztunk.
Először karakterizáltuk a rendelkezésre álló CRP-molekulák – natív CRP: nCRP, rekombináns módosított CRP: C-rmCRP, ureamódosított CRP: U-mCRP – tulajdonságait, és kizártuk az LPS-szennyeződés lehetőségét.
Ezután megnéztük, hogy a különböző CRP-molekulák citotoxikus hatásúak-e az endothelsejtekre; még 100 µg/ml-es dózisban sem figyeltünk meg citotoxicitást.
Humán köldökzsinórvéna-endothelsejteket (HUVEC) in vitro tenyésztettünk, majd kezeltünk a különböző CRP-molekulákkal. A sejtekhez csak a C-rmCRP kötődött, és – már 10 µg/ml-es koncentrációban is – internalizálódott. Ennek ellenére egyik CRP sem változtatta meg a sejtek proliferációs képességét, valamint az ICAM-1, a VCAM-1 és az E-szelektin adhéziós molekula expresszióját sem. Ugyancsak nem hatott egyik CRP-forma sem az endothelsejtek IL-8- és MCP-1-termelő képességére.
A CRP szerkezetének módosulása egyben a szubsztrátspecificitás megváltozását is jelenti, ezt mi is ki tudtuk mutatni. Irodalmi adatok szerint a módosított CRP megnövelte a legfontosabb adhéziós molekulák és citokinek expresszióját az artéria-endothelsejteken. Azonban a mi kísérleteinkben ilyen változást annak ellenére nem tapasztaltunk, hogy sikerült kimutatnunk a sejtekhez való kötődést. Mivel az artéria-endothelsejtek esetén is megvizsgálták és kizárták az LPS-szennyeződés lehetőségét, ezért nem valószínű, hogy eredményeink a reagensek különbözőségét tükröznék. Elképzelhető, hogy az artériás és vénás endothelsejtek eltérő reakcióit kell a háttérben keresnünk; ez az atheroscleroticus plakk fejlődése szempontjából rendkívül fontos lehet, figyelembe véve a vasa vasorum venuláin keresztül lezajló leukocytamigrációt.
 


Structure and function study of CRP on endothelial cells
C-reactive protein (CRP) became one of the most studied molecula of the inflammatory reaction. CRP is the prototype acute phase protein and is a very good marker of the prediction of coronary heart diseases. On the other hand, there are more and more data available on the conformational changes in the molecule and the parallel changes in substrate specificity.
Our aim was to study the effects of three different conformational variant of CRP on endothelial cells.
ELISA, cellular ELISA, deconvolution microscopy, confocal laser scanning microscopy, PAGE, Western-blot and Limulus Amoebocyte Assay were used in the experiments.
First, we characterized the available CRP molecules (native: nCRP, recombinant modified: C-rmCRP, urea modified: U-mCRP) and LPS contamination was excluded. Cytotoxicity of different CRPs were tested, and none of them found to be toxic upto 100 µg/ml concentration.
Human umbilical cord vein endothelial cells (HUVECs) were cultured in vitro, then treated with the three types of CRP molecules. Only C-rmCRP bound to the cell surface of HUVECs, followed by internalization even at 10 µg/ml concentration. Despite of these findings none of the CRPs could change the proliferation capacity of the cells. None of them induced ICAM-1, VCAM-1 or E-Selectin adhesion molecule expression, IL-8 or MCP-1 production.
Changes in the structure of CRP also mean changes in substrate specificity, which were supported by our experiments, too. The modified CRP induced adhesion molecules and cytokines in artery endothelial cells according to the literature. We could not show out such changes in vein endothelial cells, although we demonstrate binding to the cell surface. LPS contamination was excluded in the case of artery endothelial cells, too, so the differences in the quality of the reagents may not reflect the differences found between cell types. The differences between artery and vein endothelial cells can explain these findings, which may be rather important in the development of atherosclerotic plaque, because vasa vasorum vein could be the main entrance of the leukocytes into the plaque.
 


20. Bakteriofág-felszínen megjelenített (fágdiszplay) expressziós könyvtárak és alkalmazásaik az immunológiai kutatásban (E10)

Czömpöly Tamás, Németh Péter
Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Immunológiai és Biotechnológiai Intézet

A bakteriofág-felszíni megjelenítés a rekombináns peptidek és proteinek valamely fág köpenyfehérjéhez fuzionáltatott expresszióját jelenti. A technika nagy előnye, hogy, fizikai kapcsolat áll fenn a bemutatott fehérje és az azt kódoló nukleinsav között, lehetővé téve az ismételt affinitásszelekciót és az azt követő sokszorosítást.
Az első sikeres rendszert a filamentózus fágfelszínen megjelenített random peptidkönyvtárak jelentették, amelyek a monoklonális ellenanyagok epitóptérképezésében terjedtek el. A további alkalmazások között fehérje-fehérje interakciókban részt vevő molekulaszakaszok azonosítása, enzimszubsztrátok és -inhibitorok kifejlesztése, vakcinák előállítása szerepel.
Lehetőség nyílt antitestfragmentumok filamentózus fágfelszínen való megjelenítésére is. Ezzel a technikával nagy antitestfragmens-repertoárokból különböző szelekciós technikákat alkalmazva kiválaszthatók szelektív kötésre képes klónok, amelyek affinitása mutagenezis-technikákkal tovább fokozható.
A filamentózus fágok mellett más bakteriofágokon (l fág, T7 fág, T4 fág) is lehetséges idegen fehérjéket megjeleníteni. Ezek a bakteriofágok – eltérő életciklusuk miatt – a filamentózus fágokhoz képest hosszabb fehérjék megjelenítésére képesek. A l fágokat felhasználva antigénfragmens- és cDNS-könyvtárak is létrehozhatók. Az antigénfragmens-könyvtárak segítségével különböző humán szérumoknak adott antigénen való epitóp térképezése is végrehajtható. A l-fág-felszínen megjelenített cDNS-könyvtárak a fehérje-fehérje interakciók feltérképezésében, illetve új fehérjék azonosításában nyújthatnak segítséget.
Eredményeink alapján a bakteriofág-felszíni megjelenítésen alapuló technikák széles körben alkalmazhatók – monoklonális és poliklonális ellenanyagok epitóptérképezése, antitestfragmensek, cDNS könyvtárak – az immunológiai kutatásban.
 


Phage display libraries: principle and applications in immunology
Phage display is based on the expression of recombinant peptides and proteins fused to a phage coat protein. The genetic information encoding for a molecule is physically linked to its product, making the repeated affinity selection and following propagation possible.
The first successful system displayed a library of random peptides on filamentous phage. This system is widely employed in the epitope mapping of monoclonal antibodies. Further applications include the identification of molecule surfaces participating in protein-protein interactions, developing enzyme substrates and inhibitors, vaccine development.
The display of antibody fragments on filamentous phage is also feasible. Using this technique for the selection of complex antibody fragment repertoires, it is possible to clones capable of selective binding. The affinity of these clones can be improved with mutagenic techniques.
In addition to the filamentous phage it is possible to express recombinant peptides or proteins on other types of bacteriophages (phage l, T7 phage, T4 phage). Because of their life cycle differs from that of filamentous phage, these phages are capable of displaying longer proteins. We constructed antigen fragment libraries and cDNA libraries displayed on phage l. With the use of antigen fragment libraries, the epitope mapping of human sera on a given antigen is possible. The phage displayed cDNA libraries could turn to a useful tool in the mapping of protein-protein interactions and in the search for new proteins. Based on our results phage display technology has a broad range of applications (epitope mapping of monoclonal and polyclonal antibodies, antibody fragments, cDNA libraries) in immunological research.
 


21. A marginális zóna macrophagalcsoportjainak jelentősége az egérlép regionális szöveti szerveződésében (P20)

Czömpöly Tamás1, Pikkarainen Timo2, Balogh Péter1
1
Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Immunológiai és Biotechnológiai Intézet, 2Karolinska Institute, Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Stockholm, Svédország
 
Anatómiai helyzeténél fogva a lép marginális zónája (MZ) kitüntetett szerepet játszik a véráram útján terjedő kórokozók elleni védekezésben. A marginális zóna sejtjei – B-sejtek, macrophagok, dendritikus sejtek – közül a macrophagok jellemzésére monoklonális ellenanyagokat (mAb) állítottunk elő (IBL-12 és IBL-13). E két ellenanyag reaktivitása alapján két különböző macrophagalcsoportot tudtunk azonosítani. Az IBL-12-pozitív macrophagok a marginális sinushoz képest a vörös pulpa felé helyezkednek el, míg az IBL-13-pozitív sejtek ehhez képest a fehér pulpához közelebbi rétegben találhatók. Ezen alcsoportok regionális elhelyezkedésének ontogenetikai vizsgálata szerint az IBL-12-pozitív sejtréteg korábban jelenik meg a postnatalis fejlődés során (a harmadik napon); ezt 7–10 napnyi eltolódással követi az IBL-13-pozitív alcsoport felnőtt típusú elrendeződési mintázatának a kialakulása. Macrophagkolónia-stimuláló faktorban (CSF-1) hiányos, osteopetrosis op/op egerekben mindkét sejtcsoport megjelenését gátoltnak találtuk. A két alcsoport funkcionális jellemzésére felnőtt egereken végzett vizsgálataink eredményei szerint az IBL-12-pozitív macrophagok kötik a fluoreszcensen jelölt Staphylococcus aureust, s ezt az IBL-12 monoklonális ellenanyaggal végzett előkezeléssel nem tudtuk gátolni. LPS-kezelés hatására az IBL-12 marker a vörös pulpamacrophagokon is megjelent, míg az IBL-13-pozitív sejtek nagy része a kezelés hatására a nyiroktüsző felé mozdult el.
Az IBL-12 által felismert antigénről a szöveti expresszió és LPS-indukálhatóság alapján feltételeztük, hogy azonos a scavenger receptorcsaládba tartozó, MARCO (macrophage receptor with collagenous structure) nevű fehérjével. Ezt emlőssejtekben végzett MARCO-expresszióval igazoltuk. Az IBL-12- és IBL-13-antigének funkcionális jellemzésére az egyes antitesteknek a marginális zóna B-sejt-készlete szerveződésére gyakorolt hatását vizsgáltuk áramlási citometriával és többszörös jelöléses immunhisztokémiai módszerekkel. Eredményeink szerint mindkét ellenanyag a marginális zóna B-sejtjeinek mobilizációját indukálta. Feltételezhető, hogy a két macrophagalcsoport közösen vesz részt a B-sejt-készlet helyi orientálódásának irányításában.
Az ETT 592/2003 által támogatva.
 


Marginal zone macrophage subsets and their importance in the regional tissue organisation of the mouse spleen
Due to its strategic location, the splenic marginal zone (MZ) plays a major role in the defence against blood-borne pathogens both in human and mouse. Of the various cell types comprising the MZ (specialised B-cells, macrophages and dendritic cells), we raised rat monoclonal antibodies against its distinct macrophage subsets (mAbs IBL-12 and IBL-13) to study their characteristics in mice. These mAbs identify two different MZ macrophage subsets. The IBL-12 positive cells are located primarily between the marginal sinus and the region of MZ adjacent to the red pulp, whereas the IBL-13 positive cells are distributed at the white pulp-proximal aspect of the marginal sinus within the MZ. In our ontogenic studies we found that the IBL-12-positive cell layer appears several days before the IBL-13 positive subset would establish its adult-type pattern. Osteopetrotic op/op mice deficient for macrophage colony stimulatory factor-1 (CSF-1) showed a near-complete lack of both cell populations. In our functional studies we found that the IBL-12 positive MZ macrophages selectively bind St. aureus following intravenous injection, but the treatment of mice with IBL-12 mAb prior to the adminstration of bacteria did not interfere with this binding. Furthermore, treatment of mice with LPS induced the expression of IBL-12 marker by red pulp macrophages, whereas a large fraction of IBL-13 positive macrophage subset was induced to migrate towards the deeper parts of follicles.
Based upon its tissue distibution and LPS-inducibility, we hypothesised that the IBL-12 marker may be related to or identical with the macrophage receptor with collagenous structure (MARCO) glycoprotein. This interpretation was confirmed by the transient expression and flow cytometric demonstration of MARCO by mammalian cells. We also investigated the effect of in vivo treatment with anti-MZ macrophage subset mAbs on the size and organisation of MZ B-cells using flow cytometry and multiple label immunohistochemistry. The administration of either of these mAbs could induce the mobilisation and departure of MZ B-cells. Our findigs indicate that both MZ macrophage subsets are involved in the regulation of local orientation and distribution of MZ B-cells.
 


22. Az anti-C1q antitest és a szolúbilis komplementreceptor 1-hez kötött, keringő immunkomplexek emelkedett szintje Sle-ben
(E26)

1Csípő István, 1Kiss Emese, 1Baráth Sándor, 2Bakó Éva, 1Zeher Margit, 1ifj. Sipka Sándor, 1Szegedi Gyula, 1Kávai Mária
Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum, 1III. Sz. Belgyógyászati Klinika, 2Regionális Immunbiológiai Laboratórium
 
Az anti-C1q antitestek (aC1q) és az immunkomplexek fontos szerepet töltenek be a szisztémás lupus erythematosus (SLE) patogenezisében. Az aC1q előfordulása gyakran veseérintettséggel párosul. A keringő immunkomplexek olyan konglomerátumok, amelyeket az antigének és antitestek mellett komplementkomponensek – köztük C3b és C1q – alkotnak. A komplementreceptor 1 szolúbilis formája (sCR1, CD35) és az aC1q – a C3b és a C1q révén – szintén alkotórészei lehetnek az immunkomplexeknek. Nem ismert viszont, hogy milyen összefüggés áll fenn az aC1q és az sCR1-CIC között.
Jelen munkánkban azt kívántuk meghatározni, milyen kapcsolat van az aC1q és az sCR1-CIC, továbbá más komplementkomponensek (C3, C4, CH50), autoantitestszintek (anti-ds-DNS, anti-ENA), valamint a betegség aktivitása között (SLEDAI-index). Az aC1q-, az sCR1-CIC-, az anti-ds-DNS-, az anti-ENA-szinteket ELISA-módszerrel vizsgáltuk. A C3-at, C4-et nefelometriával mértük, a CH50-értékeket hemolitikus teszttel állapítottuk meg.
Az aC1q- és az sCR1-CIC-szint szignifikánsan magasabb volt az SLE-ben szenvedő betegek szérumában, mint az egészséges kontrollokéban (p<0,001 és p<0,001). Pozitív aC1q- és sCR1-CIC eredményt találtunk a betegek 39,2%-ánál, illetve 41,0%-ánál. Az aC1q-szint szignifikáns pozitív korrelációt mutatott az sCR1-CIC-szintekkel (p<0,001), az anti-ds-DNS- (p<0,01), anti-ENA- (p<0,05) szintekkel és az SLEDAI-pontok (p<0,01) értékével. Negatív korreláció mutatkozott a C3-, CH50- (p<0,001) és C4- (p<0,005) értékekkel.
Eredményeink alapján elmondhatjuk, hogy az aC1q-szint meghatározása hasznos a betegség aktivitásának megállapításánál az anti-ds-DNS és a hagyományos komplementtesztek eredményeivel együtt. Ugyanakkor az aC1q és sCR1-CIC korrelációja arra utal, hogy a keringő (és a lerakódott) immunkomplexek egyaránt tartalmaznak anti-C1q-antitestet és sCR1-et is.
 


Elevated levels of antibodies against C1q and sCR1 bound circulating immune complexes in patients with sle
Anti-C1q antibodies (aC1q) and immune complexes are known to be involved in the pathogenesis of systemic lupus erythematosus (SLE).
C1qab are found frequently in SLE and are associated with renal involvement. Circulating immune complexes (CIC) are heterogenous particles consisting of antigens, immune globulins and complement components, including C3b and C1q. The soluble form of complement receptor 1 (sCR1, CD35) and anti-C1q can also be parts of immune complexes through C3 and C1q. The association of aC1q levels with soluble complement receptor 1 bound circulating immune complexes (sCR1-CIC) has not been examined. The aim of this study was to investigate the relationship between the presence and titer of aC1q and sCR1-CIC, as well as other complement parameters (C3, C4, CH50), autoantibodies (anti-ds-DNA, anti-ENA) and disease activity (SLEDAI index).
Anti-C1q, sCR1-CIC, anti-ds-DNA, anti-ENA levels were investigated by ELISA method. Activation of classical complement pathway was measured by hemolytic test while C3 and C4 were detected using nephelometer.
Serum concentration of aC1q and sCR1-CIC were found to be higher in SLE patients than in healthy controls (p<0.001 and p<0.001). High titer of aC1q (29/74; 39.2%) and sCR1-CIC (25/61; 41.0%) were measured in our patients. Serum levels of aC1q showed a significant positive correlation with sCR1-CIC levels (p<0.001), anti-DNA (p<0.01), anti-ENA (p<0.05), levels and SLEDAI scores (p<0.01). Negative correlation was found with C3, CH50 (p<0.001), C4 (p<0.005).
Determination of anti-C1q antibody is useful to show disease activity in SLE together with anti-ds-DNA and other traditional complement tests. Moreover, the correlation with sCR1-CIC suggests that circulating (and deposited) immune complexes contain both aC1q and sCR1.



23. A C1q hatása a humán dendritikus sejtek érésére
(E15)

Csomor Eszter1, Erdei Anna1, Bajtay Zsuzsa1, Thiel Steffen2, Arlaud Gerard J.3
1Eötvös Loránd Tudományegyetem, Immunológiai Tanszék, Budapest; 2Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Aarhus, Dánia; 3Laboratoire d’Enzymologie Moléculaire, Institute de Biologie Structurale, Grenoble, Franciaország
 
A dendritikus sejtek (DC) a naiv T-sejtek felé megnyilvánuló antigénprezentációs képességük révén kapcsolatot teremtenek a természetes és az adaptív immunrendszer között. A dendritikus sejtek érési folyamata során csökken az antigénfelvételhez szükséges sejtfelszíni receptorok (például: mannózreceptor, Toll-like receptor) száma, ugyanakkor növekszik az MHC II, a kostimulátormolekulák (CD80, CD86) és a CD83 érési marker expressziója.
A dendritikus sejtek érését – amely elengedhetetlen a T-sejt-aktiváció kiváltásához – többek között a gyulladás során felszabaduló citokinek, kórokozó eredetű molekulák (például LPS) és felszínhez kötött IgG válthatják ki (J Immunol 2003;170:3963.).
In vivo az antigén a szervezetben olyan immunkomplex formájában fordul elő, amelyben az ellenanyag mellett számos komplementfehérje is jelen van. Ezért megvizsgáltuk, hogy a C1q, és a hozzá szerkezetileg hasonló MBL miként befolyásolja a dendritikus sejtek érési folyamatait. Vizsgálataink során az in vitro IL-4 és GM-CSF hatására monocytából öt nap alatt éretlen dendritikus sejtekké differenciálódott sejteket 35 µg/ml koncentrációjú C1q-val, illetve MBL-lel fedett felszínen tenyésztettük további két napig. A kontrollmintákban LPS-t adtunk az éretlen sejtekhez. A tenyésztés hetedik napján a dendritikus sejteket a sejtfelszíni molekulák – CD83, CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), mannóz-R, MHC II – expressziója alapján citofluorimetriás mérésekkel jellemeztük, továbbá funk- cionális tesztekben (allogén T-sejt-aktiváció, citokintermelés mérése ELISA-val) vizsgáltuk aktivitásukat.
Eredményeink azt mutatják, hogy az éretlen dendritikus sejteket C1q-val fedett felületen két napig tenyésztve, azok érett sejtté differenciálódnak; ugyanakkor MBL hatására nem észlelhető változás. C1q hatására az érés mértéke megközelítette az LPS hatására bekövetkezett változásokat. Ellentétben az MBL-lel, a C1q-molekula jól kötődik az éretlen dendritikus sejtekhez, és az érés során fokozatosan csökken. A C1q-val fedett felületen éretté vált dendritikus sejtek által termelt IL-6, IL-10 és IL-12 koncentrációja, továbbá a T-sejt-aktiváció mértéke megközelítette az LPS hatására szekretálódott citokinek mennyiségét, illetve a T-sejt-aktiváció hatékonyságát; MBL hatására nem volt jelentős változás az éretlen sejtekhez képest.



Immobilized C1q induces maturation of human monocyte-derived dendritic cells

Dendritic cells (DCs) link innate and adaptive immunity by their ability to present antigens to naive T lymphocytes. During their development to mature DC expression of receptors required for phagocytosis (e.g. mannose-receptor) are down-regulated, while MHCII and CD83 proteins as well as co-stimulatory molecules such as CD80 and CD86 are up-regulated.
Maturation of DC, a decisive step to initiate T-cell activation, is known to be induced by several stimuli, including inflammatory cytokines, microbial products (e.g. LPS) and immobilized IgG. Since immune complexes occuring in vivo contain C1q as well, our aim was to study whether this complement protein and its structurally related molecule MBL influence maturation of DC. Immature DCs were generated from human monocytes in the presence of IL-4 and GM-CSF, and on day five the cells were transfered to plates coated with any of the complement proteins used at 35 µg/ml. As control, LPS was added to the cells. On day seven DCs were characterized by expression of various cell membrane molecules using cytofluorimetry, by their cytokine secretion pattern utilizing ELISA systems and by the cells’ efficiency to activate allogeneic T lymphocytes, measured by thymidine incorporation.
We found, that immobilized C1q, but not MBL induces maturation of DCs to a similar extent as LPS. Interaction of C1q with immature DCs was strong and decreased with maturation of the cells, while we could not detect binding of MBL to DC. IL-6, IL-10 and IL-12 secretion and T-cell stimulation by DCs cultured on immobilized C1q were almost as high as in the case of LPS-stimulated cells, with no detectable effect by cells cultivated in the presence of MBL. Interestingly however, TNF-a-secretion, when compared to non-treated DC, was appr. 4× higher in the case of cells cultivated on MBL, while it was negligible by cells cultured on C1q-coat.
Further studies aiming to elucidate the events of C1q-induced maturation of DCs are in progress and results will be presented.
 


24. A membránceramid-szignál és a T-sejt-aktiváció gátlása: a hatás hátterében álló mechanizmusok vizsgálata (P1)

Detre Cynthia1, Kiss Endre1, Ludányi Katalin2, Panyi György3, Rajnavölgyi Éva2, Matkó János1
1Eötvös Loránd Tudományegyetem, Immunológiai Tanszék, Budapest; Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum, Általános Orvostudományi Kar, 2Immunológiai Intézet, 3Biofizika és Sejtbiológia Intézet
 
A lymphocyták plazmamembránjából (PM) a különféle (Fas-, TNF-a-, IL-1b-, stressz-) szignálok során aktiválódó szfingomielinázok hatására képződő ceramid (CER) a mitochondrialis apoptózis-jelpálya egyik alapvető mediátora. Újabb adatok a felszabaduló ceramid számos egyéb membránhatását írták le, mint például csatornaképzés, a membránraftok átrendezése stb. Korábban bemutattuk, hogy a ceramid magas dózisa, valamint hosszabb stimulusa esetén a T-lymphocyták jelentős mértékű apoptózisa következik be, s ebben a mitochondrialis útvonal is érintett. Ugyanakkor gyengébb, rövid (10 perces) stimulus esetén – amely nem okoz szignifikáns apoptózist a kezelt sejtekben – a ceramid képes a T-lymphocyták antigénpecifikus aktivációjának dózisfüggő gátlására.
Tekintettel arra, hogy a ceramidszignálok és a T-sejtek jelátvivő rendszere közötti kapcsolat részletei korántsem ismertek, jelen munkánk során egér helper- és humán lymphoma T-sejtvonalakon vizsgáltuk a ceramid fent említett gátlóhatásának hátterében álló lehetséges mechanizmusokat. A rövid láncú C2-ceramid (N-acetil-D-szfingozin) dózisfüggő módon mindkét T-sejt plazmamembrán-depolarizációját kiváltotta, a fiziológiás ceramidfelszabadulást szimuláló exogén szfingomielinázkezeléshez hasonlóan. Emellett a T-sejtek membránját fluidizálta is. Vizsgáltuk továbbá a ceramidkezelés, illetve a ceramid felszabadulását kiváltó Fas-szignál esetén a T-sejtek raft-mikrodoménjeinek, illetve halálreceptorainak sejtfelszíni eloszlását. A C2-ceramid enyhén emelte a sejtek intracelluláris Ca2+-szintjét, ezt EGTA-val gátolni tudtuk. Érdekes módon, szemben az APC-vel történő antigénspecifikus, vagy az anti-CD3-mal kiváltott T-sejt-aktivációval, a ceramid nem befolyásolta a SERCA ATP-áz gátlószerével, a tapszigarginnal kiváltott intracelluláris kalciumjelet. Ez arra utal, hogy a ceramid valószínűleg valamilyen „upstream” aktivációs mechanizmusra hatva fejti ki gátlóhatását.
Az antigénspecifikus aktiváció egyik korai eseménye a tirozinfoszforiláció; ez kritikus meghatározója a TcR-mediált szignálerősségnek, illetve szabályozza a kalciumjel hosszát és erősségét meghatározó, Kv1.3 feszültségvezérelt ioncsatornákat is. Western blot-technikával megfigyeltük az aktivációra bekövetkező Erk1/2-foszforiláció csökkenését és a konstitutív, valamint az indukált Akt-foszforiláció teljes gátlását. Kimutattunk egy körülbelül 55 kDa molekulatömegű, ceramid hatására tirozinon foszforilálódó fehérjét, amely valószínűleg azonos a Kv1.3 ioncsatornával. Eredményeink arra utalnak, hogy a TcR- és ceramidszignálok között a T-sejt-aktiváció korai fázisában alakulhat ki egy gátló „cross-talk”. További vizsgálatokat folytatunk a ceramidnak a K+-ioncsatornák funkcionális tulajdonságaira – aktivációs, inaktivációs kinetikára, áramamplitúdóra – gyakorolt közvetlen hatásainak tisztázására.
A munka a T034393 OTKA pályázati támogatás segítségével készült.

Inhibition of antigen-specific T-cell activation by ceramide: searching for the underlying mechanisms

Ceramides (CER) released in the plasma membrane (PM) of lymphocytes by sphingo-myelinases activated through different stimuli (e.g. Fas, TNF-a, IL-1, stress signals) are known as essential mediators of the mitochondrial apoptosis pathway. Recent data described some novel membrane-effects of CER, such as formation of membrane channels, rearranging the structure of membrane rafts, etc. Earlier we reported on strong T-cell apoptosis evoked by high dose and long duration treatment with short chain C2-ceramide. On the other hand, we observed a dose-dependent inhibition of the Ag-specific T-cell activation by CER under conditions (short 10-15 minutes treatment) where no significant apoptosis was induced.
Since the relationship between CER-signals and the T-cell activation machinery is poorly understood, the present study aimed at investigating the mechanisms underlying the CER-mediated inhibition of T-cell activation. C2-CER induced a rapid dose-dependent depolarization and fluidization in both the mouse T helper (IP12-7) and the human T lymphoma (Jurkat) cell lines. We also investigated the effect of CER on the cell surface distribution of membrane rafts and death receptors (Fas). CER weakly increased the cytosolic free Ca2+ level in these cells, which was inhibitable by EGTA. In contrast to the inhibition observed in the Ca2+-signals evoked by APC or anti-CD3 antibody, CER did not inhibit the intracellular Ca2+-elevation induced by thapsigargin, an inhibitor of SERCA Ca2+-ATPase. This suggests that the ’site of inhibition’ is likely upstream of the IP3-mediated Ca2+-release from the ER.
Membrane-proximal tyrosine phosphorylation is an early step of TcR-mediated signaling determining the strength and duration of T-cell activation. Voltage-gated potassium channels (Kv1.3) expressed in T-lymphocytes are also known as critical regulators of the TcR-mediated Ca2+-signals. Using Western blot analysis we observed a decreased tyr-phosphorylation of Erk 1/2 and a full blockade of Akt phosphorylation by CER upon activating the T-cells through TcR. We also detected a protein (Mw: ~55 kDa) tyr-phoshorylated upon CER effect, that is likely the Kv1.3 ion channel itself. These data suggest that the CER signals may interefere with the TcR-signals in an early phase of T-cell activation in an inhibitory fashion and the CER-induced regulation of potassium channel Kv1.3 is involved in this process. Further studies on direct effects of CER on the function of Kv1.3 channels in T-cells are currently running.
This work was supported by OTKA (National Science Fund) grant T 034393.

25. A humán és a szarvasmarha-FcRn nehézláncának transzkripciós szabályozása
(E20)

Doleschall Márton1, Yaofeng Zhao2, Szalai Krisztina1, Mayer Balázs1, Hammarström Lennart2, Kacskovics Imre1
1Szent István Egyetem, Állatorvostudományi Kar, Élettani és Biokémiai Tanszék, Budapest; 2Department of Laboratory Medicine, Karolinska Institute, Stockholm, Svédország
 
A neonatalis Fc-receptor (FcRn) – az MHC I típusú fehérjékhez hasonlóan – egy nehézláncból és egy b2-mikroglobulin könnyűláncból áll. Az emberi FcRn a placentában és számos nyálkahártyában kifejeződik, többek között a vékonybélben és a tüdőben, valamint egyes szövetek kapillárisaiban. Az elmúlt években e receptort a szarvasmarhatőgyben, a vékonybélben, a tüdőben, valamint a vékonybél kapillárisaiban mutattuk ki. Míg az epithelsejtekben expresszálódó FcRn biztosítja az IgG ezen barriereken keresztüli transzportját, addig az endothelsejtekben szabályozza az IgG vérpályán belüli katabolizmusát. Mindezek alapján e receptor génexpressziós szabályozásának befolyásolása klinikai szempontból kiemelt jelentőségű lehet.
Bár a génexpresszió szabályozása több szinten valósul meg, ennek egyik legfontosabb eleme a transzkripciós szabályozás. Az emberi FcRn-nehézlánc (hFcRn) promoterszekvenciáját korábban már meghatározták, a szarvasmarha-FcRn-nehézlánc (bFcRn) genomikus szekvenciáját, és ezáltal a promotert (–1802 bp) a közelmúltban izoláltuk. A transzkripciós elemzésekhez különböző hosszúságú hFcRn- és bFcRn-promoter luciferáz-riportergén expressziós vektorokat állítottunk elő, s ezeket transzkripciós faktort expresszáló konstrukciókkal együtt különböző sejtvonalakba transzfektáltuk, majd a sejtek luciferázaktivitását Dual-luciferase Reporter Assay System (Promega) technikával mértük.
NFkB hatására mind a hFcRn, mind a bFcRn promoteraktivitása nő, az NfkB-induktivitást a hFcRn-promoter –305-től –74 bp-ig, a bFcRn-promoter –1112-től –528 bp-ig terjedő szakasza hordozza. A lehetséges NfkB-kötőhelyek kötőképességét a megfelelő konstrukciókban PCR alapú site-directed mutagenezissel töröltük, így a promoterek indukálhatósága csökkent vagy megszűnt. A funkcionálisan aktív kötőhelyeknek és azok mutált változatainak kötőképességét – Electrophoretic Mobility Shift Assay technikával (EMSA) – szintén teszteltük.
Mindezek az eredmények arra utalnak, hogy a humán és a szarvasmarha-FcRn expresszióját a fertőzés és gyulladások szempontjából kiemelt jelentőségű transzkripciós mechanizmus befolyásolja.
 


Analysis the transcriptional regulation of the human and bovine FcRn heavy chains
The neonatal Fc receptor (FcRn), like other MHC class I molecules, is composed of a heavy and a light chain (b2-microglobulin). The human FcRn is expressed in the placenta and in several mucosae, like the small intestine and lung, and additionally in capillary endothelial cells. We have recently detected this receptor in the bovine mammary gland, small intestine and the lower respiratory system and also in the endothelial cells of the small intestinal capillaries. While epithelial FcRn is involved in IgG transport through these barriers, this receptor in the endothelial cells is responsible to regulate the IgG catabolism in the bloodstream. Due to these crucial immunological functions the influence of the FcRn gene regulation could be highly important in the clinics.
Although, gene expression is controlled at multiple levels, one of the most important is transcriptional regulation. The sequence of the human FcRn heavy chain promoter is published and we have recently isolated a genomic segment containing the bovine FcRn heavy chain. We have sequenced and isolated the 5’-flanking sequence of the bovine FcRna chain gene (–1802 bp). Several luciferase reporter constructs have been generated of the human and bovine promoter segment at different lengths. They were transfected into numerous cell lines and their luciferase activity was analyzed by the Dual-luciferase Reporter Assay System (Promega).
We have found, that NFkB induces both the human and bovine promoters, and the regions that are responsible for this upregulation is between –305 to –74 bp and –1112 to –528 bp in the human and bovine promoters, respectively. The possible NFkB binding sites were erased by PCR based site-directed mutagenesis, which reduced or eliminated induction. The possible binding sites and their mutated variants were also tested in electrophoretic mobility shift assay (EMSA).
Together these findings indicate that human and bovine FcRn is under the control of an important transcriptional pathway, which is activated during infection and inflammation.



26. A SAP családba tartozó adaptormolekulák Src-kinázokkal való interakcióinak vizsgálata
(P2)

Erdős Erika, Rajnavölgyi Éva, Lányi Árpád
Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum, Immunológiai Intézet
 
A SLAM fehérje (signaling lymphocytic-activation molecule) aktivált T-sejteken, NK-sejteken és dendritikus sejteken kifejeződő, homoasszociációra képes koreceptor; fontos szerepet tulajdonítanak neki a naiv T-sejtek Th1- vagy Th2-effektorsejtek irányába történő differenciációjának szabályozásában. A SLAM szabályozófunkciója a SAP (SLAM-associated protein) adaptormolekula-család fehérjéinek közvetítésével érvényesül, mivel a SLAM foszforilációját végző Src-kinázok kapcsolódása és szabályozása az ebbe a családba sorolható SAP és EAT-2 proteinek ellenőrzése alatt áll. A SLAM közvetítette szignálút fontosságára utal, hogy a SAP funkciójának kiesése fatális immundeficientia – XLP (X-linked lymphoproliferative disease) tünetegyüttes – kialakulásához vezet. Szerkezeti adatok szerint a SAP fehérje kölcsönhatása a Fyn-kináz SH3-doménjével stabilizálja az enzim nyitott, aktív konformációját, majd elindítja a SLAM által kiváltott jelátviteli folyamatokat. A SAP nemcsak az SH3-, hanem a kinázdoménen keresztül is képes kötődni a Fyn-kinázhoz; ennek az interakciónak a funkcionális jelentősége máig nem tisztázott.
Kísérleteink során arra kerestük a választ, hogy a SLAM-receptorral együtt kifejeződő Src-kinázok közül a Fyn mellett még melyek képesek a SAP- és az EAT-2-molekulákkal kölcsönhatásba lépni. Ebből a célból olyan plazmidokat készítettünk, amelyek az általunk kiválasztott Src-kinázokat (Fyn-, Hck-, Lyn-, mFgr- és Lck-kináz), továbbá azok SH3- vagy kinázdoménjeit expresszálják élesztő- vagy emlőssejtekben (293T fibroblast). Élesztő kettős hibridrendszerben kimutattuk, hogy valamennyi enzim a kinázdoménen keresztül köti a SAP- és az EAT-2-molekulákat. Mutáns enzimeket kódoló konstrukciók felhasználásával azt igazoltuk, hogy a Lyn- és a Hck-kináz funkciójának elvesztéséhez vezető pontmutációk (Lyn K275D, Hck K269E) az interakció megszűnését eredményezik. A SAP/Fyn-SH3 kötéshez hasonló kölcsönhatást azonban az általunk vizsgált Src-kinázokkal nem sikerült kimutatni. A SAP- és EAT-2-molekulák kinázdoménekkel való interakciója felveti egy eddig ismeretlen kinázdoménfüggő regulációs mechanizmus létezésének lehetőségét, amely által szabályozható az Src-kinázok aktivációja.
 


Investigation of interactions between adaptor molecules of SAP family and Src kinases
SLAM (Signaling Lymphocytic-Activation Molecule) is a self-ligand co-receptor expressed on activated T-lymphocytes, NK-cells and dendritic cells and has a major role in regulating the differentiation of naive T-cells into TH1 or TH2 effector cells. This regulation is implied by the adaptor molecules of the SAP family (SLAM-Associated Protein). Association and regulation of Src kinases phosphorylating SLAM are controlled by molecules of this family, SAP and EAT-2. Disfunction of SAP leads to a fatal immundefficiency called XLP (X-Linked Lymphoproliferative Disease) which underscore the importance of the SLAM mediated signaling pathway. Structural data suggest that association between SAP and the SH3 domain of Fyn kinase stabilizes the open, active conformation of the enzyme which in turn induces the SLAM mediated signaling pathways. SAP can associate with Fyn not only through the SH3 domain but through the kinase domain as well. The biological concequences of this interaction is still unknown.
We investigated which of the Src kinases expressed together with SLAM besides Fyn can associate with SAP and EAT-2 molecules by creating a large set of constructs expressing Src kinases (Fyn, Hck, Lyn, mouse Fgr and Lck) and their SH3 and kinase domains respectively in yeast and mammalian cells (293T fibroblast). In yeast two-hybrid system we found that all of the enzymes associate with SAP and EAT-2 through their kinase domains. Using the constructs expressing mutant proteins we confirmed that the point mutations of Lyn and Hck kinases (Lyn K275D, Hck K269E) abrogate these interactions. EAT-2A or EAT-2B does not seem to take part in interactions similar to those found between SAP and the Fyn-SH3 domain. However, interaction of SAP and EAT-2 with the kinase domains (of Src kinases) suggest that a yet unknown, kinase domain-dependent mechanism may exist to regulate Src kinase activity.



27. IRAK-4-mutáció szelektív anti-poliszacharid antitest-deficientiában (SAPAD)
(E14)

Erdős Melinda1, Cheng-Lung Ku2, Bossuyt Xavier3, Casanova Jean-Laurent2, Maródi László1
Debreceni Orvos- és Egészségtudományi Centrum, 1Infektológiai és Gyermekimmunológiai Klinika, Debrecen; 2Pediatric Immunology-Hematology Unit and Laboratory of Human Genetics of Infectious Diseases, University of Paris René Descartes, INSERM U550, Párizs, Franciaország; 3Kísérletes Orvostudományi Laboratórium, Egyetemi Kórház, Leuven, Belgium

A jelenleg hatéves fiúgyermeket hároméves korában jobb oldali, purulens coxitis, öt és fél éves korában purulens meningitis miatt kezeltük. A súlyos, invazív fertőzéseket a Strecptococcus pneumoniae 14-es szerotípusa okozta. Célzott antimikróbás kezeléssel a beteg mindkét fertőzésből maradványtünetek nélkül gyógyult. A rutin immunkémiai és sejtes immunológiai vizsgálatok ismert immundeficientiára nem utaltak, specifikus anti-poliszacharid antitestválaszt azonban a visszatérő infekciók és pneumococcusvakcinák adása ellenére sem tudtunk mérni a szérumban. IL-1b-stimulálásra a beteg perifériás vérsejtjei és fibroblastsejtjei nem termeltek IL-6-ot, Western blot- és RT-PCR-vizsgálattal IRAK-4-fehérjét és RNA-t nem tudtunk kimutatni. Genomikus DNS-analízissel az IRAK-4 génen összetett heterozigóta mutációt találtunk. Eredményeink arra utalnak, hogy a SAPAD hátterében – a korábbi közlésekkel ellentétben – IRAK-4-deficientia is állhat.
 


Invasive pneumococcal disease with IRAK-4 deficiency and anti-polysaccharide antibody deficiency
We report here a 6-year-old male patient with recurrent respiratory tract infections and invasive pneumococcal diseases. There is no history of consanguinity or immunodeficiency in the family. The patient received routine immunization (BCG, H. influenzae conjugate vaccine, diphtheria toxoid, tetanus toxoid, whole pertussis vaccine, and oral polio) with no complication. At ages three and five he developed purulent hip joint infection and bursitis in the right m. iliopsoas and purulent meningitis, respectively, caused by S. pneumoniae type 14. Blood cell numbers, lymphocyte subpopulations, hemolytic activity of complement, bactericidal capacity of granulocytes, serum immunoglobulin isotypes, and IgG subclasses were normal or slightly elevated. However, the patient demonstrated poor antibody responses to tetanus and diphtheria toxoids and H. influenzae type b conjugate vaccine, and a lack of response to plane polysaccharide antigens after challenge with a 23-valent pneumococcal vaccine. Blood cells produced negligible amounts of IL-6 (104 and 73455 pg/ml blood in Pt and control, respectively) and IL-10 (2 and 315 pg/106 mononuclear cells in Pt and control, respectively) in response to stimulation with 50 ng/ml IL-1b. In contrast, the patient’s blood cells showed normal IL-10 response to stimulation with TNF-a. In lymphoblastoid cells no IRAK-4 protein and IRAK-4 mRNA could be detected by Western and Northern blotting. These findings and published data suggest that genetically acquired IRAK-4 deficiency may represent a heterogenous patient population with decreased anti-polysaccharide antibody production in some but not all patients. Further studies are under way to document the Ab response in more IRAK4-deficient patients.
 


28. Van-e immungenom? (E1)

Falus András1, 2, Buzás Edit1, 2, László Valéria1, Pállinger Éva2, Fülöp A. Kristóf1, Wiener Zoltán2, Keszei Márton1, Jelinek Ivett1, Szalai Csaba2
Semmelweis Egyetem, 1GSI Intézet, Magyar Tudományos Akadémia, 2Molekuláris Immunológiai Kutatócsoport, Budapest
 
Az immungenomika genomalapú, genomléptékű immunológiát, a genomikus adatbázisok, a nagy teljesítőképességű új technológiák és a bioinformatika felhasználását jelenti. Az immungenom a genom azon része – becslések szerint 5,7–6,1%-a, 180–195 Mb –, amely az immunválasszal kapcsolatos molekulák (antigénfelismerő molekulák, receptorok, hisztokompatibilitási molekulák, citokinek, komplementfehérjék, adhéziós fehérjék, Toll-receptorok stb) génjeit tartalmazza. Az összefoglaló az új tudományos irányzat, az alap- és klinikai immunológia genomikai megközelítésének gyorsulóan eredményes lehetőségét tárgyalja. Az előadás a legmeglepőbb, legújabb immungenomikai eredményekről mutat be egy csokorra valót. A referátumnak külön aktualitást ad az I. Immungenomikai Világkongresszus (2004. október 3–7., www.diamond-congress.hu/bci2004).
 


Does the immune genome exist?
Immunogenomics means genome-based immunology, based on genomic data banks, high through put new technologies and bioinformatics. The immune genome (appr. 5.7–6.1%, 180–195 Mb) consists of genes encoding for molecules related to the immune response (antigen recognising molecules, receptors, histocompatibility molecules, cytokines, complement proteins, adhesion molecules, Toll receptors etc.). The lecture summarizes the new perspectives of the quickly upcoming genomic approach in basic and clinical immunology updated by 1st International Conference on Basic and Clinical Immunogenomics 3–7 October, 2004, Budapest, Hungary (www.diamond-congress.hu/ bci2004). Some of the most sparkling and interesting results will be provided.
 


29. Humorális immunválasz hereditaer angioneuroticus oedemában (E27)

Farkas Henriette1, Németh Julianna2, Miklós Kata2, Szabó Zsófia2, Kleiber Mónika1, Németh Éva1, Visy Beáta3, Felvinczi Réka1, Széplaki Gábor1, Dóczy Márta1, Varga Lilian1
1Semmelweis Egyetem, Kútvölgyi Klinikai Tömb, 2Országos Gyógyintézeti Központ, Immundiagnosztikai Osztály, 3Fővárosi Önkormányzat, Madarász utcai Gyermekkórház-Rendelőintézet, Budapest
 
A komplementrendszer a veleszületett immunitás fontos része, azonban jelentős a szerepe az adaptív immunitásban is. Az elsődleges immunválasz és az immunmemória kialakulása szorosan összefügg a komplementrendszer működésével.
Célunk az volt, hogy tanulmányozzuk a humorális immunválaszt hereditaer angioneuroticus oedemás (HANO) betegeken, akikben a C1-inhibitor veleszületett hiánya miatt kórosan aktiválódik a komplementrendszer klasszikus útja.
A Magyarországi Angioödéma Centrumban gondozott 26 családból származó 90 HANO I. és nyolc HANO II. típusú kórképben szenvedő beteget vizsgáltunk (42 férfi, életkoruk: 4–53 év és 56 nő, életkoruk: 7–74 év). A betegek szérummintáiban egyrészt immunglobulin- (IgG/A/M) és IgG-alosztály-szinteket mértünk lézer nefelometriával, másrészt különböző baktériumok – Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae b, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae – elleni specifikus IgG típusú válaszképességet mértünk, ELISA- és nefelometria-módszerekkel. A szérumfehérjék kvalitatív elemzését kapilláris elektroforézissel végeztük. Eredményeinket a betegek klinikai paramétereinek tükrében értelmeztük.
A vizsgált betegcsoportban feltűnően nagy számban kaptunk emelkedett immunglobulin- – elsősorban IgM-, illetve IgG3- – szinteket (31, illetve 14 beteg). Emelkedett IgA-szintet hat, IgA-hiányt kilenc esetben (köztük egy négytagú családban) regisztráltunk. A poliszacharidtokos baktériumokkal (Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae b) szembeni specifikus immunválaszadás-képesség a betegek egy részénél csökkent volt. A diphtheria- és tetanustoxin elleni IgG-válasz nem sérült. A szérumok elektroforetikus vizsgálatakor nyolc beteg g-globulin-frakciójában homogén csíkot láttunk; emögött csupán két esetben igazoltunk monoklonális gammopathiát: egy IgG-l típusút, illetve egy monoklonális l könnyűláncot, bizonytalan nehézlánccal. Mindkét immunfixációval igazolt eltérés benignus gammopathiának felelt meg. Mind a poliklonális gammopathia, mind pedig a benignus monoklonális gammopathia eseteiben egyidejűleg C1-inhibitor-specifikus autoantitesteket tudtunk kimutatni a szérumokban. A betegség klinikai aktivitása és az emelkedett szérumimmunglobulin-szintek között párhuzamosságot figyeltünk meg.
Munkacsoportunk elsőként végzett nagyszámú HANO-ban szenvedő betegen immunszerológiai felmérést. Eredményeink alapján megállapíthatjuk, hogy a C1-inhibitor-hiány okozta betegség nem jár együtt az immunológiai válaszadás-képesség csökkent vagy sérült voltával. Vajon az immunológiai eltérések az infekciók leküzdésének alternatív útját biztosítják, vagy – ellensúlyozva a komplementfehérje-hiányt – a kóros immunreaktivitásban van szerepük?
Támogatás: ETT 194/2003 és ETT 522/2003.
 


Humoral immune response in patients with hereditaer angioneurotic edema
The complement system constitues an important part of the innate immune system, but plays an important role in the adaptive immune response. The primary antibody response and the formation of immunological memory are dependent on the activation of the complement system.
Our aim was to investigate humoral immune response related to the chronic/pathological/abnormal activation of complement system in patients with inherited C1 inhibitor deficiency.
In the study we have investigated 90 patients with HAE type I and eight patients with type II (42 male, 4–53 years and 56 female 7–74 years) belonging to 26 families. The patiens were followed up in the Hungarian HAE Center. The level of IgG, IgA, IgM and and IgG subclasses (IgG1-IgG4) were measured in the serum samples by laser nephelometry. For Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae type b, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae the specific immune response was assesed by ELISA or nephelometry. The concentration of serum proteins was measured by capillary zone electrophoresis. These laboratory results were evaluated in the context of the patients’ clinical status.
We have found eleveted levels of immunoglobulins frequently: IgM (31 cases), IgG3 (14 cases), IgA: (six cases). Deficiency of IgA was found in nine patients four out of them belonged to the same family. We have found a depressed antibody response against bacteria encapsulated with polysaccharides (Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae B), however immune response to diphtheria and tetanus toxoid was normal. We have found a localized spike on agarose electrophoresis of g-globulin fractions in eight patients, but monoclonal gammopathies were diagnosed in only two cases: an IgG type with l ligh-chain and a monoclonal l light-chain with an indefinite heavy-chain type. These abnormalities, which were confirmed by immunofixation, were benign monoclonal gammopathies. The presence of the specific autoantibodies to C1 inhibitor in the serum samples was detected in all polyclonal gammopathy and benign monoclonal gammopathy cases. The clinical activity of the patients with HAE correlated with the serum level of IgM.
This is the first study on humoral immunological status of a large number of patients with HAE. These data suggest that deficiency of C1 inhibitor does not result a defect of antibody response. Whether these alterations of the immunoglobulins provide an alternative to overcome bacterial infections or they have a pathological role on the host’s immunological reactivity, compensating deficiency of the complement proteins?
Supported by the grant numbers: ETT 194/2003 and ETT 522/2003.
 


30. Polyarthritisszel és mitralis valvulopathiával szövődött szisztémás hypocomplementaemiás urticariavasculitis sikeres kezelése leflunomiddal (P46)

Förhécz Zsolt1, Temesszentandrási György1, Pozsonyi Teréz1, Jakab László1, Varga Lilian1, Vatay Ágnes1, Kárpáti Sarolta2, Gombos Tímea3, Fekete Béla1
Semmelweis Egyetem,1III. sz. Belgyógyászati Klinika, 2Bőr- és Nemikórtani Klinika, 3Általános Orvostudományi Kar (hallgató), Budapest
 
Az esetismertetésben szereplő 28 éves nőbeteg szisztémás urticariavasculitise, szeronegatív, nem deformáló – csonteróziót, valamint chondropathiát nem mutató – polyarthritise és progresszív mitralis valvulopathiája két évvel ezelőtt kezdődött. A komplement hemolitikus aktivitása, a C3 és a C4 szérumszintjei ismételten kórosan csökkent értékeket mutattak; C1q elleni antitestet nem tudtak kimutatni. A bőrelváltozás immunhisztokémiai vizsgálattal leukocytoclasticus vasculitisnek felelt meg. Infekciók, szisztémás autoimmun betegségek, allergiás állapotok és daganat kizárására irányuló részletes vizsgálatai ismételten negatív eredménnyel végződtek. A beteg több alkalommal kapott – előbb kis (0,5–1 mg/ttkg), majd nagyobb (2–3 mg/ttkg) dózisban – kortikoszteroidkúrákat; ezek a tüneteket csak enyhítették, és részleges terápiás hatásuk rövid ideig tartott. A néhány hétig adott Delagil-kúra sem bizonyult hatásosnak. A folyamatos bőr- és ízületi gyulladásos aktivitást mutató, 64 mg metilprednisolont szedő beteg esetében ez év áprilisában – más típusú polyarthritisekben, illetve vasculitisekben leírt előnyös hatásai alapján – leflunomidkezelés mellett döntöttünk. Már a háromnapos induktív kezelést követő első héten megszűntek ízületi fájdalmai és urticariaképződése. A beteg – az azóta napi 20 mg leflunomid-, és a fokozatosan napi 4 mg-ra csökkentett metilprednisolonkezelést kapva – klinikailag teljes remisszióban van; komplement hemolitikus aktivitása, C3- és C4-szintjei normalizálódtak. Az irodalomban ez az első esetleírás, amely bizonyítja a leflunomid előnyös terápiás hatását extradermalis szövődményekkel járó hypocomplementaemiás leukocytoclasticus urticariavasculitisben.
A munka az OTKA TO46496 KON támogatásával ké-szült el.
 


Hypocomplementemic leukocytoclastic vasculitis with polyarthritis and mitral valvulopathy was successfully treated with leflunomide
A 28-year-old woman with a two-year history of systemic urticarial vasculitis, seronegative non-erosive polyarthritis and progressive mitral valvulopathy was referred to our department of medicine. Previous therapeutic approaches with corticosteroid (0.5–3 mg/kg) and chloroquine remained unsuccessful. On admission, anorexia, generalized urticarial vasculitis, polyarthritis and mitral insufficiency were detected. The plasma complement (C) haemolytic activity, and C4 and C3 levels were significantly decreased with no detectable anti-C1q antibodies. The skin lesions immunohistochemically were compatible with leukocytoclastic vasculitis. A thorough clinical evaluation of the patient ruled out recent infections, any well- defined connective tissue disorders, allergic conditions, and malignant diseases. In April, 2004 the patient’s ongoing methylprednisolon treatment (64 mg/day) was supplemented with leflunomide (100 mg/day for three days, then 20 mg/day). Leflunomide administration lead to a near complete clinical remission within one week. The daily doses of methylprednisolon could be steeply reduced to 4 mg/day. In July, the patient is still in clinical remission with restored plasma complement haemolytic activity, and C3 and C4 levels. This is the first reported case of hypocomplementemic leukocytoclastic urticarial vasculitis with extradermal manifestations (a known, but yet ill-defined, therapy-resistant clinical entity) where leflunomide administration dramatically abolished the patient’s symptoms and normalized her complement levels.
This work was supported by OTKA TO46496 KON.
 


31. A MASP-2 proteáz enzimatikus tulajdonságainak szerkezeti háttere (P34)

Gál Péter1, Harmat Veronika2, Kardos József1, 3, Szilágyi Katalin1, Ambrus Géza1, Végh Barbara1, Náray-Szabó Gábor2, Závodszky Péter1
1Magyar Tudományos Akadémia, SZBK Enzimológiai Intézet, Eötvös Loránd Tudományegyetem, 2Elméleti Kémiai Tanszék, 3Biokémiai Tanszék, Budapest

A komplementrendszer egyike a gerincesekben található proteolitikus kaszkádrendszereknek, amelyekben szerinproteáz enzimek meghatározott sorrend szerint aktiválják egymást. Ezek a szerinproteázok rendkívül szűk szubsztrátspecificitással rendelkező, több doménből álló mozaikfehérjék; hatásukat rendszerint nem egyedül, hanem más glikoproteinekkel – például proteázokkal, felismerő molekulákkal – alkotott komplexükön keresztül fejtik ki. A komplementrendszer nemrégiben felfedezett, úgynevezett lektinaktiválódási útjának első enzimatikus komponense a MASP-2 proteáz (MASP: mannose-binding lectin-associated serine protease), amely autoaktivációra képes, hasítja a C2- és C4-komponenseket és ezzel beindítja a proteolitikus kaszkádot. A legújabb eredmények szerint a MASP-2 nemcsak a lektinút kulcsenzime, hanem szerepet játszik az alternatív aktiválódási útban, valamint az ischaemiareperfúzió során kialakuló szövetkárosodásban is.
Sikerült meghatároznunk a MASP-2 enzim katalitikus fragmentumának [a szerinproteáz- (SP-) domén és a hozzá kapcsolódó komplement kontroll protein (CCP) modul] térszerkezetét, 2,25 Ĺ felbontásban. Az elemi cellában két MASP-2-molekula található, ezek egymástól a két domén relatív helyzetében különböznek. Ebből arra következtettünk, hogy a CCP/SP határfelület nem merev, hanem itt egy flexibilis (hinge) régió található. Ennek a flexibilitásnak nagy szerepe lehet abban, hogy a MASP-2-dimer képes mindazokat a funkciókat ellátni, amiket a C1-komplexben a nála kétszer nagyobb C1s-C1r-C1r-C1s tetramer lát el. A szerinproteáz-domén térszerkezetét összehasonlítva a csaknem azonos szubsztrátspecificitású C1s enzim térszerkezetével, azt a meglepő megállapítást tettük, hogy a két rokon enzimben a szubsztrátspecificitás meghatározásában döntő szerepet játszó felszíni hurokrégiók eltérő szerkezetűek. Ennek alapján feltételezzük, hogy a MASP-2 és a C1s enzim eltérő kölcsönhatásokat alakít ki ugyanazokkal a szubsztrátokkal.
 


Structural background of the enzymatic properties of MASP-2 protease
The complement system is one of the proteolytic cascade systems found in the blood plasma of vertebrates, in which serine protease enzymes activate each other in a strictly ordered manner. These multidomain proteases have extremely narrow substrate specificity, and they exert their activity through multimeric enzyme complexes. MASP-2 (mannose-binding lectin-associated serine protease) is the first enzymatic component of the recently discovered lectin pathway of complement activation. MASP-2 is capable of autoactivation and cleaves C2 and C4, the subcomponents of the C3 convertase complex. Recent results demonstrated that MASP-2 is not only the key enzyme of the lectin pathway but it also plays essential role in the alternative activation pathway and is responsible for the formation of ischemia-reperfusion injuries.
We have determined the X-ray structure of the catalytic fragment of MASP-2 – the serine protease (SP) domain and the closely associated complement control protein (CCP) module – with a resolution of 2.25 Ĺ. In the unit cell of the crystal there are two MASP-2 molecules, which differ in the relative position of the two domains. We concluded that the interface region between the CCP and SP domains is not rigid, but it can serve as a flexible hinge point. This interdomain flexibility can explain how a MASP-2 dimer is capable of performing all the enzymatical functions, which are mediated by the much larger C1s-C1r-C1r-C1s tetramer in the C1 complex of the classical pathway. We compared the structure of the SP domain of MASP-2 with that of C1s. To our surprise we found that, although the two enzymes share almost the same substrate specificity, the structure of the surface loops of the SP domains have different conformations. These loops are the major determinants of subsite specificities. We concluded therefore that the two related enzymes make different interactions with the same substrates.
 


32. AA típusú amyloidindukált szoliter ischaemiás szigmabélfekély rheumatoid arthritisben (P47)

Gelley András1, Megyaszai Márta3, Kapp Pál2, Bély Miklós2, Hodinka László3, Balázs Csaba1
Budai Irgalmasrendi Kórház KHT., 1Belgyógyászati és Gasztroenterológiai Osztály, 2Patológiai Osztály; 3Országos Reumatológiai és Fizioterápiás Intézet, II. Sz. Reumatológiai és Klinikai Immunológiai Osztály, Budapest
 
Bevezetés: A szoliter vastagbélfekély ritka betegség, leggyakrabban a végbélben fordul elő. Szoliter fekélyt találtunk a szigmabél és a colon descendens határán, egy 31 éve rheumatoid arthritisben (RA) szenvedő betegnél.
Esetismertetés: Az 52 éves nőbetegnél 20 éves kora óta ismert a kezdetben a térdeket, később a kis ízületeket érintő, súlyos destrukciókkal járó, szeropozitív rheumatoid arthritis. Synoviectomiát követően kétoldali modulár térdprotézist, jobb oldali radiusfej-reszekciót végeztek, a beteget mindkét oldalon combnyaktöréssel operálták. 31 éve fennálló rheumatoid arthritis betegség után súlyos microcytaer vashiányos anaemia fejlődött ki. Helicobacter pylori-negatív, NSAID-gastropathiával kezelték.
Egy makroszkóposan negatív eredményt adó kolonoszkópia során 4 cm nagyságú, vérzékeny, ischaemiás fekélyt észleltünk a szigmabélen. A biopsziák ischaemiás fekélyt és idült colitist igazoltak.
A submucosa ereinek falában kongóvörös festéssel kettősen törő amyloidot mutattunk ki.
Három hónappal később, ismételt kolonoszkópia során, a vastagbél több régiójából vett biopszia immunhisztokémiai és elektronmikroszkópos vizsgálatával AA típusú amyloid jelenlétét bizonyítottuk. Ugyanakkor, a korábban észlelt fekély helyéről vett biopsziában a granulációs szövet új ereinek fala amyloidtól mentes volt.
Összefoglalás: A rheumatoid arthritises betegek 5%-ánál megjelenő szekunder, AA típusú amyloidosis vezetett a betegnél a szoliter ischaemiás szigmafekély kialakulásához.
 


AA typing amyloid induced single ischaemic sigmoid-colon’s ulcer in rheumatic arthritis
The single ulcer of the colon is a rarity and occurs usually in the rectum. We found a single ulcer in the sigma-descendens border of a patient suffering in rheumatic arthritis (RA), 31 years ago.
52-years-old female has a sero-positive RA from the age of twenty with serious destructions affecting initially her knees and later her little joints. Bilateral synoviectomy, modular knee prothesis, right side resection of the head of radius bone, bilateral thigh-bone neck fracture was operated on.
After thirty-one year of her RA serious iron deficiency microcytic anaemia developed. Helicobacter pylori negative NSAID gastropathy was treated on.
A 4-cm broad, haemophilic, ishaemic single ulcer of the sigmoid colon was observed during an otherwise negative colonoscopy. The biopsies proved ischaemic ulcer with chronic colitis. In the wall of the submucosal vessels bireflectioning amyloid was demonstrated with congo red. Three month later during repeated colonoscopy, biopsies proved AA typing amyloid immunhistochemically and electro-microscopically. Simultaneously the new vessel’s walls were free from amyloid in the granulational tissue of the place of earlier found ulcer.
Secunder AA typing amyloidosis – appearing in the 5% of the RA patients – led to the development of the single ischaemic sigmoid ulcer.
 


33. A monocyta eredetű dendritikus sejtek CD1a-expressziója összefügg azok funkcionális sajátságaival (P3)

Gogolák Péter1, Réthi Bence1, Szatmári István2, Nagy László2, Rajnavölgyi Éva1
Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum, 1Immunológiai Intézet, 2Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet
 
A dendritikus sejtek differenciálódási és aktiváltsági állapotuktól függően változatos fenotípusos és funkcionális tulajdonságokkal rendelkezhetnek. Ennek legnyilvánvalóbb megnyilvánulása a két ellentétes hatású – gyulladásos T-sejteket indukáló és a toleranciát fenntartó – dendritikus sejtpopuláció. In vitro differenciáltatott, humán monocyta eredetű dendritikus sejteket (MDC) használnak adjuvánsként a tumorellenes immunterápiában, de az ilyen célra leghatásosabb DC-populációt még nem azonosították. A CD1a egy MHC I-szerű molekula, ezt a Langerhans- és dendritikus sejtek specifikus sejtfelszíni markerének tartják. Funkciója szerint lipidprezentáló molekula, mind exogén, mind endogén lipideket képes a sejtbe be- és onnan kiszállítani. Vizsgálataink során azt találtuk, hogy a monocyta eredetű dendritikus sejtek differenciációjuk során CD1a-pozitív és CD1a-negatív populációra különülnek; gyulladási citokinek hatására arányuk stabilizálódik. Ez az arány egyedenkénti variabilitást mutat, és erősen függ a sejtkultúra-körülményektől is, mint a sejtek sűrűsége vagy a szérumkoncentráció. A két populáció funkciójában is eltér. A CD1a-pozitív sejtek CD40-ligáció hatására nagy mennyiségű IL-12-t termeltek és aktívan vándoroltak MIP-3b hatására; a CD1a-negatív sejtek aktív fagocitózist mutattak, sok IL-10-et, kevés IL-12-t termeltek és aktivációjuk/érésük után kevésbé voltak érzékenyek MIP-3b-ra. Úgy találtuk, hogy az érés során a sejtekben kifejeződő egyik nukleáris receptor, a peroxiszóma proliferátor aktivált receptor-g (PPAR-g) szintetikus ligandja, a rosiglitazon képes volt a CD1a-expressziót gátolni mind mRNS-, mind fehérjeszinten. A rosiglitazon jelenlétében differenciálódó sejtek inkább anti-inflammatorikus típusúakká váltak. Az ilyen MDC-k által aktivált T-sejtek citokintermelése is eltért a szokványostól. Ezek alapján valószínűsíthető, hogy az MDC-k CD1a-expressziója összefügghet az MDC alapú terápia hatékonyságával is.
 


Functional activity of monocyte-derived dendritic cell subsets correlates with CD1a expression
Dendritic cells (DC) possess a wide range of phenotypic and functional flexibilty depending on their origin and activation state. The potential of priming inflammatory T-cell responses or maintaining tolerance is attributed to various subsets and/or differentiation states of DC. Human monocyte-derived DC (mDC) has been shown as adjuvants for anti-tumor immunotherapy in various clinical settings, but the most potent DC type has not yet been identified. CD1a is an MHC class I-like molecule considered as a Langerhans/DC-specific surface marker. It also acts as a recycling/presenting molecule for modified lipids by passing through both routes of antigen presentation. The goal of this study was to characterize human mDC by their CD1a expression related to various functional activities. We found that mDC presented a heterogeneous population in which the ratio of CD1a+ and CD1a– DC was individually variable and highly dependent on culture conditions such as cell density and serum concentration. Maturation of mDC by inflammatory cytokines stabilized the CD1a+ and CD1a– phenotypes, which were characterized by different functional properties. Mature CD1a+ mDC produced high concentration of IL-12 upon CD40 ligation and could be mobilized by MIP-3b, whereas CD1a– mDC were more active in phagocytosis, and upon maturation became less sensitive to MIP3-b and secreted IL-10 but fewer IL-12. We also found that rosiglitazone (RSG), a synthetic ligand of the nuclear peroxisome proliferator activated receptor-g (PPAR-g), was able to down regulate CD1a mRNA and protein expression. As a result, RSG-treated mDC were polarized to an anti-inflammatory type as revealed by the altered cytokine profile of T lymphocytes stimulated by autologous RSG-treated DC. We suggest that the expression of CD1a on mDC may correlate the efficiency of DC therapy.

34. Plasmacytoid dendritikus sejt lymphoma/leukaemia jellemzése áramláscitometriával (P49)

Gopcsa László1, H. Sandil Anita1, Bányai Anikó1, Jakab Katalin1, Tamáska Júlia1, Matolcsy András2, Rajnavölgyi Éva3, Pálóczi Katalin1
1
Országos Gyógyintézeti Központ, Hematológiai és Immunológiai Intézet, 2Semmelweis Egyetem, I. sz. Patológiai Intézet, Budapest; 3Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum

Előzmények:
A jelenlegi álláspont szerint az úgynevezett nem T-sejtes vagy nem B-sejtes, de lymphoblastos morfológiát mutató CD4+CD56+ neoplazmák klinikai és immunfenotípus tulajdonságok alapján különböző betegségeket foglalnak magukban. Sejtes eredetük és osztályozásuk még ellentmondásos, azonban számos klinikailag agresszív entitást ismerünk.
Módszerek: A bőr, a csontvelő, a perifériás vér, a nyirokcsomók, a máj és a lép érintettségét okozó plasmacytoid dendritikus sejt lymphomában/leukaemiában szenvedő 71 éves férfi beteget mutatunk be. Széles monoklonális antitest panellel határoztuk meg a malignus plasmacytoid dendritikus sejtek immunfenotípus-jellemzőit, ez kiterjedt a sejtvonal-specifikus markerekre, a kemokinreceptorokra, a citokinreceptorokra és az aktivációs vagy kostimulációs molekulákra.
Eredmények: A malignus sejtek CD4+, CD56+, CD33+/–, CD2–, CD3–, CD5–, CD8–, CD16–, CD19–, CD20–, CD34–, CD13–, icMPO– és TdT– fenotípust hordoztak, a T-sejt-receptor-g-lánc kimutatható génátrendeződése nélkül. A CD40 és CD84 kivételével, a malignus plasmacytoid dendritikus sejtek az összes kostimulációs molekulára nézve negatívnak bizonyultak. A tumorsejtek jellegzetes CD123+, CD25–, CD117– és CD122– citokinreceptor-expressziós mintázatot mutattak. Az immunfenotípus fejlődési útvonal szerint esetünk a praeplasmacytoid dendritikus sejt fenotípusnak felel meg.
Következtetések: A plasmacytoid dendritikus sejt malignitásainak legjellegzetesebb fenotípus-tulajdonsága a CD4 és CD56 antigének koexpressziója, az intenzív HLA-DR- és CD123-expresszió, valamint a sejtvonal-specifikus markerek reaktivitásának hiánya. Nem ismert azonban, hogy az immunfenotípus-variációknak van-e klinikai jelentőségük. Esetünkben a plasmacytoid dendritikus sejt lymphoma/leukaemia fenotípus jellemzése további információt szolgáltathat e ritka neoplazmák osztályozásában.
 


Extensive flow cytometric characterization of plasmacytoid dendritic cell lymphoma/leukemia cells
Objectives: Accumulating evidence suggest that non-T-cell or non-B-cell CD4+CD56+ neoplasms with lymphoblastic morphology contain clinically and immunophenotypically diverse disease entities. Although their cell of origin or classification are still controversial, several entities clearly represent a distinct type of neoplasms that are clinically aggressive.
Methods: In this work we report a 71-year-old male patient with widespread plasmacytoid dendritic cell lymphoma/leukemia involving the skin, bone marrow, peripheral blood, lymph nodes, liver and spleen. We measured the immunophenotypic characteristics of malignant plasmacytoid dendritic cells with wide monoclonal antibody panels, including lineage markers, chemokine receptors, cytokine receptors, and activation or co-stimulatory molecules.
Results: The malignant cells shared CD4+, CD56+, CD33+/–, CD2–, CD3–, CD5–, CD8–, CD16–, CD19–, CD20–, CD34–, CD13–, MPO– and TdT– basic phenotype with no detectable T-cell receptor-g-chain gene rearrangement. Except of CD40 and CD84, the malignant plasmacytoid dendritic cells were found to be negative for all co-stimulatory molecules. The tumor cells showed the characteristic CD123+, CD25–, CD117– and CD122– cytokine receptor expression profile. This case seemed to correspond the pre-plasmacytoid dendritic cell phenotype according to the immunophenotypic developmental pathway.
Conclusions: The most characteristic phenotypic features of plasmacytoid dendritic cell malignancies the coexpression of CD4 and CD56 antigens with high HLA-DR and CD123 expression in the absence of reactivity for lineage specific markers. However, it is unknown whether the immunophenotypic variations share any clinical significance. Therefore, the phenotypic characterization of plasmacytoid dendritic cell lymphoma/leukemia cells might provide further information for better classification of these rare neoplasms.
 


35. Pozitív és negatív akutfázis-fehérjék szérumkoncentrációja interferon-a- és ribavirinkezelésben részesült krónikus C-hepatitises betegeken. Előzetes eredmények (P48)

1Gráf László, 2Pár Alajos, 1Jakab László, 1Pozsonyi Teréz, 1Prohászka Zoltán, 1Füst György, 1Fekete Béla, 3Kalabay László
1Semmelweis Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, III. sz. Belgyógyászati Klinika, Budapest; 2Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, I. sz. Belgyógyászati Klinika; 3Semmelweis Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, Családorvosi Tanszék, Budapest
 
Előzmények: Korábbi vizsgálatainkkal az akutfázis-reakció paradox irányú változását észleltük krónikus hepatitis C-ben szenvedő betegek három hónapig tartó, nagy dózisú interferon-a- (IFN-a-) terápiája során, mely a kezelésre válaszolókban megszűnt. Jelen munkánkban a krónikus hepatitis C-ben szenvedő betegek IFN-a és ribavirinterápiája során határoztuk meg a pozitív (a1-acid-glikoprotein/orosomucoid, oroso) és negatív (humán fetuin/a2HS-glikoprotein, AHSG) akutfázis-fehérjék szérumkoncentrációját.
Betegek és módszerek: A betegek 6–12 hónapon át heti 3×3 ME IFN-a-t kaptak subcutan és napi 800–1200 mg ribavirint per os. A kezelés után a vizsgált 28 krónikus hepatitis C-s beteg közül 12 (hét férfi, öt nő, átlagéletkor: 47,3±7,3 év, átlag±SE, 40–58 év) került tartós virológiai és biokémiai remisszióba (szérum-HCV-RNS: negatív, GPT: normális), 23 pedig nem reagált vagy csak részleges javulást mutatott (15 férfi, nyolc nő, életkor: 47,1±9,3 év, 31–67 év). A szérum-AHSG- és -oroso-meghatározásokat radiális immundiffúzióval végeztük az antivirális kezelés előtt, alatt és után.
Eredmények: A tartós remisszióba került betegeken a kiindulási értékhez képest a szérumoroso-koncentráció 1–3, illetve 6–12 hónap múlva fokozatosan emelkedett (p=0,0078, illetve 0,0371), míg a nem reagálóknál lényegében nem változott. Tartós remisszióban a szérum AHSG-szintje a fiziológiás szinten maradt 1–3, illetve 6–12 hónap múlva. A nem javultak kezelés előtti AHSG-szintje (836±51 µg/ml, átlag±SE) lényegesen magasabb volt a normálisnál (593±9 µg/ml), ez a terápia alatt – bár fokozatosan csökkent – végig a gyógyultaké fölött volt.
Következtetések: Eredményeink megerősítik azt a korábbi megfigyelésünket, hogy krónikus hepatitis C-ben az akutfázis-fehérjék paradox irányú eltérése észlelhető, amely a hoszszú távon sikeres IFN-ribavirin kezelés során a fiziológiás irányba változik.
A munka az ETT 278/2003. sz. támogatásával ké- szült.
 


Serum levels of positive and negative acute phase proteins in patients with chronic hepatitits C on interferon-a and ribavirin treatment. Preliminary results
Background/aim: Previously we reported a paradoxical alteration of serum levels of acute phase reactants in during high-dose short-term interferon-a (IFN-a) treatment in patients with chronic hepatitis C. This alteration reversed in responders. In our present study we determined the serum concentration of positive (a1acid glycoprotein/orosomucoid, oroso) and negative (human fetuin/a2HS-glycoprotein, AHSG) acute phase proteins in patients with chronic hepatitis C treated with IFN-a and ribavirin.
Patients and methods: Twenty-eight patients were given 3×3 ME recombinant IFN-a sc. weekly and 800–1200 mg ribavirin p.o. daily for 6–12 months. After completion of therapy, 12 patients (seven men, five women, age: 47.3±7.3 years, mean±S.E., range: 40–58) showed sustained virological and biochemial remission (negative serum HCV-RNA and normal ALT), whereas 23 patients (15 men, eight women, age: 47.1±9.3 years, range 31–67) were partial- or non-responders. Serum levels of the acut phase proteins were determined by radial immunodiffusion before, during and after the antiviral treatment.
Results: Compared to initial values, serum levels of oroso gradually increased in the 1–3, and 6–12 months, (p=0.0078, and p=0.0371) respectively, in responders, whereas it remained unchanged in partial or non-reponders. The serum concentration of AHSG remained at the physiologic level in the 1–3, and 6–12 months of therapy. In those with no or partial response pre-treatment AHSG levels (836±51 µg/ml, mean±S.E.) were significantly higher than normal (593±9 µg/ml). Although these values gradually decreased during treatment they still remained above those of patients in sustained remission.
Conclusions: Present data support our previous observation that in chronic hepatitis C there is a paradoxical alteration of serum acute phase proteins that changes to physiologic levels during successful antiviral treatment with IFN-a and ribavirin.
This work was supported by the grant of the Hungarian Ministry of Health ETT 278/2003.

36. A szabályozó T-sejtek szerepe a bőr gyulladásos folyamataiban
(R7)

Gyulai Rolland
Szegedi Tudományegyetem, Szent-Györgyi Albert Orvos- és Gyógyszerésztudományi Centrum, Bőrgyógyászati és Allergológiai Klinika
 
A bőr immunrendszerének elsődleges feladata a szervezet külső patogénekkel szembeni védelme, valamint az autológ agresszorok – például malignusan transzformálódott sejtek – azonosítása és eliminálása. Mindezen effektor működéseknek egyensúlyban kell lenniük a megfelelő gátlófunkciókkal, a túlzott szövetkárosodás, illetve az autoreaktív sejtek aktivációjának (és az autoimmun betegségek kialakulásának) elkerülése érdekében. Számos adat támasztja alá a természetesen előforduló CD4+CD25+ T-sejteknek (Treg) szuppresszor-sejtekként való működését a bőr patofiziológiai folyamatainak szabályozásában. A Treg-sejtek központi szerepet játszanak a protozoon parazita Leishmania okozta fertőzések kialakulásában, és szabályozzák a herpeszvírus-specifikus CD8+ T-sejt-választ. A CD4+CD25+ T-sejtek száma emelkedett a melanomaáttétet tartalmazó nyirokcsomókban, és ezek a sejtek a melanomás nyirokcsomók immunoszuppresszív állapotának fenntartásában is fontos szerepet játszanak. A CD4+CD25+ T-sejtek száma jelentősen emelkedett az atópiás dermatitisben szenvedő betegek perifériás vérében, ugyanakkor szuperantigén-stimulációt követően ezek a sejtek elveszítik immunoszuppresszív képességüket. Saját vizsgálataink igazolták, hogy a normális és a pikkelysömörben szenvedők vérében a CD4+CD25+ T-sejtek azonos számban vannak jelen, de a psoriasisos Treg-sejtek gátló hatása jelentősen kisebb a normálsejtekénél. Az előadás összegzi a CD4+CD25+ T-sejtek alapvető szerepét a hatékony cutan immunitás fenntartásában, az autoimmun folyamatok megelőzésében, és a különböző gyulladásos bőrbetegségek kialakulásában.



Regulatory T-cells in the control of cutaneous inflammation

The skin immune system’s primary responsibility is to protect the organism from outside pathogens, as well as to identify and eliminate autologous aggressors – such as malignantly transformed cutaneous cells. These effector tasks have to be balanced with appropriate inhibitory functions in order to prevent excessive tissue destruction, and to avoid the activation of autoreactive T-cells, and thus, autoimmunity. A large body of evidence identifies naturally occurring CD4+CD25+ T-cells (Treg) as key suppressor cells involved in the control of many pathophysiological skin processes. Treg cells play a fundamental role in the infectious process due to the protozoan parasite Leishmania, and regulate herpesvirus-specific CD8+ T-cell responses. CD4+CD25+ T-cells are overrepresented in metastatic melanoma lymph nodes, and are a major component of the immunosuppressive lymphatic microenvironment in melanoma. Patients with the inflammatory skin disease atopic dermatitis have significantly increased numbers of peripheral blood Treg cells, however, after superantigen stimulation, these Treg cells lose their immunosuppressive activity. We have recently demonstrated that CD4+CD25+ T-cells are present in equal proportions in normal and psoriatic peripheral blood, however, psoriatic Treg show markedly decreased capacity to suppress autologous CD4+CD25– responder T-cell proliferation following antigen specific stimulation. The pivotal role of CD4+CD25+ T-cells in the maintenance of efficient skin immune responses, in the prevention of autoimmunity, as well as their potential role in the development of skin diseases will be summarized.

37. A TGF-b gén polimorfizmusának klinikai jelentősége a myelodysplasiás szindróma refrakter anaemiás csoportjába tartozó betegeken
(P26)

Gyulai Zsófia1, Balog Attila1, Borbényi Zita2, Molnár Lenke3, Mándi Yvette1
Szegedi Tudományegyetem, Orvosi Mikrobiológiai és Immunbiológiai Intézet, 1II. sz. Belgyógyászati Klinika és Kardiológiai Központ, 2Általános Orvostudományi Kar; 3Pécsi Tudományegyetem, I. sz. Belgyógyászati Klinika, Általános Orvostudományi Kar

 
Célkitűzések:
A myelodysplasiás szindróma (MDS) a vérképzőszervi rendellenességek jól körülhatárolt, de heterogén csoportja; az ineffektív haematopoesis és a csontvelői elégtelenség, valamint a leukaemiás transzformáció megnövekedett valószínűsége jellemzi. Több tanulmány is hangsúlyozta a szérumban és csontvelőben mért emelkedett tumornekrózis-faktor-a- (TNF-a-) szint jelentőségét az apoptózis kiváltásában. A transzformáló növekedési faktor-b (TGF-b) egy másik, a haematopoeticus ős- és progenitorsejtekre negatív szabályozószerepet játszó citokin. Az ezen citokineket kódoló gének számos, a génexpressziót befolyásoló genetikai polimorfizmusa ismert. Jelen kísérleteink során azt vizsgáltuk, hogy a TNF-a-308 és a TGF-b kodon 10 polimorfizmusok befolyásolják-e a refrakter anaemia (RA) kialakulását és a betegség súlyosságát MDS-ben.
Betegek és módszerek: Az MDS (n=55) diagnózisa a FAB-kritériumok alapján történt. A kontrollcsoportot 71 egészséges véradó képezte. A TNF-a-308 polimorfizmust NcoI RFLP technikával, a TGF-b polimorfizmust ARMS segítségével vizsgáltuk.
Eredmények: A különböző TNF-a-allélok gyakorisága, valamint a genotípusok eloszlása nem különbözött az egészséges véradók és a refrakter anaemiás betegek között. A TGF-b kodon 10 TT homozigóta genotípus szignifikánsan gyakrabban volt jelen az általunk súlyos cytopeniásnak tekintett csoportban (95% KI OR=4,889; p=0,0071).
Következtetések:
Mindezek alapján a TGF-b kodon 10 és a TNF-a-308 polimorfizmusok nem befolyásolják a refrakter anaemia kialakulását, de a TGF-b gén polimorfizmusa hatással lehet a betegség kimenetelére.
 


Clinical importance of TGF-b but not of TNF-a gene polymorphism in patients with myelodysplastic syndrome belonging to the refractory anemia subtype
Aims:
The myelodysplastic syndrome (MDS) comprises a distinct, albeit heterogeneous group of hematopoietic disorders characterized by ineffective hematopoiesis and an increased propensity to marrow failure and leukemic transformation. Several studies have stressed the importance of increased levels of tumor necrosis factor-a (TNF-a) in the serum and bone marrow in promoting apoptosis. Transforming growth factor-b (TGF-b) is another cytokine, which is generally considered to be a key negative regulator of hematopoietic stem and progenitor cells. There have been several reports on the presence of genetic polymorphisms in the DNA sequence encoding the leader sequence of the TGF-b1 protein, located in codon 10 and in the –308 promoter region of TNF-a. The objective of this study was to investigate the association between TNF-a and TGF-b1 gene polymorphism and the susceptibility to MDS and the progression of the disease among patients with MDS belonging to the refractory anemia (RA) subtype.
Patients and methods:
The diagnosis of MDS (n=55) was based on the FAB criteria. Haelthy blood donors (n=71) served as controls. The TNF-a genotypes were analyzed by PCR-RFLP and the TGF-b genotypes were analyzed by ARMS.
Results:
As compared with healthy control subjects, patients with RA showed no significant deviations in genotype or allele frequencies of TNF-a. The TT homozygosity at codon 10 of TGF-b1 was associated with severe degree of cytopenia (95% CI OR=4.889, p=0.0071).
Conclusion:
These findings suggest that TGF-b1 gene polymorphism in codon 10 and –308 TNF-a gene polymorphism do not predispose to the development of RA, but that TGF-b1 gene polymorphism may affect the disease progression.

38. Az antikoleszterin-antitest szintjének jelentős változása az endarterectomián átesett, carotisarteriosclerosisban szenvedő betegek szérumában (P39)

Horváth Anna1, Dosa Edit2, Bíró Adrienn1, Prohászka Zoltán1, Rugonfalvi-Kiss Szabolcs1, Karádi István1, Romics László1, Selmeczi László2, Entz László2, Füst György1
Semmelweis Egyetem, 1III. Sz. Belgyógyászati Klinika, 2Ér- és Szívsebészeti Klinika, Budapest
 
Vizsgálatunkban súlyos carotisstenosis miatt endarterectomián átesett betegek szérumából határoztuk meg az antikoleszterin-antitest (ACHA) szintjét. A Semmelweis Egyetem Érsebészeti Klinikáján 110 beteget vontunk be a vizsgálatba. A betegek orvosi vizsgálata az endarterectomia után 5,7 (5,3–8,0) héttel [medián (25–75 percentilis)], 6,8 (6,2–7,9) hónappal, majd 13,8 (12,3–19,0) hónappal volt. Az akutfázis-proteineket a beavatkozás előtt, valamint az első és az utolsó vizsgálatkor is meghatároztuk. Az ACHA-szinteket szérummintából, ELISA-technikával határoztuk meg. Az ACHA szérumszintje [medián (25–75 percentilis)] a műtét előtt szignifikánsan alacsonyabb volt (p<0,0001) a betegekben [15,5 (10,8–24,8) AU/ml], az egészséges kontrollcsoporthoz viszonyítva [25,9 (20,1–33,7) AU/ml] (Mann–Whitney-teszt). Az operáció előtti értekekhez képest a szérumban mérhető ACHA-szintek szignifikánsan megemelkedtek az utánkövetéses vizsgálat végére [15,5 (10,8–24,8) AU/ml és 39,1 (27,0–57,6) AU/ml], Wilcoxon-teszttel: p<0,0001. Az endarterectomia utáni betegcsoport a vizsgálat utolsó mérése- kor kapott emelkedett ACHA-szérumszintje szignifikánsan magasabb a kontrollcsoporttal való összehasonlításkor (p<0,0001, Mann–Whitney-teszt). Az ACHA és a CRP erős korrelációt mutatott a 14 hónapos utánkövetésnél (r=0,368, p<0,0001); az ACHA és a fibrinogén között is hasonlóan erős korrelációt találtunk (r=0,393, p<0,0001).
Eredményeink szerint az atheroscleroticus plakkok eltávolítása után jelentős a szérumban az ACHA-szint emelkedése, ez vagy a fogyás mérséklődése, vagy a termelődés fokozódása miatt alakulhat ki.
 


Dramatic changes in the serum levels of anticholesterol antibodies after eversion endarterectomy in patients with severe carotid atherosclerosis
Our goal was to study changes in anticholesterol antibodies (ACHA) levels in patients with severe carotid stenosis after eversion endarterectomy. Hundred and ten consecutive patients who underwent eversion endarterectomy at the Department of Cardiovascular Surgery, Semmelweis University, Budapest were included in the study. Patients had medical check up at 5.7 (5.3–8.0) weeks [median (interquartile range)], 6.8 (6.2–7.9) months as well as 13.8 (12.3–19.0) months after endarterectomy. Blood samples for acute phase protein measurement were performed before operation as well as the first and last follow-up visits. ACHA concentrations were promptly determined in the sera samples by using the ELISA method. ACHA concentrations (median (interquartile range) were found to be significantly (p<0.0001) lower in the sera of the patients with carotid atherosclerosis [15.5 (10.8–24.8) AU/ml] than in the healthy subjects [25.9 (20.1–33.7) AU/ml] (Mann–Whitney test). Serum ACHA concentrations significantly (p<0.0001) increased from the values measured before operation [(15.5 (10.8–24.8) AU/ml] to 39.1 (27.0–57.6) AU/ml measured at the end of the follow-up. The latter values were significantly higher than those measured in the healthy controls as calculated by the Mann–Whitney test (p<0.0001). ACHA levels correlated with CRP after 14 month long follow up postoperation period (r=0.368, p<0.0001). Our present findings indicate that removal of atherosclerotic plaques from the carotid arteries markedly elevates the production of ACHA in patients.
 


39. A koleszterin-anyagcserét befolyásoló immunizálás terhes nyulakon (P50)

Horváth István1, Várbíró Szabolcs2, Horváth Anna3, Paulin Ferenkhi2
1
Országos Bőr- és Nemikórtani Intézet, Semmelweis Egyetem, 2II. sz. Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika, 3III. sz. Belgyógyászati Klinika, Budapest
 
Korábbi vizsgálataink igazolták, hogy az antikoleszterin-termelést stimuláló immunizálás befolyásolja a koleszterin-anyagcserét. Ez a hatás legszembetűnőbben az atherosclerosis elleni védelem formájában nyilvánul meg. Az antikoleszterin ezen védő hatásának megfigyelésére az érelmeszesedés kialakítására alkalmas kísérleti nyulak bizonyultak legmegfelelőbbnek.
Közismert, hogy a koleszterin minden nemi hormon prekurzora. A nemi hormonok termelésében a terhesség váltja ki a legnagyobb változást. Ennek megfelelően terhes nyulakon vizsgáltuk, hogyan hat a koleszterinterhelés, illetőleg az antikoleszterin-termelést stimuláló immunizálás az anyaállat koleszterin-, triglicerid- és szteroidhormon-szintjeire, illetőleg a magzatok paramétereire.
Eredmények: 1. Egészséges terhes állatok immunizálása nem zavarta a koleszterin-anyagcserét, nem alakult ki a magzatokat veszélyeztető hatás. 2. A koleszterinterhelés kedvezőtlenül hatott a magzatok fejlődésére. A magzatok száma és tömege is csökkent. 3. Immunizálás hatására csökkent a terhes állatok trigliceridszintje. 4. Az immunizálás jelentősen csökkentette a vér magas koleszterinszintjét, kedvezően befolyásolta a magzatok fejlődését. 5. Az immunizált és koleszterinnel terhelt csoportban nőtt a megtapadt és fejlődésnek indult zigóták száma, s a kifejlődött és elhalt magzatok száma is. 6. Ugyanebben a csoportban a magzatok tömegének átlaga azonos volt a kezeletlen kontrollcsoportéval. 7. Az anyai szteroidhormonok szintjében nem mutatkozott szignifikáns változási trend.
A terhes állatokon végzett vizsgálatok eredményei felhívják a figyelmet arra, hogy a magas koleszterinszint kedvezőtlenül hat a magzatok fejlődésére; az immunizálással stimulálható antikoleszterin-szint befolyásolja a koleszterin-anyagcserét. Ezen eredmények ismeretében indokoltnak tartjuk az antikoleszterin-antitest és a stimulálására alkalmas antigén további tanulmányozását.
 


Immunization of pregnant rabbits influences the cholesterin metabolism
Our earlier examinations showed that the immunization stimulating the production of anticholesterin antibodies influences the metabolism of cholesterin. This effect was documented as a defense mechanism against the atherosclerosis. This defensive effect can be studied on rabbits, which are appropriate to work up atherosclerosis. The cholesterin is the precursor for all sexual steroid hormones. The strongest change in the level of the sexual steroids takes place during pregnancy. Therefore we examined on pregnant rabbits the effects of cholesterin load and/or the immunization on the serum level of triglycerid, cholesterin and sexual steroids and the fetal parameters.
Results: 1. Immunization of healthy pregnant rabbits did not disturbed the cholesterin metabolism and there was experienced no adverse effect on the fetuses. 2. The cholesterin load showed an adverse effect on the fetuses, the number and the weight of fetuses decreased. 3. The maternal serum level of triglycerid decreased after immunization. 4. The high serum cholesterin level decreased after immunization and the development was more favorable. 5. In the cholesterin loaded and immunizated group increased the number of implanted zygotes and so did the number of developed and in utero died fetuses. 6. In this group the mean body weight of fetuses was the same as in the control group. 7. In the maternal serum level of steroid hormones we experienced no significant change.
The results of study on pregnant rabbits showed that the high cholesterin serum level has an adverse effect on the development of fetuses and the level of anticholesterin antibodies after immunization influences the cholesterin metabolism. According to these results it seems reasonable the further study of the anticholesterin antibodies and for the immunization appropriate antigens.
 


40. Hisztamin hiányában fokozódik az apoptózis mértéke a hisztidin-dekarboxiláz knockout egerekben (P4)

Horváth Zsuzsanna1, Pállinger Éva2, Horváth Győző3, 4, Falus András1, 2
1Semmelweis Egyetem, Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet; 2MTA, Molekuláris Immunológiai Kutatócsoport; 3Magyar Honvédség, Sugárbiológiai Osztály, Egészségvédelmi Intézet; 4OKK OSSKI, Sugárpatológiai Osztály, Budapest
 
Cél: Korábbi kísérleteinkben – 4 Gy egésztest-besugárzást követően – eltérést tapasztaltunk a különböző immunfenotípussal jellemezhető csontvelői sejtpopulációk megoszlásában a hisztidin-dekarboxiláz knockout (HDC-KO) és a vad genotípusú (WT) egerek között. Ezzel párhuzamosan a HDC-KO egerekben késett a csontvelői regeneráció. Jelen munkánkban az eltérések egyik magyarázataként a különböző apoptotikus folyamatok szerepét vizsgáltuk.
Módszerek: In vivo HDC-KO Balb/c egereket (egyik csoportjukat hisztaminmentes tápon, másik csoportjukat normális tápon tartottuk) és WT Balb/c (hisztaminmentes tápon tartott) egereket sugaraztunk be 4 Gy összdózisú gammasugárzással. A csontvelői mintákat a 2. és a 6. órában, illetve az 1., 3. és 7. napon nyertük. A sejtpopulációkat áramlási citometriás módszerrel jellemeztük immunfenotípusuk alapján, majd anti-kaszpáz-3, anti-CD95, anti-CD95L antitestekkel, AnnexinV antitesttel és propidium-jodiddal (PI) jelöltük. Meghatároztuk a sejtek TNF-a-mRNS-tartalmát is, real-time PCR-rel.
In vitro
kezeltük a WT egerek csontvelői sejtkultúráját a hisztidin-dekarboxiláz enzimet gátló FMH-val (10–4 M), a H1-receptor-blokkoló triprolidinnal (10–5 M) és a H2-receptor-blokkoló ranitidinnal (10–5 M); a HDC-KO egerek csontvelői sejtjeit hisztaminnal (10–5 M) kezeltük, 24 órán át. Ezután etopoziddal apoptózist indukáltunk (10–6 M, négy órán át). Utána a fent részletezett méréseket végeztük el.
Eredmények: Eredményeink szerint a sugárzás- és etopozidindukált sejthalál nagyobb mértékű a HDC-KO egerekben, mint a WT egerek esetén. Ezzel párhuzamosan a HDC-KO egerek sejtjein nő az aktív kaszpáz-3- és CD95-expresszió-növekedés, főleg a besugárzást követő 6. órában, illetve az 1. és 3. napon. Hisztamin pótlására – besugárzást követően – a sejthalál mértéke és a CD95 expressziója csökkent a HDC-KO egerekben. In vitro hisztaminkezelés hatására az összes apoptotikus markerben látható volt a csökkenő tendencia, a kezeletlen HDC-KO sejtekhez hasonlítva. A WT-sejtek hisztaminszintézisének gátlásakor (FMH-kezelésre) a CD95-expresszió jelentősen nőtt. Ily mértékű növekedést nem tapasztaltunk a triprolidin- és ranitidinkezelést követően.
Összefoglalás: Az in vivo és in vitro kísérletek eredményei alátámasztják, hogy a sugárzás- vagy etopozidindukált csontvelői sejthalál nagyobb mértékű, és a csontvelő regenerációja késik hisztamin hiányában. Az apoptotikus markerek – főként a CD95, illetve az aktív kaszpáz-3 – sejtfelszíni expressziója is megnövekedett, ez hisztamin pótlására újra csökkent. Mindazonáltal, pusztán a hisztamin szintézisének – és nem a receptorainak – gátlása okozott növekedést az apoptotikus markerekben a WT-sejteken. Mindez hangsúlyozza a lokálisan termelt hisztamin szabályozószerepét a haemopoesisben és a csontvelői apoptotikus folyamatokban.



Lack of histamine causes increased rate of apoptosis in histidine decarboxylase knockout (HDC-KO) mice

Objective: Earlier it was found that after 4 Gy whole body irradiation there was a difference in the percentages of immunophenotypically characterised bone marrow cell populations between HDC-KO and wild type (WT) mice, and hence bone marrow regeneration was delayed in HDC-KO mice. In the present study the role of various apoptotic mechanisms behind this difference was investigated.
Methods: In vivo HDC-KO Balb/c mice (one group kept on histamine free diet, the other kept on normal diet) and WT Balb/c mice (kept on histamine free diet) were subjected to a total dose of 4 Gy whole body g-irradiation. Bone marrow samples were obtained in the 2nd and 6th hours and on the 1st, 3rd and 7th days. Using flow cytometry, cell populations were characterised immunophenotypically and labelled by anti-Caspase3, anti-CD95, anti-CD95L antibodies, AnnexinV antibody and Propidium iodide (PI). Also, TNFa mRNA was determined by real-time PCR.
In vitro BM-cell cultures of WT mice were treated with HDC enzyme blocker FMH (10–4 M), H1-receptor blocker triprolidine (10–5 M) or H2-receptor blocker ranitidine (10–5 M), and HDC-KO BM cultures were treated with histamine (10–5 M) for 24 hours. Then apoptosis was induced by etoposide (10–6 M, for four hours). The same flow cytometric measurements were taken as above.
Results: The results show that irradiation- and etoposide-induced cell death occurs at a greater rate in BM of HDC-KO mice compared to WT mice. This result is parallel with the increase in active caspase-3 and CD95 expression in cells of HDC-KO mice. This is evident especially in the 6th hour and on the 1st and 3rd day after irradiation. When supplied with histamine, the rate of cell death and the expression of CD95 decreased in HDC-KO mice after irradiation. In vitro a slight decrease was observed in all apoptotic markers upon histamine treatment compared to untreated HDC-KO cells. When the synthesis of histamine was blocked by FMH in WT-cell culture, the expression of CD95 significantly increased. This increase was not observed after ranitidine or triprolidine treatment.
Conclusions: The results of in vivo and in vitro experiments support that irradiation- or etoposide-induced BM-cell death is higher and BM regeneration is delayed in the absence of histamine. Moreover, the expression of apoptotic markers (especially of CD95 and active caspase-3) on cell populations is elevated, which could be suppressed by histamine substitution. However, blocking only the synthesis of histamine and not its receptors caused an upregulatory effect of apoptotic markers in WT-cells, emphasising the significance of locally produced histamine in the regulation of hematopoiesis and apoptotic processes in the bone marrow.
 


41. Az immunkomplexkötő receptorok expressziójának vizsgálata rheumatoid arthritisben és szisztémás lupus erythematosusban (P43)

Isaák Andrea1, ifj. Gergely Péter2, Szekeres Zsuzsanna1, Erdei Anna1, Poór Gyula2, Gergely János1
1
Eötvös Loránd Tudományegyetem, Természettudományi Kar, Immunológiai Tanszék, 2Országos Reumatológiai és Fizioterápiás Intézet, Budapest
 
Az Fcg- és a komplementreceptorok funkciójában, illetve expressziójában bekövetkező változások hajlamosító tényezőként szerepelhetnek a humán autoimmun betegségek kialakulásában. Vizsgálataink során 40 rheumatoid arthritisben, 10 szisztémás lupus erythematosusban (SLE) szenvedő, illetve 25 kontrollbetegből származó mintán mértük ezen immunkomplexkötő receptorok expressziójának esetleges változását mint lehetséges rizikófaktort. B-sejteken és monocytákon áramlási citometriával a következő receptorok megjelenését vizsgáltuk: FcgR (CD64, CD32, CD16), komplementreceptorok (CD21, CD35, Mac-1), mIgG+IgM, MHC II, valamint aktivációs markerként CD69. A CD32 és a CD35 receptorok esetében egyidejűleg PCR-vizsgálatokat is végeztünk. A citofluorimetriás mérések a CD35 csökkent expreszszióját mutatták SLE-s betegek B-sejtjein, valamint fokozott CD64-expressziót ugyanezen betegek monocytáin. A rheumatoid arthritisben szenvedő betegek monocytáinak 75%-án találtunk a kontrollhoz képest magasabb CD64-, valamint B-sejtjein az esetek 65%-ában csökkent CD32-expressziót. A párhuzamosan végzett PCR-vizsgálatok eredményei a csökkent CD35-expressziót mRNS-szinten is alátámasztották, a csökkent CD32-expressziót azonban mRNS-szinten nem tudtuk kimutatni.
 


Complex studies of immunecomplex-binding receptors expressed on B-lymphocytes and monocytes in RA and SLE patients
It has been raised recently that alterations in the function and/or expression of Fcg and complement receptors can be considered as susceptibility factors in the pathogenesis of human autoimmune diseases. We carried out complex studies on RA and SLE patients, investigating alterations of these immunocomplex-binding receptors as possible risk factors. Blood samples of 25 controls with non-inflammatory degenerative rheumatic diseases, 40 RA patients as well as 10 SLE patients were studied. We investigated the expression of FcgRs (CD64, CD32, CD16), complement receptors (CD21, CD35, Mac-1), mIgG+IgM, MHCII and the activation marker CD69 expressed on B-lymphocytes and monocytes. In selected cases PCR analysis of FcgRII and CD35 was also performed. Cytofluorymetric measurements showed decreased expression of CD35 on the surface of B-cells and increased CD64 expression on monocytes from all patients with SLE as compared to controls. Parallel to the decrease of CR1, its mRNA expression in the same patients was also strongly reduced indicating that the decrease is due to diminished production. At the same time lower expression of FcgRII was not supported by PCR analysis. The expression of CD64 on monocytes was markedly increased in 75 percent of RA patients. On the other hand decreased expression of CD32 on B-lymphocytes was observed in 65 percent of the same patients. Disease activity or treatment with immunosuppressants or steroids did not show any correlation with our results.

42. Plazmasejtmarkerek áramlási citometriai vizsgálata myeloma multiplexben (P51)

Jakab Katalin, Gopcsa László, Németh Julianna, Sipos Andrea, Pálóczi Katalin
Országos Gyógyintézeti Központ, Budapest

Bevezetés:
A myeloma multiplex (MM) diagnózisához általában nincs szükség áramlási citometriás vizsgálatra, azonban hasznos lehet a normális és malignus plazmasejtek elkülönítésében. A kóros plazmasejtek fenotípusát myeloma multiplexben CD38-, CD138- és CD56-pozitivitás jellemzi, míg gyakori a CD19-negativitás. Az intracitoplazmatikus (ic) könnyűlánc-meghatározás mellett fontos a p63 protein meghatározása is: ez egy II-es típusú transzmembránfehérje, az endoplazmatikus reticulumban helyezkedik el. A Vs38c monoklonális antitest ezt a fehérjét ismeri fel a humán plazmasejtekben. Vizsgálatunkban kezelt és perifériás őssejt átültetésére váró myeloma multiplexes betegeken különböző plazmasejtmarkereket hasonlítottuk össze.
Módszer: Tizenegy myeloma multiplexes beteget vizsgáltunk (három férfi, nyolc nő, átlagéletkor 52,9±3,9 év). Cristabiopszia, kromoszómaanalízis, immunfenotípus-meghatározás történt, és meghatároztuk az immunglobulin-nehézlánc (IgH) génátrendeződését. A laboratóriumi vizsgálatok részeként immunfixációs elektroforézis- (IFE-), kreatitin-, összfehérje és Ca++-szint-meghatározást végeztünk, a Durie–Salmon-status megállapításához. A csontvelői aspirátum-fenotípus vizsgálatához kettős és hármas jelölést alkalmaztunk: CD45/CD14, CD7/CD3, CD10/CD20, ic k/CD38, ic l/CD38, icVs38c/CD38, CD38/CD56/CD19, CD38/CD138/CD19.
Eredmények: Tizenegy beteg közül hat esetben tudtunk áramlási citometriával intracitoplazmatikus könnyűlánc-expressziót kimutatni, ez megegyezett az immunfixációs elektroforézis eredményével. Multiplex regressziós módszer alkalmazásával pozitív korrelációt találtunk az icVs38c+/CD38+ koexpressziója és a csontvelői plazmasejt-infiltráció mértéke között (r=0,83, p=0,001). Hasonló korrelációt mutatott a fényes CD38+ sejtek között a CD56+/CD19 és a CD138+/CD19 markereket hordozó sejtpopuláció aránya (r=0,76, p=0,01). A kromoszómavizsgálat hat esetben bizonyult sikeresnek, a többi esetben nem volt értékelhető számú mitózis. Csak egy betegnél találtunk 13q-deletiót rossz prognosztikai faktor megjelenéseként, és öt esetben a karyotípus normális volt. Egy betegnél IgH-transzlokációt igazoltunk. Nem találtunk összefüggést a klinikai paraméterek és a fenotípus- vagy kromoszómaeredmények között.
Megbeszélés: A myeloma multiplexet a csontvelői plazmasejtek túlburjánzása jellemzi. Ezek a sejtek fokozott CD38-expressziót mutatnak; egyéb specifikus antigének koexpreszsziója is látható, úgymint a CD138 és az intracitoplazmatikus immunglobulinok. A CD56 és CD19 egyidejű meghatározása a legtöbb esetben lehetővé teszi a normális és malignus plazmasejtek elkülönítését. A vizsgálatunkban talált pozitív korreláció a Vs38c-expresszió és a csontvelői plazmasejt-infiltráció között javíthatja az áramlási citometria szenzitivitását.
 


Flow cytometry detection of plasmacell markers in multiple myeloma
Background and objective: The diagnosis of multiple myeloma (MM) usually does not require flow cytometry, but it could be useful to distinguish normal plasma cells (PCs) from malignant PCs. Malignant PCs in the MM are intensely CD38+, CD138+ and CD56+, but they are often negative for CD19. Beside cytoplasmic immunoglobulin (light chain) analysis could be important detection of p63 protein, which is an intracellular type II transmembrane protein locating in the rough endoplasmic reticulum. Vs38c antibody reacts directly against p63 protein in human plasma cell. Our goal to identify plasmacytic differentiation with various PC markers in pretreated patients with MM, to whom there were planned peripheral blood stem cell transplantation (PBSCT).
Methods: Eleven patients with MM (male three, female eight, mean age 52.9±3.9 years) were collected in our study. Bone marrow (BM) biopsy, karyotype, immunophenotype and immunoglobulin heavy-chain (IgH) translocation were examined. Laboratory investigations included immunofixation electrophoresis (IFE), creatinin, total protein, Ca2+ level for determine Durie–Salmon phase. For the immunophenotype measurement from BM aspirates we had applied two and three colour fluorescence in the monoclo-nal antibody (MoAb) panels: CD45/CD14, CD7/CD3, D10/CD20, intracellular (ic) k/CD38, icl/CD38, icVs38c/CD38, CD38/ CD56/CD19, CD38/CD138/CD19.
Results: In six cases out of 11 we could detected ic light chain expression by flow cytometry, that was equal IFE. In the analysis with multiple regression model we found positive correlation between icVs38c+/CD38+ co-expression and the PC infiltration of the BM (r=0.83, p=0.001). Same correlation was shown between ratio of CD56+/CD19– and CD138+/CD19– cell population in the bright CD38+ cells (r=0.76, p=0.01). Cytogenetic analyses were taken in 6/11 since in the other cases were not valuable mitoses. Only in one case was detected 13q- deletion as poor prognostic marker and the five cases were shown normal karyotype. We have found IgH translocation in one occasion. No connection was discovered among clinical parameters and the immunphenotype or karyotype.
Discussion: MM is characterised by the expansion of tumour plasma cells in the bone marrow. These cells have shown high CD38 expression and coexpression of specific antigens, such as CD138 and cytoplasmic immunoglobulins. The simultaneous analysis of CD56 and CD19 expression is able to distinguish normal from malignant plasma cells in most cases. Sensitivity can be improved with apply of Vs38c antibody showing correlation PC infiltration of BM in our study.
 


43. A mannankötő lektin polimorfizmusának szerepe SLE-ben (P33)

Jakab László1, Laki Judit1, Temesszentandrási György1, Pozsonyi Teréz1, Kalabay László1, Sallai Katalin2, Varga Lilian1, Vatay Ágnes1, Madsen Hans O.3, Garred Peter3, Füst György1, Fekete Béla1
1Semmelweis Egyetem, III. Sz. Belgyógyászati Klinika, 2Központi Immunológiai Laboratórium, Budapest; 3Tissue Typing Laboratory, Department of Clinical Immunology, Rigshospitalet, Koppenhága, Dánia

A mannankötő lektin (mannan-binding lectin, MBL) kollektin típusú plazmafehérje. Plazmakoncentrációját genetikusan a strukturális gén és a promoterrégió alléljeinek polimorfizmusa határozza meg. Az MBL-polimorfizmust 66 SLE-s betegen és 90 egészséges kontrollon vizsgáltuk SSP-PCR módszerrel. Nem találtunk szignifikáns különbséget a vad (A) és a variáns (O) MBL-allélekben az SLE-s betegeken és az egészséges kontrollokon (p=0,3248), ezzel szemben SLE-s betegeken a low-producer és non-producer LXPA haplotípus szignifikánsan gyakrabban fordult elő (p=0,0162). A C1q-antitestek szérumszintjei 18,1 (14,0–34,3) U/ml, 16,0 (9,5–24,7) U/ml és 4,4 (2,8–7,2) U/ml voltak az A/A, A/O és O/O MBL genotípusú SLE-s betegek esetén. Az IgG-antikardiolipin antitestek szérumszintje majdnem kétszer olyan magas volt (p=0,0275) az LXPA haplotípusú egyedeknél [14,0 (6,0–20,0) U/ml], mint a non-carrierek esetén [8,0 (4,5–11,0) U/ml]. Az SLE-asszociált vasculitis és pericarditis szignifikánsan gyakoribb (p=0,0415 és 0,0085) volt a homozigóta egyedek körében (O/O), mint a többi betegnél. Eredményeink az MBL-polimorfizmus és az SLE közti kapcsolatra utalnak.
A munka az Athernet QLG1-CT-2002-90397 EU grant és az OTKA T46496 támogatásával készült.
 


The role of mannan-binding lectin polymorphism in SLE
Mannan-binding lectin (MBL) is a collectin-type plasma protein. The plasma concentration of MBL is genetically determined by a series of allelic polymorphism located both in the structural gene and in the promoter region. The MBL polymorphism was investigated in 66 patients with SLE and 90 healthy controls by SSP-PCR. There was no significant difference in the distribution of the carriers of the wild (A) and variant (O) MBL alleles in SLE patients and healthy controls (p=0.3248), whereas carriers of the low-producer or non-producer LXPA haplotype occurred more frequently among the SLE patients (p=0.0162). Serum levels of the anti-C1q antibodies were 18.1 (14.0–34.3) U/ml, 16.0 (9.5–24.7) U/ml and 4.4 (2.8–7.2) U/ml among the patients with A/A, A/O and O/O MBL genotypes, respectively. Serum concentrations of IgG anticardiolipin antibodies were almost twice higher (p=0.0275) among the carriers of the LXPA haplotype [14.0 (6.0–20.0) U/ml] than in the group of non-carriers [8.0 (4.5–11.0) U/ml]. The incidence of SLE-associated vasculitis and pericarditis was significantly higher (p=0.0415 and 0.0085) in homozygous carriers (O/O) of MBL variant alleles than in the rest of patients. Our findings shed a new light on the relationship between MBL polymorphisms and SLE.
The work was supported by Athernet QLG1-CT-2002-90397 EU grant and OTKA T46496 grant.
 


44. Az antiintegrin antitestekkel kiváltott neutrophilválaszokban alapvető jelentőségű az alacsony affinitású Fcg-receptorokon keresztül létrejövő kostimuláció: a teljes aktivációhoz mind integrin, mind integrinektől független szignál szükséges (P16)

Jakus Zoltán1, Berton Giorgio2, Ligeti Erzsébet1, Lowell Clifford A.2, Mócsai Attila1
1
Semmelweis Egyetem, Élettani Intézet, Budapest; 2Department of Pathology, Section of General Pathology, University of Verona, Verona, Olaszország; 3Department of Laboratory Medicine, University of California, San Francisco, USA

Nem tisztázott az integrin, illetve az integrinektől független szignálok részvétele a neutrophil sejtek aktivációjában. Korábban kimutatták, hogy nagymértékű szuperoxid-termelés váltható ki felszínhez kötött antiintegrin antitestekkel. Ezen adatok alapján azt gondolták, hogy a sejtek aktiválásához az integrinek keresztkötése önmagában elégséges, viszont eddig nem vizsgálták más receptorok esetleges szerepét a rendszerben.
Munkánkban kimutattuk, hogy az antiintegrin antitestekkel kiváltott neutrophilválaszokhoz az alacsony affinitású Fcg-receptorokon (FcgR) keresztül létrejövő kostimuláció szükséges. A b1-, b2- vagy b3-antiintegrin, immobilizált antitestekkel indukált válaszok az FcRg-lánc-, illetve az FcgRIII-hiányos egér neutrophil sejtekben teljesen károsodottak, illetve az FcgRII/III-at blokkoló antitest kivédte a vad típusú sejtek aktivációját. Felszínhez kötött anti-CD18 antitest jelentős szuperoxid-termelést vált ki humán neutrophilekben, azonban a válasz megszűnik, ha ezen antitestekből preparált F(ab’)2-t használunk, vagy a sejteket FcgRIIA-blokkoló antitesttel előinkubáljuk. TNF-stimuláció hatására fibrinogén, valamint az rICAM-1 felszínén létrejövő válaszokat nem befolyásolta az FcgRIII hiánya, illetve az FcgR-eket blokkoló antitestek alkalmazása. Az anti-CD18-felszínen a TNF visszahozza a szuperoxid-termelést az FcgRIII-hiányos neutrophilekben. A p38 MAP-kináz-inhibitor SB203580 gátolja az immobilizált anti-CD18-on, valamint a TNF hatására fibrinogénfelszínen kialakuló válaszokat.
Eredményeink arra utalnak, hogy az alacsony affinitású FcgR-eken keresztüli stimuláció szükséges az antiintegrin antitestekkel kiváltott válaszokhoz, valamint alapvető jelentőségű a második, koaktivátor szignál (a TNF-en vagy az FcR-kötésen keresztül) a neutrophilek integrinek által mediált aktivációjához. Ezek a másodlagos, integrinektől független szignálok felcserélhetők, és a p38 MAP-kinázban konvergálnak.


Responses of neutrophils to anti-integrin antibodies depends on costimulation through low-affinity
fcg-receptors: full activation requires both integrin and non-integrin signals

The relative contribution of integrin and non-integrin signals to neutrophil activation is incompletely understood. Immobilized anti-integrin antibodies were previously shown to induce robust activation of neutrophils without any additional stimulus, suggesting that cross-linking of integrins is sufficient for full activation of the cells. However, the possible contribution from other receptors has not been tested in this system.
Here we show that neutrophil responses to anti-integrin antibodies requires costimulation through low-affinity Fcg-receptors (FcgR). Murine neutrophils lacking the Fc-receptor g-chain or FcgRIII failed to respond to immobilized antibodies against b1, b2 or b3 integrins and the activation of wild type cells could be prevented by blocking antibodies against FcgRII/III. Plate-bound anti-CD18 antibodies initiated a respiratory burst from human neutrophils, but this response was abrogated when the F(ab’)2 of the same antibodies were used or the cells were preincubated with FcgRIIA-blocking antibodies. Lack of FcgRIII or administration of FcgR-blocking antibodies had no effect on responses of TNF-stimulated cells plated on fibrinogen or recombinant ICAM-1. TNF restored the respiratory burst of FcgRIII-deficient neutrophils plated on anti-CD18 mAbs. The p38 MAP kinase inhibitor SB203580 attenuated the responses of neutrophils to anti-CD18 mAbs or TNF stimulation on a fibrinogen surface.
These results indicate that activation of low-affinity Fcg-receptors are required for neutrophil responses induced by anti-integrin antibodies and suggest that a second co-activation signal (e.g. through TNF or Fc-receptor ligation) is indispensable for full integrin-mediated activation of neutrophils. These second signals are interchangeable and they may converge on the p38 MAP kinase.


45. Az egér dendritikus sejtjeinek H4-receptora számos hisztaminhatás kiváltásában vesz részt
(P5)

Jelinek Ivett1, László Valéria1, Pállinger Éva2, Hegyesi Hargita1, Thurmond Robin L.,3 Falus András1, 2
1Semmelweis Egyetem, Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet, 2Magyar Tudományos Akadémia-Semmelweis Egyetem, Molekuláris Immunológiai Kutatócsoport, Budapest; 3Johnson & Johnson Pharmaceutical Research and Development, San Diego, USA
A hisztamin fontos szerepet játszik a dendritikus sejtek differenciálódásában, valamint citokintermelésüket is szabályozza. Nem világos azonban, hogy hatásait mely receptorokon keresztül fejti ki. Az elmúlt tíz év egyik érdekes eredménye volt, hogy az egér dendritikus sejtjei a H1- és a H2-receptorokon kívül a legutóbb felfedezett H4-receptort is expresszálják. Kísérleteinkben H4-receptor-hiányos (H4R-KO) egereket használtunk annak bizonyítására, hogy a H4-receptor fontos szerepet játszik a dendritikus sejtek fejlődésében.
Eredményeink azt mutatják, hogy a H4R-KO egerekben több CD11c+ dendritikus sejt található, mint a vad típusúakban. A dendritikus sejtek alpopulációiban is eltérést találtunk a vad és a H4R-KO egerek között. Az utóbbiakban kevesebb CD8a+ és több CD4+ dendritikus sejt volt; ez arra utal, hogy a H4R-KO egerekben a lymphoid és a myeloid eredetű dendritikus sejtek aránya myeloid irányba tolódik el. A dendritikus sejtek génexpressziós vizsgálata azt mutatta, hogy a H4R-KO egerek dendritikus sejtjei kevesebb IL-10-et és GATA-3-at expresszálnak. Megnőtt az L-hisztidin-dekarboxiláz (HDC), a hisztamint szintetizáló enzim és a H1-receptor expressziója is.
Eredményeink szerint az újonnan felfedezett H4-receptor fontos szerepet játszik a hisztamin dendritikus sejtekre kifejtett hatásaiban.
 


H4R is implicated in various effects exerted by histamine on mouse dendritic cells
Histamine has an important role in dendritic cell differentiation and also regulates cytokine production by these cells. It is not clear through which type of histamine receptors are these effects performed. In the last decade murine dendritic cells (DCs) were found to express – beside histamine H1- and H2-receptors – the novel histamine receptor H4 (H4R). In our study we used H4R-deficient (H4R-KO) mice to demonstrate that histamine H4R has a critical role in dendritic cell development. We found that mice lacking H4R produce higher amounts of CD11c+ DCs than their wild type littermates.
There were also differences in dendritic cell subpopulations between wild type and H4R-KO mice. Compared to wild type animals, less CD8a+ and more CD4+ dendritic cells were found in H4R-KO mice, which suggests that in H4R-KO mice the lymphoid-myeloid ratio is shifted towards myeloid origin. Gene expression studies of dendritic cells demonstrated that DC-s from H4R-KO mice produce less interleukin-10 (IL-10) and GATA-3. In addition, an increased level of the histamine producing enzyme, L-histidine-decarboxylase (HDC) and H1R expression was detected. Our results provide evidence that histamine contributes to dendritic cell functions through the newly discovered H4-receptor.
 


46. A TNF reverz szignál jelátviteli molekulái (E7)

Juhász Kata, Wilhelm Imola, Ungvári Ildikó, Duda Ernő
Magyar Tudományos Akadémia, SZBK, Biokémiai Intézet, Szegedi Tudományegyetem, Orvosi Mikrobiológiai és Immunbiológiai Intézet
 
Az immunsejtek újonnan felfedezett szabályozási folyamatát, a kétirányú jelátvitelt a TNF-család tagjainál figyelték meg. A kölcsönhatás a TNF, illetve a TNF-receptor-termelő sejtek között kétirányú jelfolyamatot indít be: a TNF-receptor által aktivált szignálutak mellett a TNF aktiválódása is megfigyelhető, ami egy fordított, reverz szignál létrejöttét eredményezi. (A jelenség a TNF-család többi, transzmembrán formában termelődő tagjánál is megfigyelhető.)
Korábban leírtuk a TNF-molekula receptorszerű tulajdonságait (klasztering kiváltotta defoszforiláció, nukleáris transzport, Ca-jel stb.). Jelen vizsgálataink tárgya a TNF intracelluláris doménjével kölcsönhatásra lépő TIP-fehérje, ez a TNF mellett a kazein-kináz 2-vel és a c-Jun transzkripciós faktorral is képes komplexet alkotni. Feltehetőleg a plazmamembrán és a mag között ingázik, hiszen lipidkötő (PH), cytoskeletonnal kölcsönható és DNS-/kromatinkötő doménekkel is rendelkezik.
A TIP túltermeltetése (a c-Jun túltermeltetésével szinergizálva) fokozza a TNF promoteraktivitását; ez jó összhangban áll a korábbi megfigyeléssel, hogy a reverz szignál a MAPK út aktiválásával jár.
Egyre több irodalmi adat támasztja alá a reverz jelút klinikai jelentőségét, ezért kísérleteket folytatunk a folyamatban szerepet játszó molekulák azonosítására és jellemzésére.
 


TNF reverse signaling: molecular mechanisms
The 26 kDa transmembrane form of tumor necrosis factor (TNF) – as well as other membrane-associated members of the TNF family – serve both as ligands and receptors. Induced clustering of TNF leads to dephosphorylation (and probable depalmitoylation) of the molecule, association with a recently identified molecule, TIP (TNF intracellular domain interacting protein), eventually resulting in the nuclear translocation of a 10 kDa fragment of TNF. A cytoplasmic Ca signal and subsequent changes in gene activity patterns indicate that the reverse signal alters the metabolic state of the TNF-producing cells.
TIP (possessing a pleckstrin homology domain and DNA- and chromatin-binding sequences) seems to shuttle between the plasmamembrane and the nucleus. It also associates with casein kinase 2 and c-Jun. The reverse signal activates the MAPK pathway and results in very different alterations in lymphocytes and myeloid cells. While the reverse signal can be considered as an activation signal in T-cells, it decreases the sensitivity of macrophages to LPS.
Experiments are under way to identify signaling molecules and pathways participating in the reverse signaling, as the phenomenon seem to play an important role in the fine tuning of the immune response.
 


47. A teve MHC I típusú neonatalis Fc-receptorának (FcRn) klónozása és karakterizálása (P6)

Kacskovics Imre1, Mayer Balázs1, Kis Zsuzsanna1, Frenyó V. László1, Muyldermans Serge2, Hammarström Lennart3
1
Szent István Egyetem, Állatorvostudományi Kar, Élettani és Biokémiai Tanszék, Budapest; 2Department of Cellular and Molecular Immunology, Vlaams Interuniversitair instituut Biotechnologie, Vrije Universiteit Brussel, Brüsszel, Belgium; 3Division of Clinical Immunology, Department of Laboratory Medicine, Karolinska Institute, Stockholm, Svédország

A teve (Camelus dromedarius)
szaporításának egyik legjelentősebb problémája a magas mortalitás a teveborjak első három hónapja során; ezt az állattenyésztési módszerek alacsony színvonala, valamint a fertőző betegségek okozzák. Az újszülött borjaknak nincs saját immunvédelmük, mivel ebben a fajban nem valósul meg az immunglobulinok placentán keresztüli transzportja. Az IgG epithelsejteken keresztüli transzportját számos szövetben a neonatalis Fc-receptor (FcRn) biztosítja. Ennek megfelelően az FcRn szerepet játszhat a tőgy immunglobulin-transzportjában is. Korábbi vizsgálatainkkal ezt a receptort juh és szarvasmarha tőgyszövetének acinus- és ductussejtjeiben detektáltuk. Kimutattuk továbbá, hogy a receptor lokalizációja jelentős különbséget mutat az ellést megelőzően és azt követően; ez arra utal, hogy az FcRn valóban részt vesz az IgG tőgyszöveti szekréciójában.
Annak érdekében, hogy az FcRn szerepét a teve tőgyszövetében vizsgálhassuk, először klónoztuk és elemeztük a teve (Camelus dromedarius) FcRn-nehézlánca cDNS-molekuláját, az úgynevezett RACE (rapid amplification of cDNA ends) módszerrel. A cDNS hossza 1549 bp, a belőle származtatott peptid 355 aminosav hosszúságú. A nehézlánc nagyfokú hasonlóságot mutat a többi állatfaj FcRn-molekuláihoz: három extracelluláris doménból, egy hidrofób transzmembrán régióból, valamint egy citoplazmikus szakaszból áll. Filogenetikai elemzéseink során kiderült, hogy az egyes állatfajok között nagyfokú homológiát mutat az Fcg megkötésében részt vevő a2-domén. A citoplazmikus domén – a többi haszonállathoz hasonlóan – rövidebb, mint az ember, illetve egér esetében, továbbá hiányzik belőle a Ser313 aminosav-maradvány, amely kritikus szerepet játszik az apicalis-basolateralis irányú IgG-transcytosisban, ám nem befolyásolja a basolateralis-apicalis irányú transzportot. A dromedár FcRn-mRNS-molekuláját és a kódolt fehérjét reverztranszkriptáz PCR és immunhisztokémiai módszerekkel mutattuk ki a tőgyben és a májban. Mindezek az eredmények arra utalnak, hogy az FcRn ebben a fajban is részt vesz a tejmirigy IgG-szekréciójában.
 


Cloning and characterization of the camel (Camelus dromedarius) MHC class I related neonatal Fc receptor (FcRn)
A major problem in camel productivity is the high mortality rate of camel calves in the first three months. The causes for mortality are mainly poor management practice and infectious diseases. The newborn calf has no natural protection against diseases, as there is no antibody transfer from the mother during fetal development. In ruminants, maternal immunity is exclusively mediated by colostral immunoglobulins. Transport of immunoglobulin G across epithelial cell barriers occurs by the neonatal Fc receptor (FcRn) in several tissues and hence the FcRn may also play a role in IgG transport in the mammary gland. In our previous studies we have localized this receptor to the epithelial cells of mammary gland acini and ducts in ewes and in cows. We also detected different localization of FcRn in these cells before and after parturition in their mammary glands suggesting that FcRn is involved in the IgG secretion.
To determine the presence of FcRn in the camel mammary gland, we first cloned and characterized the camel (Camelus dromedarius) FcRn cDNA by rapid amplification of cDNA ends (RACE) and determined to be 1549 base pairs in length that codes for a 355 amino acid peptide. The deduced amino acid sequence shows high similarity to the FcRn in other species, and it consists of three extracellular domains, a hydrophobic transmembrane region and a cytoplasmic tail. Based on phylogenetic analysis the FcRn heavy chains of various species show high degree of homology in the a2 domain, which is involved in binding Fcg. The cytoplasmic tail is similarly short as its counterparts of livestock species compare to human and rodents but is deficient in Ser313 which is considered crucial for apical to basolateral transcytosis but not to the basolateral to apical transport. Expression of the dromedary FcRn mRNA and its peptide was detected by reverse transcriptase-PCR and immunohistochemistry in the mammary gland and liver. These results indicate that the FcRn have a role in the mammary gland immunoglobulin secretion in dromedary, too.

48. Az immunválasz szabályozása ultraibolya fénnyel (E2)

Kemény Lajos1, Koreck Andrea1, Csoma Zsanett1, Ignácz Ferenkhi2 , Bor Zsolt2, Szabó Gábor2, Bodai László1, Kadocsa Edit3, Dobozy Attila1
Szegedi Tudományegyetem, 1Bőrgyógyászati és Allergológiai Klinika, 2Optikai és Kvantumelektronikai Tanszék, 3Fül-Orr-Gégészeti és Fej-Nyaksebészeti Klinika
 
Az ultraibolya (UV) és a nagy intenzitású látható fény helyi és szisztémás immunszuppressziót vált ki. Az ultraibolya-irradiáció gátolja a késői típusú túlérzékenységi reakció szenzitizációs és elicitációs fázisát, továbbá hapténspecifikus tolerancia kialakulását eredményezheti, amelyért IL-10-termelő szabályozó T-sejtek (Tr1) felelősek. Nemrégiben munkacsoportunk kimutatta, hogy az ultraibolya fény gátolja az azonnali típusú túlérzékenységi reakció effektorfázisát. Ezen túlmenően, a szenzitizáció előtt végzett ultraibolya-fény-irradiáció gátolja az asthma kialakulását egérben. Jelen referátumban az ultraibolya fény ezen immunszuppresszív hatásainak mechanizmusát ismertetem.
 


Immunoregulation by ultraviolet light
Phototherapy using ultraviolet
(UV) and/or high intensity visible light induces local and systemic immunosuppression. UV radiation inhibits both the sensitization and the elicitation phase of the delayed-type hypersensitivity reaction, and also induces hapten specific tolerance that is mediated by IL-10 producing Treg cells. Recently we have shown that UV light is also cabable to inhibit the effector phase of the immediate type hypersensitivity reaction. In addition, UV light has been also shown to suppress the induction of asthma in mice. In the present review the mechanisms of UV induced immunosuppression will be discussed.
 


49. Az SHP-2-enzimaktivitást szelektíven módosító foszfopeptid-mimetikumok tervezése és funkcionális analízise (P36)

Kertész Ákos1, Takács Balázs1, Kövesdi Dorottya1, Váradi Györgyi2, Tóth K. Gábor2, Sármay Gabriella1
1Eötvös Loránd Tudományegyetem, Immunológiai Tanszék, Budapest; 2Orvosi Vegytani Intézet, Szegedi Tudományegyetem

A sejtek növekedésének és differenciálódásának szabályozásában kiemelkedő szerep jut a fehérjék tirozinoldalláncokon történő foszforilációjának és defoszforilációjának. A sejtaktiváció során az SH2-doméneket tartalmazó tirozinfoszfatáz SHP-2 a sejtmembránhoz szállítódik, ahol számos tirozinon foszforilált molekulával léphet kapcsolatba, mint például receptor-tirozin-kinázok, adhéziós molekulák és adapterfehérjék. Az SH2-domén és a tirozinon foszforilált motívumot tartalmazó fehérje kölcsönhatása aktiválja a foszfatázt. Az SHP-2 sejtnövekedést előidéző, pozitív szabályozószerepe a jelátviteli kaszkádban felhívja a figyelmet a tumoros folyamatokban betöltött lehetséges funkciójára. Az SHP-2 gyógyszercélpont-molekulaként jöhet szóba egyes rákos megbetegedések terápiás kezelésében. Célunk olyan foszfopeptid-mimetikum előállítása, amely célzottan a tumorsejtekbe juttatva, a sejtek pusztulását idézi elő.
Kísérleteinket olyan molekulákból származó peptidekkel végeztük, amelyek in vivo körülmények között az SHP-2 természetes szubsztrátjai lehetnek (FcgIIb, Gab1).
A korábbi vizsgálati eredmények szerint az Fcg-receptor foszforilált ITIM-motívuma és a Gab1-molekula 621GD-(p)Y-LD633-szekvenciája nagy affinitással kötődik az SHP-2-fehérjéhez. Kimutattuk, hogy csak a Gab1 eredetű foszfopeptidek képesek a rekombináns SHP-2 enzim aktivitásának fokozására in vitro.
A kiválasztott 621GD-(p)Y-LD633 Gab1-peptidet próbáltuk BL41-sejtekbe juttatni oly módon, hogy N-terminálisan különböző, membránpermeábilis (MPS), a sejtmembránon való átjutást elősegítő molekularészekkel bővítettük. Vizsgáltuk a sejtekben kialakuló tirozinfoszforilációs mintázat, illetve sejtaktiváció változását. Kísérleteink során először Palmitil-Arg(8) membránpermeábilis szekvenciát kötöttünk a GDLD- peptidhez. Ez a konstrukció magában is tirozinfoszforilációt indukált, sőt a Palm-R8 önmagában fokozta a sejtek pusztulását. Ezek után a palmitilcsoport elhagyásával megismételve a kísérletet azt tapasztaltuk, hogy az R8 magában nem okozott változást a sejtekben, míg a GDLD-peptidhez kötve több fehérje (például: Lyn) tirozinfoszforilációját indukálta.
A peptidek sejten belüli lokalizációjának tisztázására konfokális és fluoreszcens mikroszkópos vizsgálatokat végeztünk. Megállapítottuk, hogy a kumarinnal jelölt Palm-R8-467IQ(p)YGP478 (Gab1) peptid fluoreszcens mikroszkópos vizsgálat alapján a sejtmembránhoz kötődik. További foszfopeptid-származékok vizsgálata folyamatban van.
 


Design and functional analysis of membrane permeable phoshopeptides selectively modifying SHP-2 enzyme activity
Tyrosine phosphorylation plays an important role in controlling cellular growth, and differentiation. Upon cell activation with different stimuli, the SH2-domain containing protein tyrosine phosphatase SHP-2 is recruited to the plasma membrane where it can associate with a number of tyrosine phosphorylated molecules, including receptor tyrosine kinases, adapter proteins and cell adhesion molecules. Interaction of the SH2-domain with phosphorylated tyrosine containing motifs activates the phosphatase. The positive regulatory role of SHP-2 in signaling cascades leading to cell growth suggest that it is involved in tumor development, raising the possibility that SHP-2 may be an attractive target for the pharmacologic intervention of malignant cell growth. We aim to construct such phosphopeptide-mimetic, which is able to trigger programmed cell death.
We used in our experiments synthetic tyrosine phosphorylated peptides corresponding to the in vivo substrates of SHP-2 (FcgRIIb, Gab1).
Previous studies have shown that phosphopeptides corresponding to the immunoreceptor tyrosine based inhibitory motif (P-ITIM) of Fcg receptor IIb and a phosphorylated motif of Gab1 (621GD-(p)Y-LD633 ), respectively, associate to SHP-2 with high affinity. However, we demonstrated that only Gab1 peptides could efficiently increase the activity of recombinant SHP-2 in an in vitro phosphatase assay.
Hereafter 621GD-(p)Y-LD633 peptide was N terminally extended by a membrane permeable sequence (MPS) facilitating its transport through the cell membrane. A peptide composed of 8 Arg was coupled to a palmytoil group to enhance membrane permeability. Palm-R8-GD-(p)-Y-LD induced tyrosine phosphorylation of several proteins in BL41 Burkitt lymphoma cells. On the other hand, Palm-R8 alone also induced tyrosine phosphorylation and decreased viability of the cells. R8 alone had no effect, while the R8-GD-(p)-Y-LD peptide induced tyrosine phosphorylation of some protein (e.g. Lyn) in BL41 cells.
Intracellular localization of the modified peptides was studied by confocal and fluorescence microscopy. We have shown that Palm-R8 coupled to an other phosphopeptide of Gab1 (Palm-R8-467IQ(p)YGP478) and labeled with fluorescent dye cumarine, binds to the membrane of BL41 cells. Studies with additional derivatives of phosphopeptides are under way.


50. Tartós repopulációra képes vérképző őssejtek szaporodása immobilizált Jagged-1 és korai citokinek egyidejű jelenlétében, in vitro kultúrában (P32)

Kertész Zsuzsanna1, Vas Virág1, Pozsonyi Éva2, Kozma András3, Pálóczi Katalin4, Uher Ferenc1
Országos Gyógyintézeti Központ, 1Őssejtbiológiai Osztály, 2Immungenetikai Osztály, 3Citogenetikai Laboratórium, Budapest; 4Semmelweis Egyetem, Immunológiai, Hematológiai és Transzfuziológiai Tanszék, Budapest
 
A Notch egy filogenetikailag ősi, a soksejtű szervezetek differenciálódása során nélkülözhetetlen sejt-sejt kölcsönhatásokat biztosító és az érintett sejtek további sorsát meghatározó jeltovábbító rendszer. A vérképző ős- és elődsejtkompartmentben – többek között – a Notch-rendszer biztosítja az önfenntartó osztódás(ok) és a differenciálódás megfelelő egyensúlyát, azaz a folyamatos vérképzés fenntartását. A közelmúltban munkacsoportunk számolt be arról, hogy a stromatenyészetek vagy Sepharose-4B-szemcsék felszínén immobilizált Jagged-1-fehérje (a csontvelőben legnagyobb mennyiségben előforduló Notch-ligandum) rekombináns őssejtfaktor (SCF), Flt3-ligandum (Flt3L), és trombopoetin (TPO) egyidejű jelenlétében önfenntartó osztódásra készteti a macskakőkultúrában csak 28–35 nap után kolóniát képző, fiatal haematopoeticus sejteket. Nem volt azonban egyértelmű bizonyítékunk arra, hogy a multivalens Jagged-1 fokozza-e ezekben a kultúrákban az in vivo tartós repopulációra képes, valódi vérképző őssejtek (HSC) önfenntartó osztódását is? Jelen munkánkban – a sejtek sorozatos transzplantációjával – igazoltuk, hogy a Jagged-1-gyel fedett Sepharose-4B-szemcsék SCF, Flt3L, és TPO egyidejű jelenlétében a valódi vérképző őssejteket is önfenntartó osztódás(ok)ra késztetik in vitro kultúrában. Hím BDF1 egerek lin- csontvelősejtjeit két hétig tenyésztettük multivalens Jagged-1-ligandum és a három citokin jelenlétében, majd 800 vagy 4000, a kultúrákból származó tesztsejtet 2×105 legyengített csontvelősejttel együtt öt-öt, letálisan besugárzott (9 Gy) szingén nőstény állatba oltottuk. Tíz hónappal később ezeket a primer recipienseket megöltük és csontvelősejtjeiket újabb, letálisan besugárzott nőstény egerekbe (szekunder recipiensekbe) oltottuk át (106 sejt/állat iv.). A második transzplantáció után hat hónappal a szekunder recipienseket is megöltük és vizsgáltuk, hogy vannak-e Y kromoszómát hordozó sejtek a vérképző rendszerükben? Az Y kromoszóma-pozitív sejtek jelenlétét egy zfy génre specifikus PCR és Y-kromoszóma-specifikus FISH segítségével mutattuk ki a csontvelőmintákban. Megállapítottuk, hogy két hét után az összes, rekombináns növekedési faktorokat tartalmazó kultúrában ~8–14-szeresére nőtt a magvas sejtek száma. A tartós in vivo repopulációra képes valódi vérképző őssejtek aránya és abszolút mennyisége azonban – a Jagged-1-gyel fedett Sepharose-4B-t is tartalmazó kultúrák kivételével – jelentősen csökkent. A mutivalens Jagged-1 hatására viszont a tartós repopulációra képes valódi vérképző őssejtek mennyisége is mintegy 10–20-szorosára növekedett a tenyészetekben. Összefoglalásként tehát elmondhatjuk, hogy a Notch jeltovábbító rendszer valóban kulcsszerepet játszik a valódi vérképző őssejtek sorsának meghatározásában. A megfelelő Notch-ligandum(ok) segítségével ezek a sejtek in vitro kultúrában is jól szaporíthatók anélkül, hogy elvesztenék akár önfenntartó, akár in vivo repopulációs képességüket.

 
In vitro
expansion of long-term repopulating ability hematopoietic stem cells by immobilized Jagged-1 and cytokines

Members of the Notch family regulates cell-fate decisions in a wide variety of cell types, including lympho-hematopoietic stem (HSC) and progenitor cells, often inhibiting particular differentiation programs and permitting either self-renewal or differentiation along alternate pathways. Recently, we have shown that Jagged-1 immobilization on stromal layer or on Sepharose-4B beads are required for the induction of self-renewing divisions of day 28–35 cobblestone area-forming cell in the presence of stem cell factor, Flt3-ligand and trombopoietin. However, there is not undisputed evidence for ligand-induced self-renewing proliferation of long-term repopulating ability (LTRA) HSCs. Here, we show that immoblilized Jagged-1-induced Notch activation in cultured lin murine bone marrow (BM) cells substantially enhanced the generation of LTRA stem cells in the concomitant presence of appropriate cytokines. This increase in relative and absolute HSC number was functionally confirmed by serial transplantation of cultured BM-cells. Primary recipients (female BDF1 mice) were irradiated with a single dose of 9 Gy and then injected intravenously with 800 or 4000 male test cells plus 2×105 compromised marrow cells. Ten months after the first transplantation, primary recipients were killed and secondary recipients (new female BDF1 mice) injected with 106 BM-cells from each primary recipient animal after lethal irradiation. A further six months later, marrow samples from the secondary recipients was analyzed for the presence of Y chromosome positive nucleated cells. Zfy gene specific sequence was detected by amplifying DNA in a polymerase chain reaction. Ethidium bromide staining after electrophoresis on agarose gel identified the resulting Y chromosome-specific fragment. Fluorescence in situ hybridization analysis was performed using a rhodamine-labeled total mouse Y chromosome-specific DNA-probe on BM-cells prepared by standard cytogenetic techniques. We found that after two weeks in expansion culture, the absolute number of BM-cells was increased ~8 to 14-fold in all cultures containing recombinant growth factors. However, the frequency of LTRA stem cells was dropped markedly at the same time, except in cultures containing growth factors and Jagged-1-coated Sepharose-4B beads. Thus, the number of early hematopoietic cells was increased ~10 to 20-fold in the presence of multivalent Jagged-1. This selective expansion of LTRA subset was in full agreement with the expansion of Sca-1+ c-kit+ cells and strongly suggested the in vitro amplification of high quality HSCs. In summary, these results support a role for combinatorial effects by Notch and cytokine-induced signaling pathways in regulating HSC fate and suggest the usefulness of Notch ligand in increasing HSC numbers for clinical stem cell transplantation.
 


51. Myelodysplasiás és myelomás betegek mesenchymalis őssejtjeinek plaszticitása (E24)

Kiss Judit1, Kertész Zsuzsanna1, Varga Gergely2, Pető Mónika3, Mikala Gábor3, Vályi-Nagy István3, Uher Ferenc1
Országos Gyógyintézeti Központ, 1Őssejtbiológiai Osztály 3Haematológiai és Belgyógyászati Osztály, 2Semmelweis Egyetem, III. sz. Belgyógyászati Klinika, Budapest
 
A haematopoeticus őssejtek mikrokörnyezetének, az őssejt niche-nek az in vitro vizsgálata myelodysplasiás (MDS) és myeloma multiplexes (MM-) betegek esetében is ellentmondásos eredményekre vezetett. Egyes irodalmi adatok szerint e betegek vérképzést támogató stromája nem károsodott, mások viszont számos kisebb-nagyobb funkcionális eltérést találtak az egészséges emberekből és a betegekből származó stromák között. Jelen munkánkban kilenc egészséges – csípőprotézis-műtéten átesett – donor, valamint hat myelodysplasiában és kilenc myeloma multiplexben szenvedő beteg csontvelőjéből izolált mesenchymalis őssejt- (MSC-) tenyészetét vizsgáltuk, különös tekintettel a sejtek vérképzést támogató stroma, adipocyta, osteoblast, és idegsejt irányú in vitro differenciálódási képességére. A különböző MSC-kultúrákból kialakuló stromarétegek vérképzést támogató képességét az eltérő korú és érettségű haematopoeticus ős- és elődsejtek gyakoriságának egyidejű meghatározására alkalmas, preformált stromarétegen végzett korlátozott hígításos módszer (CAFC, „macskakőkultúra”) segítségével hasonlítottuk össze. A sejtek adipocyta, csontszövet és idegsejt irányú differenciálódását hisztokémiai (Giemsa, Oil Red O, Alizarin Red S festés) és indirekt immunfluoreszcens – monoklonális antineuron-specifikus magfehérje és antienoláz ellenanyag – módszerekkel vizsgáltuk. Megállapítottuk, hogy a myeloma multiplexes betegekből származó stromatenyészetek, az egészséges emberek mesenchymalis őssejtjeiből kialakított stromarétegekhez hasonlóan jól növekednek in vitro, érett állapotban konfluensek, és minden irányba jól differenciálódnak. Ezzel szemben a myelodysplasiás stromák morfológiailag kevésbé egységes képet mutatnak, lassabban növekednek, erősen apoptotikusak és általában nem érik el a konfluenciát. Neuronalis irányba egyáltalán nem képesek differenciálódni és jelentős mennyiségű adipocyta keletkezését is csak két myelodysplasiás beteg stromájában sikerült indukálni. Vérképzést támogató képességük gyakran szintén rosszabb, mint az egészséges emberek vagy myeloma multiplexes betegek csontvelőjéből kialakított stromarétegeké. Mindezek alapján feltételezzük, hogy myelodysplasiás szindrómában a betegség nem csak egy vérképző klónt, hanem a csontvelői stromát is érinti. A betegséget elindító genetikai változás talán egy nagyon korai, a vérképző- és a mesenchymalis őssejteknél fiatalabb, kevésbé differenciálódott őssejtben következik be. Ugyanakkor myeloma multi- plexben olyan kölcsönös parakrin kapcsolatot kell feltételeznünk a neoplasztikus plazmasejtek – a tumor – és a stroma között, amely a betegség progresszióját elősegítő, de korántsem visszafordíthatatlan változásokat – fokozott interleukintermelést, adhéziót stb. – indukál a csontvelői mikrokörnyezetben.
 


Functional abnormalities of bone marrow mesenchymal cells from patients with myelodysplastic syndromes and multiple myeloma
In vitro studies on the functional integrity of the hematopoietic microenvironment (stem cell niche) in myelodysplasia and in myeloma have been controversial. Although some of them suggest that such a microenvironment is functionally normal, there is increasing evidence indicating that there are alterations in the function of adherent stromal cells from myelodysplastic syndromes (MDS) and multiple myeloma (MM) marrow. In the present study we have examined bone marrow (BM) mesenchymal stem cells (MSC) derived from nine normal individuals undergoing elective total hip replacement, and from six MDS and nine MM patients, with emphasis on hematopoiesis supporting capacity and developmental plasticity in vitro. MSCs were isolated based on their ability to adhere and proliferate in monolayer conditions. After two to three passages in culture, leukocytes were replaced a homogenous layer of adherent mesenchymal cells. Amplified cultures supported hematopoiesis, and could be differentiated into adipocytes, osteoblasts, and even early neurons. Weekly counting the cobblestone area-forming cells (CAFC) that are formed from normal mononuclear BM-cells after incubation with the preformed stromal layer under limiting dilution conditions can quantitatively assess hematopoiesis supporting ability of the stroma. Differentiation into three main lineages: adipo-, osteo- and neurogenic was qualitatively examined by histochemical staining (Oil Red O, Alizarin Red S) and indirect immunofluorescence (neuron-specific nuclar protein and enolase) methods. We found that almost all stromal layers established from normal or from MM marrow attained confluence and multiple foci of adypocytes was detectable. The structural development of MDS stroma was, however, less uniform, they usually showed a decreased stromal growth and the layers were poorly adipogeneic. Moreover, a higher apoptotic index was observed in MSC cultures derived from MDS patients, as compared to normal or MM layers. Finally, MDS stroma was less able to support normal hematopoiesis in the CAFC assay, compared to normal or MM stroma. Therefore, we suggest that the stromal defect is a part of clonal abnormality in MDS, whereas MSCs isolated from MM patients are normal in terms of growth, hematopoiesis supporting ability and plasticity in long-term cultures. Furthermore, since abnormalities of primary MM stroma has also been demonstrated our data highlights a possible reciprocal paracrine relationship between MM stroma and tumor cells that induces changes in the patient’s stroma, sustains the disease process and promotes progression.
 


52. A C-reaktív protein vizsgálata egészséges donorok könny- és szérummintáiban (P52)

Kiszel Petra1, Füst Ágnes2, Cervenak László1, Veres Amarilla2, Prohászka Zoltán1,
Potempa Larry A.3, Füst György1
Semmelweis Egyetem, 1III. Sz. Belgyógyászati Klinika, Kutatólaboratórium; 2I. Sz. Szemészeti Klinika, Budapest; 3Immtech, Vernon Hills, IL, USA
 
A szem külső környezeti hatásokkal szembeni védelmét részben a könnyben jelen lévő antimikrobiális molekulák biztosítják, mint például az IgA, az IgG, a komplementfehérjék, a lizozim, a laktoferrin, a b-lizin, a defenzinek.
A C-reaktív protein (CRP) akutfázis-fehérje; a máj hepatocytái – gyulladásos citokinekre válaszolva – termelik. Az antigének megkötése után a CRP a C1q-n keresztül aktiválja a klasszikus komplementkaszkádot, ez hozzájárul az opszonizációhoz. Hasznos marker a fertőzés mértékének és a szövet gyulladásának meghatározására. A legújabb adatok szerint könnymirigyben kimutatták a CRP-mRNS-t, de a fehérje jelenlétét még nem vizsgálták a könnyfilmben.
Célkitűzés:
Megfelelő érzékenységű módszerek beállítása, amelyek alkalmasak a szérum- és könnyminták CRP-tartalmának kimutatására. Egészséges emberektől származó könny- és szérum-CRP koncentrációjának egyidejű vizsgálata.
Metodika:
Western blot- és indirekt szendvics ELISA-módszerek beállítása a könny-CRP kimutatásához.
Eredmények:
Egészséges könnymintákból HRPO-val jelölt szekunder kecske anti-nyúl-IgG (DAKO) segítségével sikerült CRP-t kimutatnunk. Csak a Western blot-metodika bizonyult megbízhatónak. A minták CRP-tartalmának tömeges vizsgálataira alkalmas ELISA-módszert a szekunder ellenanyagok keresztreakciói miatt nem sikerült beállítani. A könny- és szérumminták CRP-koncentrációinak párhuzamos értékelése az összefoglaló írásakor még folyamatban van.
Következtetések: Az
ELISA-módszer pontosságának alátámasztásához feltétlenül szükséges a Western blot-módszer. Ki tudtunk mutatni CRP-t egészséges személyek könnymintáiban. A könnyfilmben már számos komplementfehérje jelenlétét leírták, amelyek aktiválásában a CRP döntő szerepet játszhat. Ezek alapján a könnyfilmben kimutatott CRP jelentősen hozzájárulhat a szem antimikrobiális védelméhez. Ahhoz, hogy a könny-CRP koncentrációjának szabályozására vonatkozó megállapításokat tehessünk, feltétlenül szükséges még a könny- és szérumminták CRP-koncentrációjának egyidejű vizsgálata.
 


Examination of C-reactive protein (CRP) in human healthy tear and serume samples
The antimicrobial molecules insure the particular protection of the eye against environmental damages and pathogens, like IgA, IgG, complement proteins, lysozyme, lactoferrin, b lysine, defensins.
C-reactive protein is an acute phase reactant and is able to activate the classical pathway of complement system and induces the release of proinflammatory cytokines from monocytes. CRP is an important marker of infection and inflammation and is widely used in diagnostic procedures. According to recent data mRNA of CRP was found in response to experimentally induced inflammation in lacrimal gland, but the presence of the protein in tear has never been shown yet.
Aims: To develop a sensitive method for the determination of CRP in human tear and serum samples and to measure CRP concentrations in healthy tear and serum samples in parallel.
Methods:
Western-blot and indirect sandwich ELISA methods were developed for the detection of CRP.
Results: We were able to detect CRP in healthy tear samples by HRPO-labeled secondary goat anti-rabbit IgG (DAKO). Only the Western blot analysis was successfully applied for the detection of CRP. ELISA methods for large clinical studies could not be applied due to aspecific binding of secondary antibodies to lysozyme and lactoferrin. The analysis of CRP concentrations in serum and tear samples in parallel is in progress during the preparation of the abstract.
Conclusions:
We were able to detect CRP in healthy tear samples by Western blot analysis. Western blot analysis is needed to check the specificity of ELISA methods. CRP can activate complement proteins in tear and may therefore contribute to antimicrobial protection of the eye. We need to analyze the CRP concentrations in tear and serum parallel for the better understanding of the regulation of CRP levels in tear samples.
 


53. A hisztamin szerepének vizsgálata egérben, Helicobacter pylori-fertőzést követő gastritis során (E13)

Klausz Gergely1, Buzás Edit2, Scharek Petra2, Tiszlavicz László3, Gyulai Zsófia1, Fülöp András Kristóf2, Falus András2, Mándi Yvette1
1
Szegedi Tudományegyetem, Szent-Györgyi Albert Orvos és Gyógyszerésztudományi Centrum, Általános Orvostudományi Kar, Orvosi Mikrobiológiai és Immunbiológiai Intézet; 2Semmelweis Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet, Budapest; 3Szegedi Tudományegyetem, Szent-Györgyi Albert Orvos és Gyógyszerésztudományi Centrum, Általános Orvostudományi Kar, Patológiai Intézet
 
Bevezetés: A Helicobacter pylori- (H. pylori-) fertőzés során kialakuló immunválaszban kiemelkedő szerep jut a hisztaminnak. Kísérleteinkben hisztidin-dekarboxiláz knockout (HDC-KO; –/–) és vad (WT; +/+) egerek lokális citokinválaszát vizsgáltuk, H. pylori-fertőzést követően.
Módszer: Az egereket gyomorszondán keresztül fertőztük H. pylori-val. A kísérleti állatok gyomrából lokális TNF-a-, IL-6- és IL-10-meghatározást végeztünk ELISA segítségével. A gyomormintákból párhuzamosan szövettani vizsgálatokat készítettünk. A fertőzés ellenanyagválaszának leírására specifikus anti-H. pylori-össz-IgG-szintet és IgG1/IgG2a arányt mértünk ELISA-val. Az állatok Gram-negatív bélflóráját minőségi és mennyiségi szempontból is meghatároztuk.
Eredmények: A H. pylori-fertőzött állatok mindkét csoportjában emelkedett citokinszinteket tapasztaltunk. Figyelemre méltó azonban az, hogy a TNF-a és az IL-6 mennyisége szignifikánsan magasabb volt a WT egerekben, mint HDC-KO rokonaikban. A fertőzést követő IL-10-szint azonban nem különbözött szignifikánsan az állatok WT- és HDC-KO-csoportjai között. H. pylori elleni IgG-t csak a fertőzött csoportokban sikerült mérni; ennek mennyisége is szignifikánsan nagyobb volt a WT egerekben. Magasabb IgG1/IgG2a arányt tapasztaltunk a HDC-KO egerek szérumában. Enyhébb gyulladás jellemezte a HDC-KO egerek szövettani mintáit. Különbözött a HDC-KO és WT egerek bakteriális flórája is.
Összefoglalás: Az eredmények kisebb Th1/Th2 arányeltolódást mutatnak a HDC-KO állatok esetében, ami magyarázhatja a H. pylori-fertőzésre adott enyhébb gyulladásos választ. Eredményeink alátámasztják a hisztamin szerepét a H. pylori-fertőzés patomechanizmusában.
 


The role of histamine in Helicobacter pylori-induced gastric inflammation in mice
Background: Helicobacter pylori (H. pylori) infection elicits a complex immune response in which histamine release is of particular importance. We compared the local cytokine responses of histidine decarboxylase knockout (HDC-KO; –/–) and wild-type (WT; +/+) mice following H. pylori infection.
Methods: H. pylori was administered intragastrically. The local TNF-a, IL-6 and IL-10 cytokine levels in gastric mucosal specimens were determined by ELISA. Gastric mucosa sections were also analysed for histological signs of inflammation. To investigate the antibody response following H. pylori infection, the total anti-H. pylori IgG titre and the ratio of IgG1/IgG2a isotypes were determined in the serum by ELISA. We investigated the intestinal flora of animals from the faeces of mice.
Results: H. pylori induced considerable cytokine production in the infected groups. The TNF-a and IL-6 levels were significantly higher in the WT mice than in the HDC-KO mice, whereas the IL-10 levels did not differ between the groups. Anti-H. pylori IgG was detected only in the infected groups and the titre was higher in the WT mice. A higher IgG1/IgG2a ratio was observed in the H. pylori infected HDC-KO group. Histological analysis revealed that the grades of inflammation were less severe in the infected HDC-KO animals. The bacterial flora qualitatively differed between the HDC-KO and the WT mice.
Conclusion: The results suggest that the imbalance between Th1/Th2 is less pronounced in the HDC-KO mice, which might explain the milder inflammation. These results provide further information on the role of histamine in the pathomechanism of H. pylori-induced gastritis.
 


54. A TGF-b szerepe szisztémás lupus erythematosusban (P40)

Kohut Eszter1, Sebestyén Anna1, Gergely Péter2, Gopcsa László3, Pálóczi Katalin3, Kopper László1
1
Semmelweis Egyetem, I. Sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet, 2Központi Immunológiai Diagnosztikai Laboratórium, 3Országos Gyógyintézeti Központ, Budapest
A szisztémás lupus erythematosus multiszisztémás autoimmun betegség; a B- és T-lymphocyták fokozott működésében, az autoantitestek nagyarányú termelődésében, immunkomplexek lerakódásában is megnyilvánul. Az immunrendszer működésében gátló hatású TGF-b (transzformáló növekedési faktor-b) citokinhatásának elmaradása egyike azoknak a zavaroknak, amelyek fokozhatják a B- és T-sejtek hiperaktivitását. TGF-b-kezelés hatására az említett sejtek működése nem változott, ezért feltételezhető, hogy a háttérben a jelátviteli út zavara áll.
Célkitűzésünk a TGF-b jelátviteli út elemeinek – jelátvivő fehérjék: Smad 2, -3 és -4; inhibitorfehérjék: Smad 6 és -7; TGF-b-receptorok – génexpressziós szintű vizsgálata volt. Vizsgálatunkat SLE-s betegek véréből mágneses antitestekkel izolált B- és T-sejteken végeztük, RNS-izolálást követően szemikvantitatív RT-PCR módszerrel. Az eredmények értékelése nyomán azt találtuk, hogy csökkent a TGF-b gén expressziója. Kimutattuk, hogy a Smad 7 expressziója a normális, illetve az autoimmun sejtekben eltérő, és bizonyos esetekben a jelátviteli út elemei (Smad 2, -3) sem expresszálódnak, ami megakadályozza a jelátvitel műkö-dését.
Eredményeink alátámasztására a továbbiakban a génexpresszió vizsgálatát tervezzük real-time PCR-rel, valamint a jelátviteli út elemeinek in situ fehérjeszintű vizsgálatát, FACS segítségével.
Támogatások: 192/2000, 193/2000 ETT, 0150/2001-FKFP, 118/2001 Békésy (SA) OTKA (T 034892).
 


Role of TGF-b in systemic lupus erythematosus
Systemic lupus erythematosus (SLE) is a multisystem autoimmune disease characterized by the hyperactivity of T- and B-lymphocytes, production of high-titer autoantibodies and deposition of immune complexes. Lacking the effect of transforming grow factor-b as a general inhibitor of the immune system can result in the increased activity of B- and T-cells. Substitution of exogenous TGF-b has not corrected the disorder so we hypothesized that the trouble is with the signal transduction.
Aim of our study was to investigate the gene expression of TGF-b signal transduction elements (signal transducing proteins: Smad 2, 3, 4; inhibitor proteins: Smad 6, 7; TGF-b receptors) in the B- and T-cells from the blood of SLE patients. After sorting the cells with magnetic antibodies we isolated RNA and semi-quantitative reverse transcriptase-polimerase chain reaction (RT-PCR) was used. We found that the expression of TGF-b has decreased in both cell types. Expression of Smad 7 has also changed and in some cases signal transducing smads (Smad 2/3) have not been expressed that may cause the disturbance of the signal transduction pathways.
To support our results we are planning to use real-time RT-PCR in the future and to examine the signal transduction on the protein level in situ with the help of FACS.
The study was supported by OTKA (T 034892), ETT (192/2000, 193/2000), FKFP (0150/2001) and Békésy foundation (118/2001).
 


55. Az intranasalis fototerápia hatékonyan csökkenti a rhinitis allergica klinikai tüneteit
(P58)

Koreck Andrea1, Csoma Zsanett1, Ignácz Ferenkhi2, Bor Zsolt2, Szabó Gábor2, Bodai László1, Kadocsa Edit3, Dobozy Attila1, Kemény Lajos1
Szegedi Tudományegyetem, 1Bőrgyógyászati és Allergológiai Klinika, 2Optika és Kvantumelektronikai Tanszék, 3Fül-Orr-Gégészeti és Fej-Nyaksebészeti Klinika
Jól ismert a fototerápia helyi és szisztémás immenszuppresszív hatása; az intranasalis fototerápia hatékonyságát vizsgáltuk allergiás rhinitisben. Randomizált, kettős vak, placebokontrollált vizsgálatunkban 49 olyan – legalább két éve fennálló mérsékelt vagy súlyos, parlagfű-allergiában szenvedő – beteg vett részt, akik a szokványos antiallergiás gyógyszeres terápiára nem kielégítő mértékben reagáltak. A betegeket a parlagfűvirágzás megindulása után, a tünetes szakban vontuk be vizsgálatunkba. Az orrüreget fokozatosan emelt dózisú mUV/VIS fénnyel, a placebocsoportban kis dózisú látható fénnyel irradiáltuk. A klinikai tünetek súlyossá-gának fokát hetente értékelte egy független vizsgáló. A tel-jes nasalis pontszám (TNS) szignifikánsan csökkent az mUV/VIS- (p=0,004) kezelést követően, de nem változott a placebocsoportban (p>0,05). Az mUV/VIS-kezelést kapó csoportban a kiindulási értékekhez képest a klinikai tünetek közül a tüsszögés (p=0,016), az orrfolyás (p=0,007) és az orrviszketés (p=0,014) súlyosságát kifejező pontérték szignifikáns csökkenést mutatott. Az orrdugulás kismértékű ja- vulását tapasztaltuk a kezelés során (p>0,05). A placebocsoportban egyik klinikai tünet sem mutatott szignifikáns javulást a kezelés végére, az orrdugulás szignifikáns erősödését tapasztaltuk (p=0,017). A kezelés befejezésekor elvégzett záró orvosi értékelés alapján az mUV/VIS-kezelés szignifikáns hatékonyabbnak bizonyult a placebokezeléshez képest (p=0,004). A betegek értékelése alapján ugyancsak az egyes klinikai tünetek és a TNS javulását tapasztaltuk. Az mUV/VIS-kezelésben részesült betegcsoportban valamennyi betegnél, a placebocsoportban hat betegnél lépett fel az orrnyálkahártya enyhe fokú kiszáradása. Az mUV/VIS-kezelés hatására az orrmosófolyadékban szignifikánsan csökkent az eosinophil sejtek száma (p=0,009), az ECP (p=0,028) és az IL-5 szintje (p=0,047), míg az IL-4-szint nem változott. Hasonló változás a placebocsoportban nem következett be. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az intranasalis fényterápia hatékonyan alkalmazható a szénanátha kezelésére, ezáltal új lehetőségeket teremt a kórkép terápiájában.
 


Intranasal phototherapy inhibitis the clinical symptoms of allergic rhinitis
Since phototherapy has been shown to exert both local and systemic immunosuppression, we investigated the effect of intranasal phototherapy in allergic rhinitis. We performed a randomized, double-blind, placebo-controlled study in 49 patients with a history of at least two years of moderate to severe ragweed-induced allergic rhinitis that was not controlled by antiallergic drugs. Intranasal phototherapy was performed three times a week for three weeks using a light source containing 5% UVB, 25% UVA and 70% visible light. The treatment was given in gradually increasing doses, starting with 1.7 J/cm2. Evaluation was based on symptom scores and determination of differential cell counts, cytokines and ECP in nasal lavage samples and in the serum, and by the measurement of the lymphocytes subpopulations in the blood. Phototherapy significantly decreased scores for sneezing (p=0.016), rhinorrhea (p=0.007), nasal itching (p=0.014) and total nasal score (p=0.004), whereas no improvement was observed in the placebo group. Scores for nasal obstruction slightly improved during phototherapy, and significantly increased in the placebo group (p=0.017). In the overall efficacy assessment, both patients and investigators found phototherapy significantly more efficient than placebo (p=0.004). In nasal lavage samples phototherapy resulted in a significant decrease of eosinophil cell counts (p=0.009), ECP (p=0.028) and IL-5 levels (p=0.047) but no changes of IL-4 levels were detected. These results suggest that intranasal phototherapy improves allergic rhinitis, and might also have a long-term immunomodulatory effect.
 


56. A progeszteron indukálta blokkolófaktor (PIBF) szerepe a jelátviteli mechanizmusokban (P7)

Kozma Noémi1, Pár Gabriella1, Keszei Márton2, Szalai Csaba2, Falus András2, Kiss Katalin3, Szeberényi József 3, Szekeres-Barthó Júlia1
1Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Orvosi Mikrobiológiai és Immunitástani Intézet; 2Semmelweis Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet, Heim Pál Gyermekkórház, Budapest; 3Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Orvosi Biológiai Intézet
 
Célkitűzések: A terhesség során a progeszteronfüggő immunológiai szabályozás egy 34 kDa molekulatömegű mediátorfehérje, a progeszteron indukálta blokkolófaktor (PIBF) közreműködésével valósul meg. E faktor egyik legfontosabb hatása a magzat számára káros NK-aktivitás gátlása, amelyet a citokintermelés befolyásolása révén fejt ki. Korábbi kutatási eredményeink alapján a PIBF a citoplazmában erőteljes STAT6- és PKC-foszforilációt eredményezett, valamint gátolta az IL12-indukálta STAT4-aktivációt, és alacsony szinten tartotta az intracelluláris Ca2+-koncentrációt.
Módszerek: Irodalmi adatok alapján, a T-helper sejtek differenciálódásában a GATA transzkripciós család 3. tagja is fontos szerepet játszik. Az indukált GATA3-foszforiláció gátlóhatást fejt ki az IL12-receptor által mediált jelátviteli utakra, a STAT4 foszforilációjára. Ellenben az IL4 által létrejövő STAT6-fehérjefoszforiláció GATA3-aktivációt hoz létre a stimulált lymphocyták citoplazmájában, amelyre a STAT4 inaktiváló hatású. Az AP1 transzkripciós faktor – a PKC-jelátvitel génexpressziós hatásának egyik fontos, sejtmagon belüli mediátora –, valamint számos célgén indukcióját idézi elő. A PIBF cDNS-e egy 90 kDa molekulatömegű fehérjét kódol. A biológiai hatásaiért felelős szakaszának vizsgálatára PIBF-exonokat tartalmazó konstruktokat amplifikáltunk. Mivel a PIBF Th2-túlsúlyú citokintermelést eredményez, munkánkban a PIBF és funkcionális konstruktjainak a fent említett jelátviteli mechanizmusokra gyakorolt hatását vizsgáltuk immunprecipitációval, áramlási citometriával, EMSA-val és EMSA Szupershifttel.
Eredmények: PIBF-stimuláció hatására fokozott citoplazmatikus GATA3-foszforiláció és sejtmagon belüli AP1-aktiváció jött létre, valamint a sejtmagban a dimerizálódott STAT6-fehérjék a DNS-hez kötődtek.
Következtetés: A PIBF receptorkötődése után fokozott citoplazmatikus STAT6-, PKC-, GATA3-foszforilációt, nukleárisan a STAT6-molekulák DNS-hez kötődését, valamint az AP1 faktor aktivációját, illetve gátolt IL12-indukált STAT4-foszforilációt eredményez, alacsony szinten tartva az intracelluláris Ca++-koncentrációt, szerepet játszva a szelektív Th2 típusú génexpresszió szabályozásában.
 


The progesterone induced blocking factor (PIBF): intracellular signal transduction
Objective: Immunologic effects of progesterone during pregnancy are mediated by a 34 kDa protein named the Progesterone Induced Blocking Factor (PIBF). PIBF induces production of increased Th2 cytokines, resulting a sharp reduction in NK activity, and this in turn contributes to the maintenance of pregnancy. Earlier data from our laboratory showed that PIBF induced STAT6, PKC and inhibited IL12 induced STAT4 phosphorylation and had no effect on intracellular Ca2+ levels.
Study design: Transcription factor GATA3 appears to be a critical point, where Th2 cell development is initiated, and it is activated by STAT6, which itself is under the control of the IL4 signal. The AP1 factor is one of the most important intranuclear mediator of PKC. The cDNA of PIBF encodes a 90-kDa protein. We amplified sequences containing PIBF exons (constructs). Since PIBF induces a Th2 biased cytokine balance, we aimed at investigating the role of the JAK/STAT system, the PKC/intracellular Ca2+, GATA3 and AP1 signaling pathways in the PIBF – and in the constructs – induced signal transduction. We performed immunoprecipitation, EMSA, EMSA Supershift and flow cytometry.
Results: PIBF induced cytoplasmic GATA3 phosphorylation, nuclear AP1 activation, and the STAT6 dimers entered the nucleus and bound to the DNA.
Conclusion: Progesterone binding of the lymphocytes is followed by the release of PIBF that induces cytoplasmic STAT6, PKC, GATA3 phosphorylation and nuclear AP1 factor activation. PIBF inhibits IL-12 induced STAT4 phosphorylation, and has no effect on intracellular Ca2+ levels. The STAT6 dimers enter the nucleus and bind to the DNA resulting in a Th2 biased immune response.
 


57. A tuftsin/formil-peptid konjugátumok kemotaktikus jellegének vizsgálata egysejtű modellrendszerben – A hordozómolekula módosító hatása a ligand kemotaktikus jellegére (P37)

Kőhidai László1, Láng Orsolya1, Illyés Eszter2, Láng Júlia1, Török Krisztina1, Mező Gábor2, Hudecz Ferenkhi2
1Semmelweis Egyetem, Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet, 2MTA-Eötvös Loránd Tudományegyetem, Peptidkémiai Munkacsoport, Budapest
 
A formilált, bakteriális eredetű peptideket (például fMLF-et), illetve ezek derivátumait a szakirodalom klasszikus kemotaktikus ligandként tartja számon. E peptidek hatását nem csupán magasabb rendű sejteken mutatták ki, de a filogenezis alacsonyabb fokán álló eukaryota egysejtűek is hasonló érzékenységet mutatnak irántuk. A kiváltott kemotaktikus hatás és a molekulák fizikokémiai jellemzői (például SEA, pKa-NH2-értékek) között több összefüggés is felismerhető volt.
Fenti kedvező tulajdonságok magyarázzák azt a törekvésünket, hogy e formilált ligandok és tuftsinoligomerekkel képzett konjugátumai esetében vizsgáljuk: 1. mely formilált származék rendelkezik kiemelkedő kemotaktikus képességgel; 2. változtat-e a konjugátumok képzése a formilált származék alapaktivitásán; 3. mely molekulaszerkezeti és egyéb jellemzők felelősek a tapasztalt eltérésekért.
Vizsgálatainkat Tetrahymena pyriformis GL csillós egysejtű modell logaritmikus növekedési fázisban lévő tenyészeteinek sejtjein végeztük. A felhasznált peptidek és konjugátumok a következők voltak: fMLF, fMMM, NleLF, T20=[TKPKG]4, T20-fMLF, succ-T20-fMLF, form-T20-fMLF, T20-fMMM, T20-NleLF, [GFLGK]2-T20-fML-NH2. Elemeztük egyéb formilált peptidek (fMLFF, fMF, fMV, fMS) mint potenciális kemotaktikus ligandok és összetevőik hatását is. A kemotaktikus aktivitás mérésére kapilláris esszét alkalmaztunk.
Eredményeink jelzik, hogy a molekula Met-tartalmának növelésével elvész az fMLF kemotaktikus karaktere (fMLF: 10–10–10–6 M attraktáns; fMMM: 10–12–10–6 M repellens). Míg a T20-molekula magában szintén kemotaktikus hatású, a formilált tripeptidekkel való konjugálás jelentősen ront az attraktáns jellegen. A hordozómolekula módosító hatását jelzi, hogy a tuftsin alapmolekula oldalláncának szukcinil- vagy formilcsoporttal való konjugálása hatásos kemoattraktáns ligandokat eredményez, míg a lánc N-terminális szakaszon történő [GFLGK]2 hosszabbításával a fentieknél is hatásosabb, széles spektrumú attraktáns molekulát kapunk. A vizsgálatba vont NleLF esetében tapasztalt kemoattraktáns hatást a T20-szal való konjugálás szintén potencírozni képes. A vizsgált formilált peptidek esetében a C-terminális aminosav „SEA/oldékonysági” aránya meghatározó a ligand kemotaktikus aktivitása szempontjából. A formil-tripeptid tartalmú konjugátumok esetében a tuftsin alapú hordozómolekulák alkalmazása jelentős mértékben képes növelni az adott ligand kemoattraktáns karakterét. A tuftsin internalizációt serkentő hatása és fentiekben leírt jellege révén a kemotaktikus drug-targeting jó hordozómolekulájának ígérkezik.
 


Investigations on the chemotactic character of tuftsin/formyl-peptide conjugates in unicellular model-system – Modifying effects of the carrier on the chemotactic moiety of the ligand.
Bacterial formyl peptides (e.g. fMLF) and their derivates are considered as classic chemoattractants. Effects of these peptides were detected not only in cells of higher levels of phylogeny but eukaryotic unicellular organisms expressed similar responsiveness to these kinds of molecules. Several correlations were described between the chemotactic effects and the physicochemical characteristics (e.g. SEA, pKa-NH2 values) of the ligands.
The advantageous properties explain our objectives to investigate conjugates of formylated ligands and tuftsin whether: 1. formylated derivative possess prominent chemotactic effect in our model; 2. formation of conjugates has the ability to modify the baseline activity of the formylated derivative and 3. which structural and other moieties of the molecules could be responsible for the differences observed.
The experiments were done in the logarithmic phase of growth of eukaryotic ciliate, Tetrahymena pyriformis GL. The tested peptides and conjugates were: fMLF, fMMM, NleLF, T20 = [TKPKG]4, T20-fMLF, succ-T20-fMLF, form-T20-fMLF, T20-fMMM, T20-NleLF, [GFLGK]2-T20-fML-NH2. Other formylated peptides (fMLFF, fMF, fMV, fMS) and their components were also tested, as potential chemotactic ligands. Chemotactic activity was determined by capillary assay.
Our result showed that formylated molecule can loss its chemotactic ability by increasing of the Met content (fMLF: 10–10–10–6 M attractant; fMMM: 10–12–10–6 M repellent). While the tuftsin oligomer (T20) was also chemoattractant, there was a significant decrease in the T20 conjugates formed with formylated tripeptides. The modifying potency of the carrier was shown by conjugation of tuftsin molecule in the sidechain with succinyl or formyl groups, which resulted effective ligands while elongation of the N-terminus with [GFLGK]2 sequences resulted strong, wide range chemoattractant conjugate. In the case of NleLF, the chemoattractant moiety of the ligand was also enhanced by conjugation with T20. The “SEA/solubility” ratio of C-terminal amino acid of formylated peptides proved to be significant in respepect of the chemotact ability of the ligand.
In conclusion: our results show that application of tuftsin-based carriers can significantly increase chemotactic ability of formyl peptides in conjugates. By means of internalization inducer effect and the above described chemoattractant characteristics in conjugates, tuftsin is a good candidate for chemotactic drug-targeting (CDT).
 


58. A terhesség hatása a vese- és a bőrbetegségre autoimmun egerekben (E28)

Kökény Gábor1, Godó Mária1, Pállinger Éva2, Nagy Eszter2, Rosivall László1, Hamar Péter2
Semmelweis Egyetem, 1Kórélettani Intézet, 2Központi Immunológiai Laboratórium, Budapest
Az MRL/lpr (lpr: lupus prone) egértörzs a szisztémás autoimmun betegség állatmodellje, a bőrben T-sejt-közvetített vasculitisszel és uraemiához vezető immunkomplex glomerulonephritisszel. Ezen egerekben emelkedett az interferon-g- (IFN-g)-termelés (Th1-túlsúly), míg terhességben a Th2-túlsúly jellemző. Feltételeztük, hogy a terhesség javíthatja a szisztémás autoimmun betegség progresszióját az lpr egerekben. Nyolchetes nőstény egereket hímekkel együtt tartottunk. 1. csoport: terhes nőstények (T, n=13) 2. csoport: virgo nőstények (V, n=11), külön ketrecekben. A 11 V egér közül hat súlyos, míg a 13 T egér közül egy enyhe bőrlaesiót mutatott (score: T: 0,13±0,09 vs. V: 0,73±0,24, p=0,038). Szövettanilag ezen laesiók mononuclearis sejtes infiltrációt, fekélyt és fibrosist mutattak a V egerekben. Terhes egerekből hiányoztak ezek az elváltozások, csak egy állatban láttunk enyhe mononuclearis infiltrációt. A T csoportot rövidebb túlélés (T: 30% vs. V: 78% 20 hetes korban, p=0,0038) és roszszabb vesefunkció jellemezte (T vs. V BUN: 21±3,2 vs. 9±1,9 mmol/l, p=0,025, proteinuria: 1,8±0,3 vs. 0,2±0,1 mg/24 h, p=0,032). Az IFN-g-szint T egerekben a V-szintnek kevesebb, mint fele volt (T: 77±53 vs. V: 230±144 pg/ml, ns.). A vérnyomás a két csoport között nem különbözött (T: 112±19 vs. V: 101±13 Hgmm, ns.).
Összefoglalva: a terhesség enyhítheti az autoimmun bőrbetegség lefolyását, de ronthatja a vesefunkciót és a túlélést. A megfigyelés hátterében a terhesség alatt csökkent Th1-aktivitás miatti alacsonyabb IFN-g-szint állhat.
Támogatás: OTKA F-034498, MHT (HP2001), MNT (HP2002).
 


Pregnancy inhibits skin disease but accelerates nephritis in autoimmune MRL/lpr mice
The MRL/MpJ-Faslpr mouse strain (lpr) is a well-known model of murine systemic autoimmunity. Autoreactive lymphocyte proliferation, and massive autoantibody production leads to inflammatory destruction of the kidneys, and the skin, with rheuma factor (RF), anti-DNA, anti-Sm titers rising with age. Skin pathology is characterised by immunglobulin deposition and cellular infiltrates. Female lpr mice show slightly accelerated disease. Pregnancy is associated with a shift towards Th2 predominance, whereas Th1 predominance accelerate systemic autoimmunity in other MRL substrain mice. Thus, we hypothesized that repeated pregnancies may affect the progression of systemic autoimmunity in Lprmice.
Seven weeks old female lpr mice (Jackson Laboratories, USA) were divided into pregnant (P) and virgin (V) groups. P females were mated with NMRI males (Charles River Hungary), and weaned immediately after parturition to exclude the possible immunmodulatory effects of lactation. Non-congenic males were used as lpr males tend to be infertile, possibly due to low levels of testosterone. Two virgin females (V) were housed in each cage.
Blood urea nitrogen (BUN), urine protein/creatinine ratios, and non-invasive tail cuff blood pressure were determined. The immune state of the animals were followed by flow cytometric determination of CD4-, CD8- (DN) TCR+, B220+ (DN B220+) cell percentage. Plasma anti-DNA antibodies were determined by ELISA. Skin and kidney pathology were assessed.
Only two of 13 P mice had mild macroscopic skin lesions, compared to six out of 11 severe skin lesions of V mice. In contrast to the dramatically reduced skin disease, renal lesions were markedly increased in Pregnant mice, parallel to the functional data (renal score: 4.8±1.1 vs. 2.0±0.3, P vs. V, p=0.014). Both renal vasculitis (2.0±0,5 vs. 1.0±0.1, P vs. V) and glomerular hypercellularity (2.4±0.5 vs. 1.2±0.2, P vs. V) was more severe in the P group. Kidney disease was accelerated (P vs. V) (proteinuria 1.83±0.32 vs. 0.30±0.11 mg/24 h, P vs. V, p=0.00012); BUN 21.75±4.28 vs. 11.38±1.8 mmol/l, p=0.025); systemic blood pressure (P: 90±13 vs. V: 77±7 mmHg, p=0.0091). Faster progression of nephritis also manifested in shorter survival. Only 30% of P mice lived at 20 weeks of age, compared to 78% of V mice. In the molecular background of these effects of pregnancy plasma IFN-g levels of P mice were less than third of V mice (76.9±26.5 vs. 196.4±78.2 pg/ml, P vs. V, ns.) Although the proportion of CD8+ T-cells was significantly decreased in pregnant mice, there was no difference in the percentage of CD4– CD8– B220+ cells or CD19+ B-cells. Plasma anti-DNA level was similar in both groups.
 


59. Extracelluláris mátrixszekvenciák kemotaktikus és adhéziós hatása monocyta-sejtvonalakban. Angiotenzinnel végzett előkezelés hatása (P61)

Kun Lídia1, 3, Mihala Nikolett2, Tóth Miklós3, Süliné Varga Helga2, Kőhidai László1
1Semmelweis Egyetem, Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet, 2MTA-Eötvös Loránd Tudományegyetem, Peptidkémiai Munkacsoport; 3Semmelweis Egyetem, I. Sz. Belgyógyászati Klinika, Budapest
 
A sejtek kölcsönhatása az extracelluláris mátrix- (ECM-) proteinekkel számos sejtfiziológiai folyamat része. Ebben jelentős szerepet játszanak az integrinek és az általuk legáltalánosabban felismert szekvencia, az RGD. Phagocyták esetében az integrinek a sejtadhézió befolyásolása révén a szöveti migrációban és fagocitózisban töltenek be fontos szabályozószerepet. Ismert olyan RGD-tartalmú fehérje, amelynek nem csak adhéziós, de kemotaktikus, haptotaktikus potenciálja is van; az oszteopontin például nemcsak osteoclastadhéziós protein, hanem citokinként viselkedik.
Egy másik ECM-receptor a migrációt indukáló, 67 kDa-s elasztinkötő fehérje (EBP). Ez XGXXPG aminosav-mintázatú elasztinszekvenciák megkötésére képes. Ilyen szekvencia a humán elasztinban hatszor ismétlődő VGVAPG is. Az elasztinderivátumoknak ismertek a sejtproliferációt, angiogenezist és differenciálódást befolyásoló hatásaik is.
Az angiotenzin II-nek (AII) parakrinszabályozó funkcióit is leírták. A kontrakciót kiváltó azonnali hatás mellett az angiotenzinreceptor 1 (ATR-1) az IP3-DAG jelátviteli úton számos sejtélettani hatást – például proliferációt, migrációt – is modulálhat.
Jelen kísérleteinkben a következő kérdésekre kerestünk választ: 1. hogyan nyilvánul meg az S-RGD-P és VGVAPG peptidek in vitro kemotaktikus és adhéziós hatása monocyta-sejtvonalak esetében; 2. létezik-e összefüggés e molekulák adhéziót befolyásoló hatása és kemotaktikus potenciálja között; 3. van-e eltérés az angiotenzin II-vel előkezelt és az előkezeletlen monocyták esetében a vizsgált peptidek által kiváltható in vitro kemotaxisban és adhézióban?
Vizsgálatainkhoz a J-774 egér, és THP-1 humán monocytatumoros sejtvonalakat használtuk. A sejtek előkezelésére 10–7 M-os humán angiotenzin II-t (Sigma) alkalmaztunk. A sejtek migrációját Boyden-kamra-technikával (NeuroProbe®), adhéziós készségüket sejtadhéziós teszttel határoztuk meg. A kapott adatok statisztikai elemzésére Origin 6.0-t használtuk.
A J-774-sejtek kemotaxisára a 10–7–10–6 M S-RGD-P szignifikáns attraktáns módon hatott, adhéziónövekedést 10–9–10–6 M VGVAPG jelenlétében figyeltünk meg. A THP-1-sejtek esetében a 10–11–10–6M VGVAPG szignifikánsan repellens hatásúnak bizonyult, míg a 10–12–10–10 M S-RGD-P adhéziónövekedést váltott ki. Az AII-vel való előkezelés után a J-774 adhéziós készsége változott leginkább: S-RGD-P je-lenlétében növekedett, VGVAPG jelenlétében csökkent. A THP-1-sejteknél is megfigyelhető jelzett adhézióskészség-csökkenés S-RGD-P jelenlétében.
Következtetés: A sejtek adhéziója a vizsgált ECM-peptidek jelenlétében kemotaktikus készségükkel ellentétesen változik. Az S-RGD-P a szuszpenzióban növő THP-1-monocyták adhéziós készségét, míg a letapadó J-774-sejtek kemotaktikus potenciálját növeli meg. A sejtek előkezelése AII-vel a sejtek elasztin-, illetve RGD-peptid-kötő képességét sejt- és ligandspecifikusan képes befolyásolni.
 


60. Emberi csontvelőből izolált mesenchymalis elődsejtek chondrocyta irányú differenciálódása (E23)

Kunstár Aliz1, Dudics Valéria2, Vas Virág1, Buzás Edit3, Uher Ferenc1
1Országos Gyógyintézeti Központ, Őssejtbiológiai Osztály; 2Budai Irgalmasrendi Kórház, Reumatológiai és Fizioterápiás Tanszéki Csoport; 3Semmelweis Egyetem, Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet, Budapest

 
A betegség vagy sérülés következtében károsodott ízületi porc az érellátás hiánya és a porcsejtek rendívül kis fajlagos mennyisége miatt alig vagy egyáltalán nem képes regenerálódni. Ezért rendkívül nagy az érdeklődés minden olyan módszer iránt, amely alkalmas lehet a szervezetbe beültethető porcszövet – vagy teljes ízületi protézis – in vitro előállítására (tissue engineering). A csontvelői stromából izolálható mesenchymalis ős- (MSC-) és elődsejtek különösen ígéretes kiindulási anyagot jelentenek e próbálkozások során. Az MSC-k olyan multipotens sejtek, amelyek bármilyen kötő- és támasztószövet (csont, porc, ín, simaizom), valamint a vérképzést támogató stroma irányába képesek differenciálódni. Munkánk során a csontvelőmintákat csípőprotézis-műtéten átesett betegek eltávolított combfejéből nyertük. A csontvelői adherens sejteket – sorozatos átoltással – 10–20 generáción keresztül tartottuk fenn. A szuszpenzióba vitt, majd centrifugálással összetömörített MSC-ket (micromass pellet) két hétig inkubáltuk 10% v/v fetalis borjúsavót (FCS), 5 ng/ml TGF-b3-at, 6 µg/ml inzulint és 10–7 M dexametazont, vagy 10% FCS-t és demineralizált csontmátrixot (DBM) tartalmazó DMEM/F12 médiumban. A kultúrákban lezajló chondrogenesis során szintetizálódott szulfatált glükóz-aminoglikánokat 0,1%-os dimetil-metilénkék festéssel tettük láthatóvá (metakromázia). A II-es típusú kollagén jelenlétét indirekt immunfluoreszcencia segítségével mutattuk ki a mintákban. Megállapítottuk, hogy a chondrogenesis TGF-b3, inzulin és dexametazon vagy DBM hatására egyaránt bekövetkezik. A tenyészetekben kis méretű, tömör porckorongok alakulnak ki, amelyekben a porcsejteket jellegzetes – proteoglikánokat és kollagén II-t tartalmazó – extracelluláris mátrix veszi körül. A DBM tehát rendelkezik egy hordozó összes szükséges jellemzőivel, és biológiailag aktív formában tartalmazza mindazokat a morfogéneket és növekedési faktorokat, amelyek az MSC-k chondrocyta irányú differenciálódásához szükségesek. Ráadásul a DBM lassan degradálódik és in vivo nem immunogén. Ezért feltételezzük, hogy az MSC/DBM kompozit olyan önálló egységet alkot, amely a szervezetbe juttatva képes a legkülönbözőbb porckárosodások, illetve -hiányok kockázat és mellékhatások nélküli „kijavítására”, vagyis közvetlenül a klinikai gyakorlatban is felhasználható. Végül a rendszer – egyszerűsége folytán – rendkívül kis minták esetén is alkalmas a chondrogenesis során zajló celluláris és molekuláris mechanizmusok tanulmányozására.
In vitro
chondrogenesis of human bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells

Because of the lack of vascularity and paucity of cellularity, articular cartilage damaged by disease or trauma has a limited capacity for regeneration. Using techniques of tissue engineering, artificial cartilage fabricated in vitro has been applied for the repair and regeneration of damaged cartilage. A number of studies have shown that bone marrow (BM) stroma-derived mesenchymal stem cells (MSCs) represent a promising candidate cell type for cartilage tissue engineering. MSCs are multipotent cells, able to differentiate into tissues of mesenchymal origin, including bone, cartilage, fat, muscle, and stroma. Thus, we collected marrow from proximal femurs of patients undergoing total hip replacement surgery and isolated and culture expanded MSCs to about 10–20 population doubling. Next, MSCs were cultured as micromass pellets for 14 days in DMEM/F12 medium containing 10% fetal bovine sera (FCS), 5 ng/ml TGF-b3, 6 µg/ml insulin and 10–7 M dexamethasone or, alternatively, 10% FCS and demineralized bone matrix (DBM). Sulfated glycosaminoglican was visualized with 0.1% dimethyl-methylene blue. Deposition of type II collagen was detected with indirect immunofluorescence. We found that the pellets differentiated in the presence of TGF-ba3, insulin, and dexamethasone, or in the presence of DBM alone, became spherical and grew in size. In addition, a cartilage matrix was synthesized in both cases, as demonstrated by the appearance of proteoglycans and type II collagen. Thus, DBM possess all the necessary conductive features of a carrier, serving at the same time as a natural source of inductive chondrogenic factors. Moreover, DBM is slowly biodegradable and nonimmunogenic. We assumed that MSCs and DBM would constitute a self-sufficient unit containing all the essential elements for local formation of hard tissue in orthotopic or ectopic sites in vivo. Taken together, the methodology proposed may open a whole range of treatment opportunities for clinically relevant conditions such as restoration of joints damaged by trauma, pathologic conditions, or surgical procedures. Furthermore, the simplicity of the system makes it possible to define in detail the cellular and molecular events during chondrogenesis.
 


61. A RAGE gén polimorfizmusai gyulladásos bélbetegségben: megegyező magyar és holland eredmények (P27)

Laki Judit1, Bene László5, Blaskó Bernadett1, Cervenak László1, Crusius Bart3, Eef van Elk2, Füst György1, Roel Heijmans3, Kamp Gerard van2, Peńa Amado Salvador3, 4, Prohászka Zoltán1, Vatay Ágnes1, Jelle Visser2
1
Semmelweis Egyetem, III. Sz. Belgyógyászati Klinika, Budapest; 2Department of Clinical Chemistry, and 3Laboratory of Immunogenetics and 4Department of Gastroenterology, VU University Medical Center, Amszterdam, Hollandia; 5Péterffy Sándor utcai Kórház, Budapest
 
Bevezetés: A RAGE [receptor for AGEs (advanced glycation end-products)] membránfehérje egy multiligand receptor. Ligandjai: AGE, amyloidra jellemző béta-fibrillumok és az S100/calgranulin családba tartozó proinflammatoricus citokinek. A RAGE gén a 6. kromoszómán (6p21.3), a gyulladásban és immunválaszban szerepet játszó géneket tartalmazó MHC III régióban található. Vizsgáltuk a RAGE promoterrégiójában a –374 és a –429 allél polimorfizmusát mint lehetséges hajlamosító tényezőt a gyulladásos bélbetegségek (IBD) – colitis ulcerosa (CU) és Crohn-betegség (CD) – kialakulásában. Colitis ulcerosa esetén igazolt a kapcsoltság és összefüggés a HLA II- és HLA III-régiókkal.
Módszerek: Kétszáztizennégy gyulladásos bélbetegségben szenvedő holland személy (95 colitis ulcerosa, 123 Crohn-betegség) és 177 holland kaukázusi kontroll, 129 gyulladásos bélbetegségben szenvedő magyar (50 colitis ulcerosa, 72 Crohn-betegség) és 193 magyar kontrollszemély DNS-mintáiban vizsgáltuk a polimorfizmust a RAGE promoterrégiójában a –374-es és a –429-es pozícióban.
Eredmények: A RAGE –429 C allélt hordozók gyakorisága szignifikánsan alacsonyabb a magyar colitis ulcerosás férfi betegekben (9,5%), mint egészséges kontrollokban (36,5%), p=0,0175. A RAGE –429 C allélt hordozó magyar férfiaknak megközelítőleg ötödakkora az esélyük, hogy colitis ulcerosások legyenek, mint az ezen allélt nem hordozóknak (OR=0,18, 95% KI; OR: 0,04–0,84). Hasonlóképpen, a holland colitis ulcerosás férfi betegek között a RAGE –429 C allélt hordozók gyakorisága (20,5%) szignifikánsan alacsonyabb, mint az egészséges kontrollok között (38,3%), p=0,0466. Az ezen allélt hordozó holland férfiaknak feleakkora az esélyük, hogy colitis ulcerosások legyenek, mint a RAGE –429 C allélt nem hordozóknak (OR=0,42, 95% KI for OR: 0,17–0,97). A két populációt együtt vizsgálva, a RAGE –429 C allélt hordozók gyakorisága szignifikánsan alacsonyabb a colitis ulcerosás férfi betegekben (16,9%), mint az egészséges kontrollokban (38,4%), p=0,0025. A RAGE –429 C allélt hordozó férfiaknak harmadakkora az esélyük, hogy colitis ulcerosások lesznek, mint az ezen allélt nem hordozóknak (OR=0,32, 95% KI; OR: 0,16–0,67). Nem találtunk szignifikáns különbséget a RAGE –429 C allélt hordozók gyakoriságában sem a colitis ulcerosás nőbetegek között, sem a Crohn-betegek körében. Nem volt jelentős eltérés az IBD-csoportok és a kontrollok között sem. Nem kaptunk összefüggést a RAGE –374 polimorfizmus és az IBD, a colitis ulcerosa vagy a Crohn-betegség között.
Megbeszélés: A RAGE –429 C allél védőhatású lehet férfiakban a colitis ulcerosával szemben.
 

RAGE
gene polymorphisms in inflammatory bowel disease: concordant hungarian and dutch results

Introduction: RAGE [receptor for AGEs (advanced glycation end-products)] is a cell surface protein, a multiligand receptor. RAGE binds AGEs such as beta-sheet fibrils characteristic of amyloid, cytokine-like mediators of the S100/ calgranulin family of proinflammatory cytokines. The RAGE gene is located in the MHC locus on chromosome 6p21.3 containing genes involved in inflammatory and immune responses. We studied RAGE polymorphisms at positions –374 and –429 in the predisposition to the development of inflammatory bowel disease (IBD): ulcerative colitis (UC) and Crohn’s disease (CD).
Methods: 218 IBD patients (95 UC, 123 CD) and 177 unrelated individuals of dutch caucasian ancestry, 129 Hungarian IBD patients (50 UC, 72 CD) and 193 Hungarian controls were analysed for polymorphisms at positions –429 and –374 in the RAGE promoter region.
Results: The frequency of the RAGE –429 C carriers in Hungarian male UC patients (9.5%) is significantly lower than in the control population (36.5%), p=0.0175. Hungarian male carriers of RAGE –429 C allele have approximately five times lower risk to have UC than non-carriers (OR=0.18, 95% CI for OR: 0.04–0.84). Similarly, in Dutch male UC patients the RAGE –429 C allele carriers are significantly less frequent (20.5%) than in the control population (38.3%), p=0.0466. Dutch male carriers of RAGE –429 C allele have approximately twice lower risk to have UC than non-carriers (OR=0.42, 95% CI for OR: 0.17–0.97). Taken together the two populations it can be concluded that the frequency of the RAGE –429 C carriers in male UC patients is significantly lower (16.9%) than in the healthy control population (38.4%), p=0.0025. Male carriers of the RAGE –429 C allele have approximately three times lower risk to have UC than non-carriers (OR=0.32, 95% CI for OR: 0.16–0.67). No significant changes in the frequency of RAGE –429 C allele carriers were observed in females, nor in patients with CD. There were no significant differences between the IBD groups and controls. There were no associations found between the RAGE –374 polymorphism and IBD or UC or CD.
Discussion: The RAGE –429 C allele may exert a protective effect against ulcerative colitis in men.
 


62. A formilpeptid-konjugátumok kemotaktikus hatása az eltérő differenciáltsági fokú sejtekre (P17)

Láng Orsolya1, Birinyi Judit1, Láng Júlia1, Mező Gábor2, Hudecz Ferenkhi2, Kőhidai László1
1Semmelweis Egyetem, Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet, 2MTA-Eötvös Loránd Tudományegyetem, Peptidkémiai Munkacsoport, Budapest
 
A kemotaxis a filogenezis különböző fokán lévő, migrációra képes sejtek alapvető sejtélettani válaszreakciója. Míg egysejtűeknél főként a táplálékmolekulák és az optimális környezet megközelítésében játszik meghatározó szerepet, magasabb rendűekben pedig számos fiziológiás és patológiás folyamatban. Így fontos lépése gyulladásos reakcióknak, a daganatos sejtek inváziójának és metasztázis képzésének. Pozitív, illetve negatív irányú befolyásolása terápiás szinten is igen nagy gyakorlati jelentőségű. Kemotaktikusan aktív ligandok felhasználásával olyan konjugátumok állíthatók elő, amelyek a kemotaktikus komponens biológiai potenciájától függően a drug-targeting hatásos eszközei lehetnek. Az újonnan leírt „kemotaktikus drug-targeting” (CDT) sikerességét alapvetően az optimális hordozómolekula-kemotaktikus ligand kombináció határozza meg. Előnyös lehet még egyéb biológiai funkcióval is rendelkező peptidek hordozóként való alkalmazása, mint például a fagocitózist indukáló (tuftsin) vagy a sejtmembránon történő penetrációt segítő peptidek (polilizin) használata. Korábbi eredményeink azt mutatták, hogy a ligand és a hordozó karaktere egyaránt befolyásolja a konjugátumok kemotaktikus tulajdonságait. Jelen modellkísérleteinkkel arra kerestünk választ: 1. hogyan befolyásolja az egyébként hatásos molekula kemotaktikus jellegét a polilizin, illetve a tuftsin hordozóhoz építése; 2. található-e hasonlóság az eltérő differencáltsági szinten lévő sejtekre kifejtett hatások között. Kísérleteinkben formilpeptideket (fMLF) tartalmazó polilizin (EAK, SAK) és tuftsin alapú konjugátumokat teszteltünk egysejtű eukaryota csillós Tetrahymena és eltérő differenciáltsági fokú egér-, illetve humán leukaemiás monocytamodelleken (J774, THP1). A kemotaxist kapilláris kemotaxis esszével, illetve monocyták esetén Boyden chamber technika Neuro Probe® kamrás változatával mértük. Eredményeink azt mutatják, hogy a vizsgált konjugátumok nemcsak molekula-, de sejtspecifikus válaszreakciót is képesek kiváltani. A polilizin alapú konjugátumok koncentrációoptimuma 10–16 M, míg a tuftsinszármazékoké 10–7 M. A konjugátumok fluoreszcens módon jelzett formáinak internalizációját konfokális mikroszkóppal vizsgálva, sejt- és ligandspecifikus eltérést egyaránt tapasztaltunk. Megállapíthatjuk továbbá, hogy a tuftsinkonjugátumok eltérően hatnak a differenciálódás különböző szintjén lévő monocytasejtekre; ez a megfigyelés a későbbiekben terápiás potenciált is jelenthet. Összefoglalva megállapíthatjuk, hogy az fMLF ideális kemotaktikus ligand, és konjugátumai a „kemotaktikus drug-targeting” jó alanyai lehetnek a közeljövőben.
 


Chemotactic effects of formyl peptide conjugates on differently differentiated cell lines
Chemotaxis embodies a basic cell-physiological responsiveness of migratory cells persisting on different levels of phylogeny. In unicellular organisms chemotaxis is essential to approach nourishment or the optimal environment in general; it has decisive role in several physiological and pathological processes of higher ranked animal, too. In this way it is a significant step of inflammation as well as invasion and formation of metastases of tumours. Influencing the chemotactic ability either positively of negatively, possess also great practical significance on the level of therapy. By application of chemotactically active ligands conjugates are available, which are good candidates of drug-targeting, depending on the biological potentials of the chemotactic component. Effectiveness of the novel technique “chemotactic drug-targeting” (CDT) is determined mainly by the optimal combination of the ligand and carrier. Introduction of carriers possessing other, biologically important functions i.e. phagocytosis induction (tuftsin), penetration via surface membrane (polylysine) could be also advantageous. Our previous results showed that molecular character of the ligand and carrier alike could influence the chemotactic properties of the conjugates. Objectives of the present model-experiments was: 1. whether application of tuftsin or polylysine as carriers could influence the chemotactic ability of the ligand; 2. is there any similarity in responsiveness of cell lines representing different levels of differentiation. In the experiments formyl peptide (fMLF) containing polylysines (EAK, SAK) and tuftsin-based conjugates were tested in eukaryotic Ciliate, Tetrahymena pyriformis, and in differently differentiated mouse and human leukemic monocyte (J774, THP1) models. Boyden chamber technique (Neuro Probe®) or capillary assay was used to determine the chemotactic activity of monocytes or Tetrahymena, respectively. Our results show that the responsiveness elicited by the conjugates was molecule- and cell-specific. The optimal effective concenttration of polylysine-based conjugates was 10–16 M, while the tuftsin derivatives worked at 10–7 M. Internalization of the fluorescently labelled conjugates, tested by confocal microscopy, refers to also a ligand specific process. Present observations would possess also therapeutic potential, as tuftsin conjugates could act differently on the diverse levels of differentiation. In conclusion, our data underline the significance of fMLF as an ideal chemotactic ligand and the significance of that conjugates of fMLF are promising candidates of chemotactic drug-targeting in the future.
 


63. Emelkedett antigénprezentáció és Th1-polarizáció genetikailag hisztaminhiányos egerekben (P8)

László Valéria1, Jelinek Ivett1, Buzás Edit1, Pállinger Éva2, Thurmond Robin L. 3, Falus András1, 2
1Semmelweis Egyetem, Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet, 2Magyar Tudományos Akadémia–Semmelweis Egyetem, Molekuláris Immunológiai Kutatócsoport, Budapest, 3Johnson & Johnson Pharmaceutical Research and Development, San Diego, USA
 
A hisztamin a gyulladáson kívül is számos immunológiai folyamatot, köztük az antigénspecifikus immunválasz kialakulását is mediálja. A legfontosabb antigén-bemutató sejt a dendritikus sejt; az antigének megkötésére, felvételére, transzportjára, feldolgozására és bemutatására egyaránt képes, arra specializálódott. Így a dendritikus sejtek fontos szerepet töltenek be a patogénekkel szemben mind a természetes, mind az adaptív immunválasz kialakításában.
Jelen kísérleteinkben megvizsgáltuk a hisztamin hatását a dendritikus sejtekre, különös tekintettel antigénprezentációjukra és citokintermelésükre. A kísérleteket genetikailag hisztaminmentes (hisztidin-dekarboxiláz knockout, HDC-KO) egereken végeztük. In vitro eredményeink azt mutatják, hogy a HDC-KO lépsejtek antigénprezentációja kifejezettebb, mint a vad típusúaké. Mivel a citokinek fontos szerepet játszanak mind az antigénprezentációban, mind pedig a Th-sejt-differenciációban, megvizsgáltuk néhány, a Th1-Th2 egyensúly szempontjából jelentős citokin expressziós profilját, real time PCR-technikával. Az in vivo CFA-val (Complete Freund’s Adjuvant) végzett stimulus után a HDC-KO egerekben növekedett a Th1-citokinek – IFN-g, IL-12p35 és a legjellegzetesebb Th1-transzkripciós faktor, a T-bet – mRNS-expressziója. Másrészt, a fő Th2-citokin, az Il-10 és a domináns Th2-transzkripciós faktor, a GATA3 expressziója csökkent a hisztaminhiányos egerekben. Ami a hisztaminreceptorok kifejeződését illeti, a H1- és az újonnan felfedezett H4-receptor ellentétesen változott a CFA-stimulusra: a H1-expresszió nőtt, a H4-expresszió viszont csökkent a HDC-KO egerekben.
Eredményeink alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy a hisztamin Th1 irányú polarizációs és antigénprezentációt fokozó hatását valószínűleg a dendritikus sejtek citokintermelésének megváltoztatásán keresztül éri el.



Increased antigen presentation and Th1 polarisation in genetically histamine-free mice

Histamine, a well-known inflammatory mediator, has been implicated in various immunmodulatory effects and in the development of antigen-specific immune responses. Dendritic cells (DC) are the most potent antigen presenting cells, specialised for capture, uptake, transport, processing and presentation of antigens to T-cells. Thus, DCs play an important role in both innate and adaptive immunity against pathogens. In this study we examined the effects of histamine on dendritic cells, especially on their antigen presenting capacity and cytokine production. Our experiments were performed on genetically histamine-free [histidine-decarboxylase knockout (HDC-KO)] mice. According to our in vitro results the HDC-KO mice spleen cells display a higher efficiency in antigen presentation compared to wild type mice. As cytokines have important role in antigen presentation and Th-cell differentiation, we focused on the expression profile of some cytokines involved in Th1-Th2 balance. After in vivo stimulation with CFA (Complete Freund’s Adjuvant) we detected higher mRNA expression of Th1 cytokines: gIFN, IL-12p35 and the most relevant Th1 transcription factor T-bet in HDC-KO mice. On the other hand the expression of the main Th2 cytokine IL-10 and the dominant Th2 transcription factor GATA-3 decreased in HDC KO mice. Moreover the expression of the histamine H1 receptor and the novel histamine H4 receptor changed in the opposite way after CFA stimulation, the former increased and latter decreased in genetically histamine-free mice. We can conclude that the lack of histamine results in Th1 polarisation and enhanced antigen presentation influencing Th1 cytokine production of dendritic cells.
 


64. A CD19- és CD21- (CR2-) expresszió összefüggése a monocyta/macrophag sejtek eredetével és funkcionális tulajdonságaival (P14)

Látos Helga, Uzonyi Barbara, Prechl József, Matkó János, László Glória
Eötvös Loránd Tudományegyetem, Immunológia Tanszék, Budapest
 
Az érett immunrendszer sejtjei kialakulásának általánosan elfogadott modellje alapján a pluripotens haemopoeticus őssejtből a differenciálódás korai szakaszában szétválik a lymphoid és myeloid vonal. Ennek ellentmondani látszanak azok az irodalmi adatok, amelyek monocyta-, macrophag- funkciókkal és jellegzetesen B-sejt-markerekkel egyaránt rendelkező sejtekről szólnak. Néhány éve azonosítottak is egy CD19+ progenitorpopulációt, amelyből megfelelő körülmények között macrophagok is képesek differenciálódni.
Egy korábbi munkánkban a komplementreceptorok különböző eredetű egérmacrophagokon való megjelenését néztük, néhány funkcióval összefüggésben. A vizsgált monocyta-/macrophag-sejtvonalak közül a J774A.1- és P388D1- sejtek CD21-pozitívnak, míg az RAW264.7- és a WEHI-3-sejtek CD21-negatívnak bizonyultak. Ezek a sejtek az irodalom alapján a macrophagokkal kapcsolatos vizsgálatokban leggyakrabban használt modellsejtvonalak. A P388D1-sejtek esetében korábban leírták azok CD5+ lymphoma eredetét, a J774A.1-sejtek esetében pedig kimutatták a jellegzetesen B-lymphocyta-markerként használt CD19-mRNS jelenlétét.
Jelen munkánkban egyrészt megvizsgáltuk a CD19- és CD21-expresszió összefüggését, másrészt azt, hogy a két molekula a macrophagok membránjában is kolokalizáltan van-e jelen. Kiváncsiak voltunk arra is, hogy a különböző eredetű macrophagokban a CD19, a CD21, illetve néhány jellegzetes B-lymphocyta- és macrophagmarker expressziója hogyan függ össze az adott sejtvonal, illetve sejtpopuláció funkcionális tulajdonságaival.
Az általunk vizsgált négy, macrophag típusú sejtvonal közül a két korábban CD21-pozitívnak talált sejt esetében tudtuk a sejtfelszínen kimutatni a CD19 jelenlétét is. Ezek a sejtek MHC II- és B7-molekulákat is expresszálnak, valamint mind a lép-T-sejtek, mind a Th-hibridómák számára hatékony antigén-bemutatónak bizonyultak. Jól mérhető mennyiségű C3-szekréciót is ennél a két sejtvonalnál tudtunk kimutatni, ezzel szemben a másik két macrophag esetében lehetett jelentős NO-termelést kiváltani LPS-sel, illetve citokinnel. Eredményeink arra utalnak, hogy a macrophagmodellként gyakran használt sejtvonalak differenciáltan expresszálhatnak tipikus B-sejt-markereket; ez összefüggésben állhat funkcionális tulajdonságaikkal is.
Ez a munka az OTKA T043613 pályázati támogatás segítségével készült.
 


Correlation between the origin and functional properties of monocyte/macrophage cells and their CD19 and CD21 expression
According to the general model of maturing cells in the immune system, during the early differentiation stage the pluripotent haemopoetic stem cells diverge to lymphoid and myeloid pathways. There are some data in the literature about cells with monocyte/macrophage functions and B-cell markers, which seems to be inconsistent with this model. Several years ago a CD19+ progenitor population was identificated that was able to differentiate to macrophage at suitable circumstances. In our previous study we examined the expression of the complement receptors on the surface of different murine macrophages in relation to their functions.
Two of the mainly used monocyte/macrophage cell lines, the J774A.1 and P388D1 were CD21+ whereas the RAW264.7 and WEHI-3 cell were CD21–. The lymphoma origin of CD5+ P388D1 cells was reported in earlier papers and the presence of CD19 B-lymphocyte marker’s mRNA on J774A.1 was also shown.
In our present work we have investigated the relation between CD19 and CD21 expression, and on the other hand the co-localization of these two molecules in the monocyte/macrophage cell membranes. Furthermore we were interested in the connection between the expression of CD19, CD21, some important other B-lymphocyte and macrophage-markers and the functional properties of these macrophages of different origin. From these four cell types the J774A.1 and P388D1 cells expressed CD19, besides the earlier recognised CD21, while the other two cell lines did not expressed either. The J774A.1 and P388D1 cells express both MHC-II and B7 molecules, and proved to be efficient antigen presenting cells to T-cells from spleen and to the TH hybridomas. These two cell lines secreted measurable amount of C3, as well. In contrast, significant NO production of the other two macrophages was triggered by LPS or cytokine. Our results suggest that the monocyte/macrophage cell lines – often used as macrophage models- may differentially express typical B-cell markers, wich in turn may be related to their specific functional properties.
This work was supported by the OTKA (National Fund of Science) grant T043613.
 


65. Új monoklonális antikoleszterin ellenanyagok karakterizálása lymphoid és endothelsejteken (P38)

Lőrincz András1, László Glória1, Cervenak László2, Bíró Adrienn2, Füst György2, Matkó János1
1Eötvös Loránd Tudományegyetem, Immunológiai Tanszék, 2Semmelweis Egyetem, III. Sz. Belgyógyászati Klinika, Budapest
 
Az antikoleszterin ellenanyagok (ACHA) jelentőségét aláhúzzák azok a tények, miszerint monoklonális formájuk igen előnyösen alkalmazható lehet a koleszterin-/lipidanyagcsere-betegségek diagnosztikájában és terápiájában, emellett a plazmamembrán-mikrodomének (raftok, caveolák) mikroszkópiás kutatásának is hasznos eszközévé válhatnak.
Korábban beszámoltunk két egér-IgG monoklonális ACHA-előállításáról és specificitásának sejtmentes rendszerben történő jellemzéséről. E vizsgálatok szerint főként a 3b-OH csoport (és esetleg egyéb szerkezeti elemek is) szerepelhetnek a struktúrepitópban, illetve reagáltak a HDL, LDL és VLDL lipoproteinekkel is. Jelen munkánkban az 1/6 és 8/8 IgG3 klónok élő intakt sejtekhez való kötődését vizsgáltuk. Vizsgálatainkhoz egér eredetű (2/13 Th0 hibridóma), illetve humán (Jurkat T-lymphoma) lymphoid sejtvonalakat, valamint endothelsejteket használtunk, a kötődést áramlási citometria (FACS), valamint konfokális fluoreszcens mikroszkópia (CLSM) segítségével detektáltuk.
FACS-adataink szerint mindkét ACHA szignifikáns, bár alacsony kötődést mutatott a kezeletlen egér- és a humán T-sejten egyaránt (~30 µg/106 sejtdózis esetén), a 8/8 klón kissé erősebb kötődése mellett. A T-sejtek felszínének papainos kezelése (5–10 U, 5–10 perc) dózis- és időfüggő módon jelentősen fokozta mindkét ellenanyag kötődését mindkét sejthez. Vizsgáltuk azt is, hogyan hat a plazmamembrán koleszterindepletiója a sejtek egyik alapvető raftkomponensének (GM1 gangliozid), valamint a membránkoleszterin jelölhetőségére, hozzáférhetőségére. A koleszterin membránból történő kivonása mindkét komponens fluoreszcens koleratoxin B-vel, illetve ACHA-val való jelölhetőségét befolyásolta.
CLSM-eredményeink szerint fluoreszcens ACHA-ellenanyagaink intakt egér-T-sejteken jellegzetes, foltos membránfestést mutattak, ennek egy része kolokalizált volt a sejtek raft-mikrodoménjeinek egyik fluoreszcens lipidmarkerével, a DiIC18(3) molekulával. A szaponinnal permeabilizált T-sejtek egyaránt mutattak foltos intracelluláris – valószínűleg vesicularis –, illetve membránfestődést. HUVEC-sejtek esetén a két antitestklón hasonlóan viselkedett, papainos felszíni emésztést követően jelentős membránfestődést figyelhettünk meg.
Eredményeink szerint a két antikoleszterin ellenanyag képes a sejtmembránban, illetve a vesicularisan lokalizált koleszterinhez kötődni, főként papainos emésztés segítségével, ami feltehetően a kicsiny méretű epitóp, illetve a nagyméretű antitest kontaktusát sztérikusan akadályozó fehérjéket távolítja el a plazmamembránból. Így a 8/8 klón ígéretes eszközzé válhat a membránmikrodomén kutatásokban is.
A munka a T043613 és T034393 OTKA pályázati támogatások segítségével készült.
 


Characterization of new monoclonal anti-cholesterol antibodies: binding to lymphoid and endothel cells
The application of monoclonal anti-cholesterol antibodies (ACHA) has been proposed to be promising in the diagnosis and the therapy of diseases with pathological cholesterol/lipid metabolism, and also ACHAs can be useful tools to study membrane microdomains (rafts, caveoles) in live cells.
Lately we reported on production of two mouse monoclonal IgG ACHA and the characterization of their specificity in cell-free systems. According to these data besides the previously supposed 3b-OH group of cholesterol other structural elements might also be involved in the molecular determinant of ACHAs, which equally reacted with HDL, LDL and VLDL lipoproteins, as well. The aim of the present study was to investigate the binding ability of our ACHAs to intact cells. The ACHA binding to mouse (2/13 Th0 hybridoma) and human (Jurkat T-lymphoma) lymphoid cell lines, as well as to human endothel cells was detected by FACS and CLSM.
The data show that both ACHAs can significantly bind, but with a low affinity, to all cells tested (used in ~30 µg Ab/106 cells doses). The 8/8 clone has slightly higher affinity than 1/6. Papain treatment (5–10 U, 5–10 minutes), used to remove most of the long extracellular membrane protein domains, increased the binding of both ACHAs in a dose- and time- dependent manner. Next we tested the effect of cholesterol depletion of the cell membrane on the accessibility of a widely used lipid raft marker (GM1 gangliozid) and on the staining of the membrane by our ACHAs. Cholesterol extraction well detectably influenced the binding of both cholera toxin B and the antibodies.
Fluorescein conjugated ACHAs showed patchy staining characteristics on intact mouse T-cells by CLSM. ACHA staining was partially co-localized with the fluorescent lipid marker of rafts, DiIC18(3). T-cells permeabilized with saponin showed both patchy intracellular and membrane staining. Both ACHA clones showed similar membrane staining characteristics in the case of HUVEC cells, again papain treatment of the cell surface increased the staining.
Summarizing the results, our ACHAs are able to bind to both cell membrane and vesicularly localized cholesterol. Papain digestion significantly could increase Ab binding probably by removing large membrane proteins sterically blocking the access to the possibly small epitope. Our ACHAs, especially the 8/8 clone seem to be promising tools in studying membrane microdomains by live cell imaging.
This work was supported by OTKA (National Science Fund) grants T043613 and T034393.

66. A Gab adapterfehérje által összekapcsolt molekuláris komplex szerepe a BCR által indukált jelátvitel során, egér B-sejtvonalaiban
(P9)

Maus Máté1, Kövesdi Dorottya2, Medgyesi Dávid3, Sármay Gabriella1
1Eötvös Loránd Tudományegyetem, Természettudományi Kar, Immunológia Tanszék, 2MTA-Eötvös Loránd Tudományegyetem, Neurobiológiai Kutatócsoport, 3MTA-Eötvös Loránd Tudományegyetem, Immunológiai Kutatócsoport, Budapest
 
A B-sejt-receptor (BCR) az antigénfelismerést követően különböző jelátviteli útvonalak be-, illetve kikapcsolásával befolyásolja – a fejlődési állapottól és a mikrokörnyezettől függően – a B-sejtek sorsát. A Gab – mint adaptermolekula – több jelátviteli pályát integrál, így tölti be szabályozószerepét a B-sejt-válasz kialakulásában. Pontos szerepe az egyes érési állapotokban nem ismert, pozitív és negatív szerepét is leírták.
Munkánk során az éretlen (38C13), illetve az érett (X16C) B-sejt-sajátságokkal jellemezhető egér-B-sejtvonalak antigénreceptorain keresztül közvetített korai aktivációs jeleket hasonlítottuk össze.
Megvizsgáltuk az Akt és az Erk foszforilációjának kinetikáját mint jellemző túlélési jeleket. Az éretlen B-sejtek 60 perc alatt lecsengő foszforilációt mutattak mindkét esetben, míg az egér érett B-sejtvonal tranziens, a 15. percre lecsengő Erk-, illetve Akt-foszforiláltságot mutatott. Immunprecipitációval megvizsgáltuk a Gab2 által összekapcsolt komplex molekuláris összetételét és ennek változását az idő függvényében, az egyes sejtvonalak aktiválását követően. Eredményeink szerint az éretlen B-sejtekben a második percre a Gab2 tirozinon foszforilálódik, ezzel egybe esik az SHP-2-vel és a PI3-K-val történő asszociációja. A vizsgált érett B-sejteken a Gab2 konstitutívan asszociálódott az SHP-2-vel, a BCR-keresztkötés nem indukált Gab2-foszforilációt, és a Gab2 nem kapcsolódott PI3-K-val. Megjegyzendő, hogy a CD21 és a HSA sejtfelszíni markerek vizsgálatának eredményei és a fent leírt kísérleti eredmények valószínűsíteni engedik, hogy a kísérleteink során használt érett B-lymphocyta-sejtvonal a marginális zóna B-sejtjeinek körébe tartozik. Eredményeink szerint az átmeneti, rövid idő után lecsengő Erk- és Akt-aktiválás, valamint a Gab-komplex BCR-indu- kált foszforilációjának hiánya korrelációt mutat. Ez arra enged következtetni, hogy a Gab által integrált jelpálya meghatározó szerepet játszik a sejtek túlélésének szabályozása során.
 


The role of the Gab-associated molecular complex in the BCR induced signaling in mouse B-cell lines
Following the recognition of the antigen the B-cell receptor (BCR) regulates the survival of the B-cell by switching different signaling pathways on and off. This function is highly dependent on the developmental stage of the cell and its microenvironment. The Gab – as an adaptor molecule – integrates several signaling pathways thus plays important role regulating the B-cell response. However, its role in different stages during the cell development is unclear; studies suggesting positive as well negative role to Gab were also published.
In our experiments we compared the antigen receptor induced early activation signals of B-cell lines expressing immature (38C13) and mature (X16C) features.
The kinetics of Akt and Erk phosphorylation was examined as typical surviving signals. Immature B cells exhibited a sustained Akt and Erk phosphorylation upon BCR cross-linking that decreased after 60 min, while in X16C cells phosphorylation of both kinases were ceasing at 15 min after the stimuli. Immunoprecipitation experiments were performed to study the composition and of the Gab2 organized molecular complex in the different cell lines after BCR stimulation.
According to our results in immature B-cells Gab2 became tyrosine phosphorylated two minutes after activation and associated to SHP-2 and PI3-K. In case of the studied mature B-cell line the Gab2 was constitutively associated to SHP-2, the BCR triggering did not induce tyrosine phosphorylation of Gab2, and Gab2 did not bind PI3-K. The CD21 and HSA expression pattern and the above described experimental data lead to the assumption that the mature cell line used in our examinations represents marginal zone B-cells. According to our results the transient, quickly decreasing Erk and Akt activation and the lack of BCR induced phosphorylation of Gab correlate. This lead to the conclusion that the Gab integrated signaling mechanisms play important role in the regulation of the cell survival during B-cell development.
 


67. Hajhagyma-specifikus autoantitestek kimutatása – új lehetőség? (P55)

Miklós Kata, Szabó Zsófia, Kilián Katalin, Gopcsa László, Németh Julianna
Országos Gyógyintézeti Központ, Budapest
 
A részleges vagy teljes hajvesztés hátterében fellelhető kóroki tényezők igen széles skáláján számos immunológiai kórkép szerepel, mint például a szisztémás lupus erythematosus (SLE), egyéb szisztémás autoimmun kórkép, endocrinopathiák (pajzsmirigybetegség, diabetes mellitus stb.) vagy a coeliakia. A hajhullás ez esetekben legtöbbször reverzíbilis folyamat, a betegség szisztémás kiterjedésének része vagy a gyógyszeres terápia következménye. A folyamatért elsősorban a citotoxikus T-sejtek felelősek, ezek in situ közvetlen gátolják a hajnövekedést. Kimutatásuk direkt immunhisztokémiai módszerrel történik a bőrbiopsziás mintákban.
Munkánkban különböző betegcsoportok szérumában keringő hajhagyma-specifikus autoantitesteket vizsgáltunk majom hajasbőr-szubsztrátján (Immco), indirekt immunfluoreszcencia (IFA) módszerrel, 1:20 hígításban.
Betegcsoportok: szisztémás autoimmun kórképben szenvedők (30 beteg), endocrinopathiához társuló hajhullásban szenvedők (20 beteg), coeliakiás betegek (30 beteg), ismeretlen hátterű hajhullásban szenvedők (20 beteg), egészséges kontrollok (10 beteg).
Kezdeti tapasztalataink alapján úgy gondoljuk, hogy a hajhagyma-specifikus keringő autoantitestek vizsgálata diagnosztikus értékű lehet alopecia areatában, autoimmun endocrinopathiában; a kezelés szempontjából fontos, kiegészítő információt ad szisztémás autoimmun kórképekben, coeliakiában, pajzsmirigybetegségben. A gyógyszermellékhatás miatti hajhullásban szenvedők, illetve a panaszmentes kontrollcsoportban nem találtunk pozitív esetet. Az ismeretlen hátterű hajhullásra panaszkodók között eddig egy pozitív mintát találtunk, a beteg immunszerológiai kivizsgálását javasoltuk.
A hajhagyma-specifikus autoantitestek szűrésének bevezetésével a rutin diagnosztikai gyakorlatban szeretnénk megtalálni azt a betegcsoportot, ahol ezek az antitestek kóroki szerepet játszhatnak. Szeretnénk az ismeretlen hátterű hajhullás panaszával érkezők gondozását a megfelelő irányba terelni.
 


Antibodies against hair follicles – a new approach?
On the wild scale of reasons that can be in the background of partial or total hair loss, there are many immunological disorders, such as systemic lupus erythematosus (SLE), other systemic autoimmune diseases, endocrinopathies (diseases of the thyroid gland, diabetes etc.) or celiac disease. In these cases the hair loss is a reversible process, induced by the systemic extension of the disease or the drug therapy. Mainly the citotoxic T-cells are responsible for the process, due to the direct in situ inhibition of hair growth. The detection of the citotoxic T-cells is a direct immunehistochemical method done on skin biopsic sample.
We observed the anti-hair-follicle antibodies in sera on monkey skin covered with hair (Immco) by indirect immunefluorescennce method, in a dilution one to 20 in case of different groups of patients.
Groups of patients: systemic autoimmune diseases (30 patients), hair loss associated with endochrinopathy (20 patients), coeliac disease (30 patients), hair loss with unknown background (30 patients),
healthy controls (10 person)
Our early data suggests that the detection of anti-hair-follicle antibodies in sera can have diagnostic value in case of endocrinological disorders in association with alopecia areata. It also gives important, additional information in case of systemic autoimmune or coeliac diseases. There was no positive sample in the groups of patients with hair loss induced by drug side effect and in healthy persons. Only one positive case was found among the patients suffering from hair loss with unknown background, whose immunserological examination was suggested.
By the introduction of the detection of anti-hair-follicle antibodies into the routine diagnostics, we aimed to find the group, where these antibodies have significant role in the disorder. Furthermore, we would like to turn the treatment of patients with hair loss with unknown background to the right direction.
 


68. A g/d és az NKT-sejtek vizsgálata praeeclampsiában (P10)

Mikó Éva1, 2, Barakonyi Alíz1, Szekeres-Barthó Júlia1, 2
1
Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Orvosi Mikrobiológiai és Immunitástani Intézet; 2MTA, Tudományos Kutatóintézet, Reproduktív és Tumor-Immunológiai Kutatócsoport, Budapest
 
Bevezetés: Ismert, hogy praeeclampsiában számos immunológiai eltérés figyelhető meg. A Th1-shift következtében nő a citotoxikus lymphocyták száma a perifériás vérben; felerősödnek a citotoxikus funkciók; extrém magas IFN-g-, illetve alacsony IL-6- és IL-10-szérumszintek mérhetőek. Csökken a T-sejtek apoptózisa, a fokozott IL-2-szekréció hatására csökken az angiogenezis, sérül az endothelsejtek működése. Jelen munka során a g/d sejtek és a természetes ölősejt- (NKT-) populációk arányait, perforintartalmát, aktiváltsági állapotát és KIR-expresszióját vizsgáltuk nem terhes, egészséges terhes és praeeclampsiás terhes donorok perifériás vérében.
Módszerek: Perifériás vérből áramlási citometriás analízissel határoztuk meg a g/d, d2- és NKT-sejtek arányát, illetve ezen sejtek perforintartalmát, a CD69 és az NKG2A felszíni expresszióját.
Eredmények: Kísérleteinkben a g/d-, d2- és NKT-sejtek aránya mindegyik vizsgált csoportban megegyezik. Egészséges terhesség esetén, nem terhes donorokhoz viszonyítva a perforintartalmú sejtek száma szignifikáns csökkenést mutatott. Ez a változás mind az összlymphocyta, mind az egyes g/d, d2- és NKT-sejtpopulációk esetében megfigyelhető. A fenti eredményekkel ellentétben praeeclampsiás betegeken a csökkenés elmarad. Az NKT-sejtek aktiváltsága – a többi donorcsoporthoz képest – szignifikánsan magasabb praeeclampsiában.
Következtetés: Praeeclapmpsiában a g/d, d2- és NKT-sejtpopulációkban megfigyelt emelkedett perforintartalom, illetve az NKT-sejtek magas aktivitása arra enged következtetni, hogy e sejtcsoportok aktívan részt vesznek a betegség során megfigyelhető káros immunológiai elváltozások kialakításában.
 


g/d and NKT-cells in normal pregnancy and pre-eclampsia
Background: Pre-eclampsia is immunologically characterized by a strong Th1 shift with increased peripheral citotoxic lymphocyte subsets, extremly high levels of IFN-g and decreased release of IL-6 and IL-10 cytokines. Apoptosis of T-cells is found to be lower and enhanced IL-2 secretion leads to angiogenesis impairment and endothel dysfunction.
Aims of the study: In this work we investigated the ratio of different lymphocyte subsets including g/d, d2 and NKT-cells. Perforin content, cell activity level and KIR expression were determined in the latter cell groups of different donors as non pregnant, healthy pregnant and pre-eclamptic patients.
Methods: Two- or three-colour flow cytometric analysis were done from peripheral blood of the donors. Ratios of g/d, d2, NKT-cells were determined and intracellular peforin content, CD69 cell surface positivity and NKG2A expression were measured among these cell populations.
Results: In our study we found equal ratios of g/d, d2 and NKT-cell population in each investigated group. In the case of normal pregnancy the number of perforin+ cells is significantly lower than in that of non pregnant healthy individuals. This finding concerns the whole lymphocyte population as well as the subsets g/d, d2 and NKT. In contrast to this result pre-eclamptic patients do not show lower perforin content in the investigated cell groups. Measuring the activity of NKT-cells we found a significantly higher level in the pre-eclamptic donors compared to healthy pregnant and non-pregnant individuals.
Conclusion: Taken together our findings suggest that g/d T-cells as well as NKT-cells contribute to the development of harmful immunological changes during pre-eclampsia.
 


69. A 2-es típusú komplementreceptor (CR2, CD21) kifejeződik az egér-T-sejtek egy szubpopulációján (P11)

Molnár Eszter1, Prechl József1, Balogh Péter2, Balla Bernadett1, Erdei Anna1
Eötvös Loránd Tudományegyetem, Immunológiai Tanszék, Budapest; 2Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvos- tudományi Kar, Immunológiai és Biotechnológiai Tanszék
 
A CR2 (CD21) szerepe a B-lymphocytákon és a follicularis dendritikus sejteken régóta ismert, ezzel ellentétben a T-sejteken kifejeződése és funkciója nem tisztázott.
Kísérleteinkben egér-T-sejteken vizsgáltuk a CD21 meg- jelenését, a receptort felismerő egyláncú ellenanyaggal (7G6scFv). A vizsgálatokhoz intraperitonealisan oltott egerek mesenterialis nyirokcsomóját használtuk. Az oltás után két órával citofluorimetriával kimutattunk egy CD21-et kifejező CD4+, IgD– sejtpopulációt, amely további vizsgálatainkban B220+-nak és CD5+-nak, valamint CD19–-nak és CD32–-nak mutatkozott. A nyirokcsomósejtek in vitro 7G6scFv-vel való egyórás kezelésének hatására megduplázódott a CD21-et kifejező T-sejtek száma. Szérumkezelés során feltételezhetően a receptorhoz kötődő C3 hatására szintén növekedett a CD21-et kifejező T-sejtek aránya. A CD21 jelenlétét fluoreszcens mikroszkóppal mutattuk ki a CD3+ sejtek egy részén.
A CR2 funkcionális szerepét T-sejteken a 7G6scFv ellenanyag segítségével vizsgáltuk, ez a CR2 C3d-kötőhelyét ismeri fel, jól modellezve a receptor ligandumkötésének hatását. Mesenterialis nyirokcsomósejtek CD21-en keresztüli aktiválása hatására a T-sejtek egy szubpopulációja osztódik, amit a sejtmagba beépülő BrdU mennyiségének mérésével követtünk. Kimutattuk továbbá ezen sejtekben aktiválás hatására az NF-kB transzlokációját a sejtmagba.
 


A subpopulation of mouse T-cells expresses type 2 complement receptor (CR2, CD21)
The role of the CR2 (CD21) on the surface of B lymphocytes and follicular dendritic cells is well known for a long time, while its expression and function on T-cells is not clarified yet.
In our studies we examined the expression of CD21 in the population of mesenterial lymphocytes of mice intraperitoneally injected with 7G6scFv, a CD21-recognizing single-chain antibody. We detected a CD21 expressing CD4+, IgD– cell population two hours after injection. These cells were proved to be B220+, CD5+, CD19–, CD32–. The number of CD21 expressing T-cells in mesenteric lymph node suspension was doubled after one hour of in vitro treatment by 7G6scFv. The ratio of CD21+ T-cells also increased following serum-treatment, suggesting the effect of C3. The presence of CD21 on the surface of CD3+ cells was proved also by fluorescence microscopy.
The function of CR2 on T-cells was examined employing 7G6scFv. This antibody recognizes the C3d binding-site of CR2, thus modeling the effect of ligand-binding. Upon activation via CD21, a subpopulation of mesenteric lymph node T-cells proliferated, as detected by BrdU incorporation into the DNA. Furthermore, the translocation of NF-kB to the nucleus was also demonstrated in these cells.

70. Citrát-szintáz-specifikus autoantitestek összehasonlító epitóptérképezése
(E31)

Nagy Gergely1, Czömpöly Tamás1, Bősze Szilvia2, Nyárádi Zoltán3, Petrohai Ágnes4, Berki Tímea1, Czirják László5, Németh Péter1
1Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Immunológiai és Biotechnológiai Intézet; 2Eötvös Loránd Tudományegyetem-MTA Peptidkémiai Kutató Csoport; 3Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Fogászati és Szájsebészeti Klinika; 4Semmelweis Orvostudományi Egyetem, Szívsebészeti Klinika, Budapest; 5Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Klinikai Immunológiai és Reumatológiai Klinika
 
Kutatásunkban arra kerestünk választ, hogy a genetikailag magas fokban konzervált mitochondrialis belsőmembránenzimek – közülük is a citrát-szintáz (CS) – viselkedhetnek-e autoantigénként fiziológiás és kóros körülmények között, és részt vesznek-e az „immunológiai homunculus” alkotásában.
Vizsgálatainkban citrát-szintáz (CS), enzimek elleni IgG, IgM izotípusú autoantitesteket határoztunk meg emberi vérszérumokból, ELISA-módszerrel. Egészséges felnőttek (334 fő), szisztémás autoimmun betegségben szenvedők (326 fő), valamint szívtranszplantált betegek (27 fő) szérumában hasonlítottuk össze az autoantitestek mennyiségét és izotípusát. Screening ELISA-méréseink alapján összeválogattunk egy reprezentatív mintát további epitópspecificitás-vizsgálatok céljára. A vizsgált epitópokat előzetes B-sejt-epitóp-predikcióval választottuk ki. Az átfedő szintetikus peptidfragmentumokat tűhegyen történő szintézissel állítottuk elő, az epitópspecificitás-vizsgálat tűhegy-ELISA-módszerrel zajlott. Hogy növelhessük a vizsgált epitópok számát, CS-antigénfragmens könyvtárat készítettünk, amelyet l fág felszínén jelenítettünk meg. A különböző antigénfragmenseket hordozó fágokat a vizsgált szérumokkal szelektáltuk, dúsítottuk.
Mérési adataink azt mutatják, hogy, az összes populációban kimutathatók az autoantitestek, titerük a vizsgált csoporttól függően széles tartományban változott. Az egészséges kontrollpopulációnál IgM izotípusú autoantitesteket detektáltunk, alacsony titerrel. A szignifikánsan emelkedett (>2 SD) titerek elsősorban IgM izotípusúak voltak az autoimmun betegeknél, IgG izotípusúak voltak a szívtranszplantált betegeknél. A különböző időpontokban vett mintákban az egyes egyének értékei állandónak bizonyultak IgM-ellenanyagok esetében, és az IgG izotípusú autoantitestek időben változó titert mutattak. A vizsgált csoportokat összehasonlítva, a citrát-szintáz enzimen felismert epitópok jelentős hasonlóságot mutattak az alacsony titerű IgM izotípusú autoantitestek esetében. Összehasonlítva a vizsgált csoportokat, az IgG izotípusú autoantitestek különböző epitópokat ismertek fel.
Szintetikus átfedő peptideken kapott epitópspecificitási eredményeinket a fágdisplay antigénfragmens könyvtárral ellenőriztük.



Comparative epitope mapping of citrate synthase specific autoantibodies

Immunological recognition and tolerance of evolutionally conserved molecules like mitochondrial inner membrane citrate synthase (CS) is an interesting question in theoretical and applied immunology.
To address this issue. We investigated 796 clinically well documented serum samples for CS specific autoantibodies: healthy control (334), patients with systemic autoimmune diseases (326), patients with various rheumatologic disorders (109) and heart transplanted immunsupressed patients (27). Autoantibodies against CS were detected immunoserologically (indirect ELISA). Based on the ELISA reactivity a representative set of sera were selected for further epitope analysis. The epitope specificity of autoantibodies against CS was measured on overlapping synthetic peptide fragments, previously chosen by B-cell epitope prediction. In order to increase the number of investigated epitopes we constructed a CS antigen fragment library displayed on phage l.
Our results show that autoantibodies against citrate synthase are present in all population with a characteristic distribution in their titer and isotype. In healthy individuals, autoantibodies with lgM isotype are present in low titer with a constant level in time (detected repeatedly during three years). IgG autoantibodies with high titer (variable in time) were present in heart transplant recipients. Elevated level of IgM autoantibodies were found in patients suffering in autoimmune disorders. The epitope specificity of CS autoantibodies with IgM isotype shows a similar pattern in the different examined patient groups. However, autoantibodies with IgG isotype show different epitope patterns among the different groups.
Results of the epitope mapping with overlapping synthetic peptides were controlled by our phage display CS antigen fragment library.
 


71. A CARD15/NOD2 gén három mutációjának vizsgálata magyar Crohn-betegeken és egészséges kontrollokon (P29)

Nagy Zsuzsanna1, Karádi Oszkár1, Rumi György3, ifj. Rumi György1, Pár Alajos1, Mózsik Gyula1, Czirják László2, Sütő Gábor2
Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, 1I. Sz. Belgyógyászati Klinika, 2Immunológiai és Reumatológiai Klinika; 3Kaposi Mór Kórház, Kaposvár

Bevezetés:
A Crohn-betegség kialakulásában genetikai, autoimmun és környezeti tényezők kölcsönhatása játszik szerepet. A gyulladásos bélbetegségekkel nyolc génlocust hoztak kapcsolatba (IBD1-IBD8). Jelenleg az IBD1 génlocusban található NOD2 gén és a Crohn-betegség asszociációja tűnik a legjelentősebbnek. A CARD15/NOD2 gén bizonyos polimorfizmusai (Arg702Trp, Gly908Arg és Leu1007fsinsC) gyakrabban fordulnak elő Crohn-betegségben. A NOD2 egy „betegségrezisztencia-gén” és a bakteriális lipopoliszacharidokkal szembeni fogékonyság szabályozója.
Cél: A három mutáció allélfrekvenciájának vizsgálata Crohn-betegeken és egészségeseken.
Módszer: A vizsgálatba 74 Crohn-beteget és 107 kontrollt vontunk be. A Gly908Arg mutációt vizsgálva polimeráz láncreakciót követően az amplifikált mintákat a mutációspecifikus HhaI restrikciós enzimmel emésztettük. Az Arg702Trp és Leu1007fsinsC mutációkat allélspecifikus primerekkel végzett polimeráz láncreakcióval vizsgáltuk. A csoportok allélfrekvenciáját c2-próbával hasonlítottuk össze.
Eredmények: A Gly908Arg mutáció allélfrekvenciája a Crohn-betegeknél (2,70%) és a kontrolloknál (1,42%) nem különbözött szignifikánsan. Az Arg702Trp és az Leu1007fsinsC mutációk szignifikánsan nagyobb allélfrekvenciát mutattak betegeinknél (10,29% és 9,55%), mint a kontrolloknál (4,67% és 2,88%).
Következtetések: A CARD15/NOD2 gén ARG702Trp és Leu1007fsinsC mutációi összefüggést mutatnak a Crohn-betegséggel. A betegségre hajlamosító gének vizsgálata segíthet abban, hogy megértsük a környezeti hatások szerepét a bélgyulladásokban.
A vizsgálatot az Országos Tudományos Kutatási Alapprogramok (OTKA) F042912, F037639, T046437 és az Egészségügyi Tudományos Tanács (ETT) 98/2001 pályázat támogatta.
 


The examination of three mutations in the CARD15/NOD2 gene in Hungarian Crohn’s disease patients and healthy controls
Introduction: The development of Crohn’s disease influenced by genetic, autoimmun and environmental factors. The inflammatory bowel disease is linked to 8 gene loci (IBD1-8). Most notable is the association of the CARD15/NOD2 gene in IBD1 locus to Crohn’s disease. Certain polymorphisms of the CARD15/NOD2 gene (Arg702Trp, Gly908Arg and Leu1007fsinsC) are most common in Crohn’s disease. CARD15/NOD2 is a disease-resistance gene and regulator of the response to lipopolysaccharides found in bacteria.
Aim: The allele frequency of the three mutations was evaluated in Crohn’s disease patients and healthy controls.
Methods: Seventy-four Crohn’s disease patient and 107 controls were examined. To detect the Gly908Arg mutation after the polymerase chain reaction the DNA sequence was digested by the mutation specific HhaI restriction enzyme. The Arg702Trp and Leu1007fsinsC mutations were detected with polymerase chain reaction using sequence specific primers. The allele frequencies of the groups were compa-red with c2 analysis.
Results: The allele frequency of the Gly908Arg mutation in the Crohn’s disease patients (2.70%) and controls (1.42%) did not differ. The allele frequency of the Arg702Trp and Leu1007fsinsC mutations were higher in patients (10.29% and 9.55%) than in controls (4.67% and 2.88%).
Conclusions:
Carriage of the Arg702Trp and Leu1007fsinsC mutations in CARD15/NOD2 gene are associated with Crohn’s disease. The examination of the disease susceptibility genes could potentially lead to understanding of the contribution of environmental factors to intestinal inflammation.
The study was supported by grants of National Research Found (OTKA), Hungary (No. F042912, No. F037639, No. T046437) and Hungarian Ministry of Health (ETT 098/2001).
 


72. Etika, allergia, immunológia (E35)

Nékám Kristóf
Budai Irgalmasrendi Kórház, Budapest
 
Bár a bioetikán belül aligha vannak olyan elvek, amelyek kizárólag az immunológiára-allergológiára érvényesek, mégis elkülöníthetők olyan jellemző dilemmák, amelyeknél etikai szempontokat is érvényesíteni kell.
A fő problémák és az érintettek (akiknek mind jellegzetes saját érdekeik vannak):
A betegek. Érdekük a minél magasabb szintű, hozzáférhető szakellátás, a megfizethető árú gyógyszerek, a teljes körű, modern, érthető információkhoz való hozzáférés, hogy saját helyzetükről elsősorban maguk dönthessenek.
A hozzátartozók, akiknek életminőségét a folyamatos aggódás és készenlét súlyosan korlátozza (például súlyos asthmás vagy étel-, rovarméreg-allergiás betegek esetén).
A betegszervezetek, amelyeknek a társadalommal és az egészségüggyel szembeni elvárásai kizárólag más betegcsoportokéival harmonizálva valósulhatnak meg.
Az egészségügyi ellátást nyújtók, akik elvárhatják, hogy a munkájukhoz, továbbképzésükhöz, szakmai pályájukhoz szükséges infrastrukturális, informatikai és más szükségleteik legalább olyan szinten teljesüljenek, mint amilyen szintű ellátást tőlük a betegek és a társadalom elvárnak, és magas szintű folyamatos munkájukért biztosítsák számukra a pihenés, családfenntartás, tisztességes nyugdíj feltételeit.
A finanszírozók, akiknek az immunológia területén szembe kell nézniük a betegszám és talán a súlyosság dinamikus növekedésével, párhuzamosan a betegek egészség-helyreállítás iránti igényével, és a forrásokat ezekhez meg kell(ene) teremteniük.
A politikai döntéshozók, akiknek minden más előtt egy ország lakosságának iskolázottsági és egészségi állapotáért kell felelősséget viselniük.
A kutatásokat tervezők, végzők és eredményeit hasznosítók, akiknek óriási a felelősségük a prioritások meghatározásában, a vizsgálatokban részt vevő betegek felmérhető, prognosztizálható kockázatainak mérlegelésében, szemben az egyéni érdekek korábban mindenek feletti védelmével. Ez utóbbi túlhangsúlyozása várhatóan nagy betegcsoportokat zárhat ki a hatékony kezelésmódokból.
Az epidemiológiai vizsgálatok tervezői és végrehajtói, akiknek adatain, előrejelzésein betegcsoportok sorsa múlhat: hogy eredményeik mindenféle részrehajlástól mentesek és végső soron a teljes populáció vonatkozásában reprezentatívak lehessenek.
Végül a média, tágabb értelemben a kommunikáció szakemberei és szervezetei, hogy terjesztett információik szak-mailag igazak, hatékonyak, külső befolyásoktól mentesek, a célszemélyekre, lakossági rétegekre szabottak legyenek.
Az ismert, folyamatosan csiszolódó bioetikai irányelvek (WHO, WAM, CIOMS, ET stb) a mindennapi életben, a folyamatos döntési kényszerek során kevés segítséget nyújtanak, ha a fent részletezett szereplők maguk nem állnak biztos etikai alapokon.
 


Ethics in allergy and immunology
There are no bioethical principles, exclusively valid for clinical immunology or allergy. Still, there are characteristic dilemmas, targets for ethical considerations.
The most important participants (all with particular interests) and problems are: the patients – who are interested in the highest level health services, medicines at reasonable price, in full scale, correct information as firm basis for their decisions.
Relatives (of patients with severe asthma, food hypersensitivity or insect venom allergy) – who’s quality of life is severely reduced by continuous fear.
Patient organizations
with high expectations towards society and health care – which have a chance of implementation only if harmonized with other organizations’ interests.
Health service providers who’s needs for effective work, life long professional career have to be met at the same level, as they are expected to provide services towards patients, the whole society.
Financing organizations which have to face the dinamic, ongoing increase of the number of patients and disease severity in allergy and immunology, parallel to the need of patients for repaired health – and which organizations have to find matching resources for these activities.
Political decision makers
who have enormous burden of responsibility for the educational and health level of their country.
Researchers, research institutions, pharmaceutical companies who have to decide on priorities, and to consider individual risks for participants in clinical trials, now instead of the overall protection of their individual interests.
Performers and analizers of epidemiological studies – who have to present unbiased, representative data and conclusions – often decisive for the future of disease groups.
Finally, organizations and professionals of media and in general, communication, who are responsible for true, accessible, effective, tailored professional information.
Well-known ethical guidelines of WHO,WMA,CIOMS etc, however, remain theoretical, if the participants themselves, listed above will not stand on a firm ethical basis.
 


73. A B12-vitamin-hiány autoantitest-diagnosztikája coeliakiában
(P56)

Németh Julianna, Kilián Katalin, Gopcsa László, Szabó Zsófia, Novák Mária, Miklós Kata
Országos Gyógyintézeti Központ, Budapest
 
A coeliakiás betegek egy részében csökkent B12-vitamin-szint található. Ennek okaként a terminális ileumszakasz nyálkahártyájának érintettsége jön szóba, vagy olyan specifikus autoantitestek jelenléte a keringésben, amelyek károsítják a gyomor parietalis sejtjeit (anti-gastric parietal cell antibody, AGPCA). Ugyancsak B12-vitamin-hiányt okoz a vitamin metabolizmusához szükséges intrinsic faktor (IF) elleni kötő- (I., binding) vagy blokkoló- (II., blocking) autoantitestek jelenléte is. Ez utóbbi antitestek ugyanakkor az anaemia perniciosa marker-autoantitestjei.
Munkánkban 57, szerológiailag igazolt coeliakiás beteg (életkoruk 2–73 év; 42 nő, 15 férfi) szérumából B12-szintet határoztunk meg, valamint parietalis sejt elleni és intrinsic faktor elleni autoantitesteket néztünk. A szérumminták B12-szintjét Abbott immunkémiai automatával, a protonpumpa elleni antitestet patkánygyomormetszeten indirekt immunfluoreszcenciával, az intrinsic faktor elleni I-es és II-es típusú antitesteket ELISA-módszerrel határoztuk meg.
A betegek 30%-ánál csökkent B12-szintet találtunk, AGPCA-pozitivitást a betegek 14%-ánál mutattunk ki, IF-pozitivitás 8,8%-ban fordult elő. Az IF-antitestre pozitív minták (öt) többsége (három) egyúttal AGPCA-pozitívnak is bizonyult (kettős pozitivitás).
A B12-vitamin-hiányos coeliakiás betegeken az általunk vizsgált autoantitestek szűrését (AGPCA és IF) fontosnak tartjuk, hiszen a gluténmentes diéta csak a felszívódási zavar okozta hiányállapotot szünteti meg. A társult, esetleg látens anaemia perniciosa kezeletlen marad, tehát ezekben az esetekben a diéta mellett B12-vitamin-pótlás is szükséges. Az AGPCA-antitestre (is) pozitív betegek esetén indokolt a gyomorstatusuk longitudinális követése is. Az előadás részletesen elemzi a B12-vitamin-hiánnyal összefüggő laboratóriumi vizsgálatok algoritmusát.
 


Diagnosis of B12 vitamin deficiency in coeliac disease by means of autoantibodies

As is known, the level of B12 vitamin is reduced in part of patients with coeliac disease. The reason for this phenomenon may be the involvement of mucosa of terminal ileum, or the presence of specific circulating autoantibodies destroying the parietal cells of stomach (anti-gastric parietal cell antibody AGPCA). The cause of reduced B12 level may also be the presence of autoantibodies of type I (binding) or type II (blocking) against the intrinsic factor (IF) necessary for the metabolism of B12 vitamin. The IF antibodies are, at the same time, the marker autoantibodies for anaemia perniciosa.
In this study the level of B12 vitamin, and simultaneously the autoantibodies against parietal cells and intrinsic factor were measured in serum of 57 patients (age between 2–73 years, 42 women, 15 men) with serologically proved coeliac disease.
The B12 level in the serum was measured by Abbott immunochemical automated system, the protonpump specific autoantibodies (AGPCA) were evaluated by indirect immunfluorescence method on rat stomach, and the type I and type II IF antibodies were detected by ELISA.
Reduced B12 level was found in 30% of the patients, the rate of AGPCA positivity was 14%, while that of IF antibody positivity was 8.8%. Most of the samples with IF antibody positivity (five) proved to be AGPCA positive (three) as well (double positivity).
Our opinion is that autoantibody screening (AGPCA and IF) is important in patients with coeliac disease associated with B12 deficiency, because gluten-free diet can solve only the problem of the B12 deficiency caused by malabsorption. This type of diet lets the associated, occasionally latent anemia perniciosa untreated, so the patient needs B12 substitution together with the diet. The longitudinal follow-up investigation of the state of stomach of patients with AGPCA positivity is necessary.
A detailed analysis of the algorithm of laboratory investigations related to B12 deficiency is also given in this presentation.
 


74. Az MBL – a C1q-molekulához hasonlóan – kötődik az endothelsejtekhez. Az MBL szerepének vizsgálata az endothelsejtek aktiválásában (E16)

Oroszlán Melinda1, 3, Roos Anja3, Cervenak László2, Prohászka Zoltán1, 2, Füst György1, 2, Daha Mohamed R. 3
1
Semmelweis Egyetem, III. Sz. Belgyógyászati Klinika, 2Magyar Tudományos Akadémia-Semmelweis Egyetem, Metabolizmus és Atherosclerosis Kutatócsoport, Budapest; 3Department of Nephrology, Leiden University Medical Center, Leiden, Hollandia
 
Az erek falait alkotó endothelsejtek fontos szerepet játszanak az érrendszer homeosztázisának fenntartásában, kóros működésük gyulladásos folyamatokat segíthet elő. Ismert adat, hogy a C1q-molekula, amely a klasszikus komplementkaszkád felismeréséért felelős, alegysége kollagénszerű doménjén keresztül kötődik az endothelsejtekhez; ez az adhéziós molekulák fokozott expresszióját, valamint fokozott citokintermelést eredményez. A mannózkötő fehérje (MBL) – a lektinfüggő komplementkaszkád szénhidrátmintázat-felismerő egysége – több strukturális hasonlóságot mutat a C1q-molekulával, közös receptoraik is ismertek. Hipotézisünk szerint az MBL – hasonlóan a C1q-hoz – képes kölcsönhatásba lépni az endothelsejtekkel, ezáltal aktivációjukat előidézni.
Kísérleteinkben humán köldökzsinórvéna endothelsejtjeit használtuk. A C1q- és MBL-fehérjét humán plazmából izoláltuk. Az endothelsejtekhez kötődött C1q-t és MBL-t monoklonális ellenanyagok segítségével, áramlásos citofluoriméteren (FACS) mértük. Propidium-iodid használatával kizártuk az analízisből a nem élő sejteket. Az IL-8- és az MCP-1-meghatározáshoz a 48 órát kezelt sejtek felülúszóit használtuk, a koncentrációmeghatározást szendvics ELISA-val végeztük.
Az MBL, kalciummentes pufferben, dózisfüggő kötődést mutatott az endothelsejtekhez, ez a kollagénszerű domén kötődésére utal. Amennyiben a sejteket együtt inkubáltuk a C1q- és az MBL-fehérjével, csökkent kötődést figyeltünk meg mind a C1q-, mind az MBL-molekulák esetében, ami az azonos kötőhelyekért fellépő kompetícióra utal. Az endothelsejtek 48 órás stimulálása az LPS- és a TNF-a gyulladásos mediátorokkal szignifikáns növekedést eredményezett a C1q- és az MBL-kötődésben. Az MBL-receptorként is számon tartott C1q-receptorok – kalretikulin és komplementrecep-tor-1 – közül kizárólag kalretikulinexpressziót tudtunk detektálni. Ennek expressziós szintjén azonban sem az LPS-, sem pedig a TNF-a-kezelés nem változtatott, hasonlóan a komplementreceptor-1 molekulához. Az MBL- és C1q-kezelést követően fellépő sejtaktivációt az IL-8-, MCP-1-termelésen keresztül mértük. Mindkét molekula esetében emelkedett citokinexpressziót detektáltunk.
Eredményeink azt igazolják, hogy az MBL – kollagénszerű régióján keresztül – képes az endothelsejtekhez kötődni, ezáltal aktiválva az endothelsejteket. Az endothelium és a MBL között kialakult kölcsönhatásnak in vivo is szerepet tulajdoníthatunk, amely proinflammatorikus válasz létrejöttéhez vezethet.



Both C1q and MBL bind to human endothelial cells. Potential involvement in endothelial cell activation

Endothelial cells play a crucial role in the maintenance of the vascular homeostasis, and activation of endothelial cells is a central process in inflammation. It has been previously shown that C1q, the recognition subunit of C1 complex can bind to endothelial cells via its collagenous domains and this interaction can result in increased expression of adhesion molecules and production of cytokines. MBL, a major recognition factor of the lectin pathway of complement, shows structural similarity to C1q and can bind to several C1q-binding receptors. We hypothesize that MBL can also interact with endothelial cells and induce endothelial cell activation. Therefore, the aim of our studies was to characterize the potential interaction of MBL with endothelial cells, and to examine the cell activation following stimulation by MBL and C1q.
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were used. C1q and MBL were purified from human plasma. Binding of C1q and MBL to HUVEC was evaluated by flow cytometry using monoclonal antibodies against C1q and MBL. Dead cells were excluded from the analysis by the use of propidium iodide. IL-8 and MCP-1 were measured from the supernatant by sandwich ELISA following 48 hours stimulation.
MBL showed a clear and dose-dependent binding to viable HUVEC under calcium free circumstances strongly suggesting involvement of the collagenous domains of MBL. Co-incubation with C1q inhibited the binding of MBL to HUVEC and vice versa, suggesting overlapping binding sites for MBL and C1q. Activation of HUVEC with LPS and TNF-a resulted in elevated C1q and MBL binding. Calreticulin and complement receptor-1 are C1q-binding proteins that were described to interact with MBL as well. However, expression of calreticulin on HUVEC was not modified by LPS or TNF-a, in spite of the elevated C1q and MBL binding. Furthermore, complement receptor-1 was not detectable on quiescent cells and it was not expressed following stimulation.
To examine induction of endothelial activation via MBL and C1q, HUVEC were cultured in the presence of MBL and C1q. Both MBL and C1q were able to increase the production of IL-8 and MCP-1 by HUVEC.
Together, these data indicate that MBL is able to bind to endothelial cells via its collagenous domain, which can result into endothelial cell activation. We hypothesize that such an interaction may be especially relevant in vivo when the endothelium may come into contact with MBL bound to a target via its lectin domain, leading to a pro-inflammatory response.
 


75. A 4-es típusú hisztaminreceptoron (H4R) keresztül kifejtett hatás hiánya módosítja-e a haemopoesist? Haemopoeticus sejtek összehasonlító vizsgálata H4R-KO és a vad genotípusú egerekben (E6)

Pállinger Éva1, Horváth Zsuzsanna2, Buzás Edit2, Hegyesi Hargita2, Jelinek Ivett2, Thurmond Robin L.3, Falus András1, 2
1MTA-Semmelweis Egyetem, Molekuláris Immunológiai Kutató Csoport; 2Semmelweis Egyetem, Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet, Budapest; 3Johnson & Johnson Pharmaceutical Research and Development, San Diego, USA
 
A vérképzés összetett szabályozási rendszerében a haemopoeticus növekedési faktorok, kemokinek és citokinek mellett többek között számos kis molekulasúlyú anyag – mint például a hisztamin – is szerepet játszik. A hisztamin hatása nagymértékben függ a célsejteken expresszálódó hisztaminreceptorok fajtájától és mértékétől. Irodalmi adatok szerint a haemopoeticus sejtek felszínén kimutatható a hisztaminreceptorok közül a H1-, a H2- és a H4-receptor jelenléte.
Jelen kísérleti rendszerünkben SV129 típusú H4R-KO genetikailag módosított egerek perifériás fehérvérsejtjeinek, csontvelői érett és éretlen sejtpopulációinak megoszlását és a lépsejtek H1-, illetve H2-receptor-expressziójának, valamint intracelluláris HDC- és hisztamintartalmának mértékét vizsgáltuk meg áramlási citometriás módszerrel. Összehasonlítási alapul azonos törzsű, korban és nemben illesztett vad genotípusú egércsoportot használtunk. Munkánk során arra kerestünk választ, hogy befolyásolja-e a 4-es típusú hisztaminreceptor (H4R) hiánya a vérképzőrendszer működését.
Módszerek: A leukocytapopulációk azonosítására 3-as és 4-es színű áramlási citometriás jelöléseket alkalmaztunk. A lépsejtek H1R- és H2R-expressziójának mértékét, illetve HDC- és hisztamintartalmát áramlási citometriás módszerrel, a fluoreszcenciaintenzitás-értékek összehasonlításával végeztük el. Mind a H4R-KO, mind a vad genotípusú kontrollcsoportban négy-négy állat adatait hasonlítottuk össze.
Eredmények: A H4R-KO egerek perifériás vérében az NK-sejtek és a CD3+/CD4–/CD8– T-lymphocyták százalékos aránya szignifikánsan magasabb (p=0,05; p=0,04), mint a vad genotípusú kontrollcsoportéban, ugyanakkor az IL2R-t expresszáló, aktivált Tc-sejtek százalékos aránya szignifikánsan alacsonyabb (p=0,009). A csontvelőben a CD3+/CD4+ Th-sejt-populáció aránya szignifikánsan emelkedett (p=0,04) értéket mutatott a H4R-KO állatokban, míg a gdTCR+ T-sejtek aránya szignifikánsan alacsonyabb volt (p=0,001). A nagy repopulációs képességű haemopoeticus prekurzorsejtek (STR- és LTR-populáció) arányában nem mutattunk ki különbséget. A CD117+ hízósejtek és a CD11b+ myeloid sejtek aránya szignifikánsan alacsonyabb a H4R-KO csoportban (p=0,003; p=0,03). A thymuson belül az érett T-sejt-szubpopulációk százalékos arányában nincs különbség, ugyanakkor a pro-T-sejtek (CD25+/CD3–/ CD4–/CD8–; CD44+/CD25+; CD44+/CD117+/CD3–; intracelluláris CD3+) és a tripla pozitív késői pre-T-sejtek (CD25–/CD3+/CD4+/CD8+) százalékos aránya szignifikánsan magasabb a H4R-KO csoportban. A T-sejt-repertoár kialakulásában jelentős szerepet játszik a saját MHC-hez kötött, saját peptideket bemutató APC-k által indukált apoptózis. Vizsgálataink szerint a H4R-KO állatok thymusában a CD95L+ sejtek százalékos aránya szignifikánsan magasabb, mint a vad genotípusú csoportéban (p=0,02). A CD11chigh-pozitivitással jellemzett dendritikus sejtek aránya a H4R-KO csoportban szignifikánsan alacsonyabb (p=0,037). A CD80 és a CD86 kostimulációs molekulák expressziója is alacsonyabb mértékű a H4R-hiányos állatokban, habár a különbség statisztikai analízissel csak a CD80 esetében szignifikáns (p=0,04).
A lépsejtek intracelluláris HDC- és hisztamintartalma nem különbözött, ugyanakkor a 2-es típusú hisztaminreceptorok expressziójának mértéke szignifikánsan alacsonyabb a H4R- KO csoportban.
Összefoglalás: Eredményeink arra engednek következtetni, hogy a 4-es típusú hisztaminreceptoron keresztül kifejtett hisztaminhatás hiánya befolyásolja a haemopoeticus differenciálódás folyamatát. Még további vizsgálatokat igényel annak eldöntése, hogy a T-sejt-fejlődésben tapasztalt eltérések hátterében a hisztamin közvetlenül T-sejtekre gyakorolt hatása vagy a szelekció folyamatában szerepet játszó thymussejtekre (dendritikus sejtekre, epithelsejtekre, macrophagokra) kifejtett hatása játszik-e döntő szerepet.


Is there any influence of the absence of H4-receptor on hemopoiesis: comparison of hemopoietic cells of H4-receptor knockout and wild type mice
Hemopoiesis is regulated by different factors e.g. hemopoietic growth factors, chemokines, cytokines and different low molecular weight substances, like histamine. The effect of histamine on various cell types is markedly dependent on the types of histamine receptors expressed on target cells.
Hemopoietic cells express H1-, H2- and H4-receptors on their surface.
The aim of this study was to compare the percentage of leukocyte populations (T-, B-, NK-, Th-, Tc- and gdTCR+ cells) in the peripheral blood as well as to make a comparison between mature and undifferentiated hemopoietic cell types (T-, B-, NK-, Th-, Tc- and gdTCR+ cells; CD11b+ cells; Ter119+ cells; CD34–/Lin–/CD117+/Sca1+ and CD34+/ Lin–/CD117+/Sca1+ cells) in the bone marrow and to detect the T-cell precursors in thymus of H4R-knockout and wild type mice. The expression of H1- and H2-receptors and the intracellular histidine decarboxylase and histamine content of the spleen cells were also investigated. All measurements were performed by flow cytometry.
Methods: we used thee and four color flow cytometric staining methods for the detection of different cell types. Fluorescence intensity values were used for comparison of H1- and H2-receptor-expression and intracellular HDC and histamine content of spleen cells in both groups.
Results: We found significantly higher percentage of NK-cells and CD3+/CD4–/CD8– T lymphocytes in the peripheral blood of H4R-KO mice compared with wild type animals (p=0.05; p=0.04), while the percentage of IL2R positive Tc-cells (CD8+/CD25+) was significantly lower (p=0.009).
In H4R-KO mice the percentage of bone marrow Th-cells (CD3+/CD4+) was elevated (p=0.04) while the percentage of gdTCR+ T-cells was decreased (p=0.001). We didn’t find any difference between the percentages of great repopulating ability hemopoietic precursors (LTR=CD34–/Lin–/ CD117+/Sca1+ and STR= CD34+/Lin–/CD117+/Sca1+ cells). In contrast, the percentages of CD11b+ myeloid cells and CD117+ mast cells were significant lower in the H4R-KO group (p=0.03; p=0.003).
We found significantly higher percentages of pro T-cells (CD25+/CD3–/CD4–/CD8–; CD44+/CD25+; CD44+/CD117+/ CD3–; intracellular CD3+) and triple positive late pre T-cells (CD25–/CD3+/CD4+/CD8+) in the thymus in H4R-KO animals, but there weren’t any differences between the percentage of mature T-cell subsets. Apoptosis induced by interactions involving TCR on thymocytes and self-peptide MHC complexes on thymic stroma are known to play a critical role in the development of T-cell repertoir. In H4R-KO mice the percentage of thymic CD95L+ cells was elevated (p=0.02). On the other hand the percentage of CD11chigh+ dendritic cells decreased significantly (p=0.037) in H4R free animals. Expression of CD80 and CD86 costimulatory molecules on the surface of thymic cells was lower in H4R-KO mice, but using Student’s t-test this difference proved to be significant only in the case of CD80 (p=0.04).
The intracellular histidine decarboxylase and histamine content of spleen cells didn’t differ but the cell surface expression of H2-receptor decreased significantly in the H4R-knockout mice.
Conclusion: Our results suggest that the absence of the effect of histamine through H4 receptor has influence on hemopoietic differentiation. It is very difficult to decide that detected differences are caused by the direct effect of histamine on T-cells or on the thymic stroma cells (epithel cells or bone marrow derived dendritic cells and macrophages) involved in thymic selection.
 


76. A HLA-G polimorfizmus összefüggése a habituális vetélés patológiájával (P31)

Pénzes Mária1, Garaczi Krisztina1, Rajczy Katalin1, Padányi Ágnes1, Kotlán Beatrix1, Réti Mariann3, Fülöp Vilmos2, Gyódi Éva1, Petrányi Győző1
1Országos Gyógyintézeti Központ Hematológiai és Immunológiai Intézete; 2Országos Gyógyintézeti Központ Szülészeti és Nőgyógyászati Osztálya, 3Szent László Kórház, Budapest

Célkitűzés:
A habituális vetélések (RSA) számos paraméterrel állhatnak összefüggésben. A HLA-G polimorfizmusnak az anya-magzat kapcsolatban betöltött szerepének tisztázására a habituális vetélés miatt vizsgált és a termékeny párok HLA-G allélmegoszlását hasonlítottuk össze.
Anyag és módszer: Intézetünkben 110 olyan párt vizsgáltunk, akik kórtörténetében 2–7 spontán vetélés fordult elő. A mindenre kiterjedő kivizsgálási protokoll alapján elkülöníthetőek a bizonytalan esetek az alloimmun eredetű RSA-tól. Kontrollként fertilis – legalább egygyermekes – párok és családos személyek szerepeltek (n=114). A HLA-A-, -B- és -C-tipizálást szerológiai módszerrel [standard NIH micro-lymphocytotoxicity method (NIH)], míg a HLA-DRB1 és -DQB1 allélek kis felbontású kimutatását molekuláris módszerrel végeztük. Az ismert HLA-G allélek közül hetet (G*01011, 01012, 01013, 0103, 0104 and 0105N), valamint a 14 bp deletiós polimorfizmust tudtuk a használt PCR-RFLP és PCR-SSP technikával kimutatni, amelyekhez a HLA-G gén 2., 3., valamint 8. exonját vizsgáltuk. Az újabban leírt G*0106 allél a G*01012 alléltól csak a 4. exon vizsgálatával különíthető el; a módszer beállítása folyamatban van. Az allélgyakoriságokat c2-teszttel hasonlítottuk össze, szükség esetén Yates-korrekciót alkalmazva.
Eredmények: A HLA-G allélek eloszlásában nem találtunk szignifikáns eltérést a kontroll- és a betegcsoport között, bár az érintett nők nagyobb százalékában (40 vs. 33) tudtuk a HLA-G*01012 allélt kimutatni (ebből elkülöníthető az irodalomban betegségasszociáltnak leírt G*0106 allél). A 8. exonban a 14 bp beékelődésének vagy hiányának előfordulási aránya eltért a normális és a betegmintákban.
A különböző tanulmányokban kapott ellentmondó eredmények egyik magyarázata az, hogy az alloimmun hátterű eseteket a többi vetélőtől elkülönítő kiválasztási szempontok – és ezáltal a csoportok homogenitása – lényegesen eltérhet az egyes munkacsoportok esetén.
 


HLA-G polymorphism associates with the pathology of recurrent spontaneous abortion
Cause of recurrent spontaneous abortion (RSA) is associated with numerous factors. To evaluate the role of HLA-G polymorphism in maternal-fetal interactions, HLA-G allele distribution of RSA couples and fertile persons were compared.
One hundred and ten couples with primary recurrent spontaneous abortions characterized by 2–7 miscarriages were investigated in our Institute. On the basis of a well-designed diagnostic protocol couples with RSA of alloimmune origin (n=83) can be separated from the ambiguous cases (n=27). As controls fertile couples and individuals with family (n=114) were tested.
HLA-A, -B and -C typing was performed by the standard NIH micro-lymphocitotoxicity method (NIH). HLA-DRB1 and -DQB1 alleles were determined by low resolution molecular technique.
HLA-G alleles were detected by PCR-RFLP and PCR-SSP technique: with the used technique 7 (G*01011, 01012, 01013, 0103, 0104 and 0105N) alleles and the 14 bp deletion polymorphism were detectable. The recently described G*0106 allele is distinguishable from the G*01012 on the basis of a polymorphism on the exon 4 (detection is under process).
Allele frequencies were compared by c2-test, using Yates correction as needed.
No statistically significant differences were observed in the distribution of HLA-G alleles between controls and RSA couples, however, in 40% of the RSA women the HLA-G*01012 allele was detectable (which group involves the G*0106 alleles as well) compared to 33% of the control women. Distribution of the 14-bp insertion/deletion in exon 8 was different between normal and RSA samples.
The contradictory results of different studies could be explained by differences in the selection criteria distinguishing cases with alloimmune background from those with non-immunological causes or with autoimmune symptoms as well.
 


77. Az N-terminálisnál lévő kazein-kináz 1 motívum szerepe a transzmembrán-TNF szubcelluláris lokalizációjában és a szolúbilis TNF képződésében (E22)

Pócsik Éva1, Haraszti Bea1, Scherübl Christoph2, Balázs Annamária1, Horváth Gábor3, Szöllősi János3, Männel Daniela2
1Országos Gyógyintézeti Központ, Budapest; 2Institute of Immunology, University of Regensburg, Németország; 3Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet
 
A TNF-molekula egy 76 aminosavat tartalmazó preszekvenciát hordozó, úgynevezett II. típusú transzmembrán prekurzormolekula formájában (tmTNF) szintetizálódik; ebből az extracellulláris rész enzimatikus hasításával képződik az érett, szolúbilis forma. A molekula N-terminálisánál lévő – Ser–72-Glu–73-Thr–74-Ser–75 – szekvenciáról a közelmúltban derült ki, hogy kazein-kináz 1 (CK1) foszforilációs motívum, amelynek biológiai szerepe nem ismert pontosan.
Jelen munkánkban a CK1 motívum szerepét vizsgáltuk a humán TNF sejtfelszíni kifejeződésére, sejten belüli lokalizációjára és a szolúbilis, érett forma képződésére transzfektált L929, egér TNFRI/RII, HeLa és 293T-sejtekben, FACS-analízis, fluoreszcens mikroszkópia, ELISA, Western blot segítségével. A CK1 motívum deletiójának hatását összehasonlítottuk a normális TNF [wtTNF/wtTNF
D(–75)–(–72)], valamint a hasításnak ellenálló formájával transzfektált sejteken [TNFD1–12/TNFD1–12, D(–75)–(–72)].
Eredményeink szerint a CK1-motívum deletiója megváltoztatta a wtTNF és a TNF
D1–12 sejtfelszíni és szubcelluláris eloszlását. A CK1-deletio hatására [wtTNFD(–75)–(–72)] a transzfektált sejteken nőtt a TNF sejtfelszíni kifejeződése, vesztett intenzitásából a Golgi-transz-Golgi festődés, a wtTNF gén-jével transzfektált sejtekhez képest. Különösen megnőtt a sejtfelszíni TNF kifejeződése a CK1-deletio hatására, a hasításnak ellenálló TNF-forma esetében (TNFD1–12, D(–75)–(–72)), miközben megszűnt a perinukleáris Golgi-festődés. A deletio hatására a szubcelluláris lokalizációban észlelt változásokkal párhuzamosan emelkedett a termelt szolúbilis TNF mennyisége mind a normális, mind a hasításnak ellenálló TNF esetében. Eredményeink arra utalnak, hogy a tmTNF CK1-motívuma fontos szabályozószerepet tölthet be a molekula transzportjában, az érett forma hasításában.
Támogatás: (OTKA T 025865, OTKA T 046633).
 


The casein kinase 1 motif at the intracellular N-terminus regulates subcellular localization and shedding of TNF
The precursor form of TNF is a type II transmembrane protein (tmTNF) that contains a presequence consisting of 76 amino acids. The – Ser–72-Glu–73-Thr–74-Ser–75 – sequence nearby to the cytoplasmic N terminus has been identified as a casein kinase 1 (CK1) motif recently. The biological role of CK1 motif of pre-TNF is not fully understood.
In the present study, we investigated the role of CK1 motif of human TNF in cell surface expression, subcellular localization, and release of soluble TNF in transfected L929, TNFRI–/RII–, HeLa-, and 293T-cells. Intracellular and cell surface expression of D(–75)–(–72) deletion variants of wild type (wtTNF) and non-cleavable (TNFD1–12) TNF [wtTNFD(–75)–(–72), TNFD1–12, D(–75)–(–72)] was detected by FACS and fluorescent µscopy, respectively. Soluble TNF levels were measured by ELISA. Deletion of CK1 motif resulted in an altered expression pattern of wtTNF and TNFD1–12 in transfected L929 and TNFRI–/RII– cells. While cell surface expression of TNF was increased, Golgi- and endosome-like localization was less characteristic in cells transfected with the gene encoding for wtTNFD(–75)–(–72) than in cells transfected with the gene of wtTNF. A fulminate increase in cell surface TNF expression, and lack of Golgi-like perinuclear TNF staining was evident in TNFD1–12, D(–75)–(–72) expressing cells compared to the cells expressing TNFD1–12. Alterations in the subcellular localization of wtTNFD(–75)–(–72) and TNFD1–12, D(–75)–(–72) compared to wtTNF and TNFD1–12 were associated with an increase in release of soluble TNF. Our results show that the CK1 motif of tmTNF regulates subcellular localization and cleavage of the molecule.
OTKA Grants No. T 025865 and T 046633).
 


78. Újabb érzékenyítő tényezők feltérképezése coeliakiában (P44)

Pozsonyi Éva1, Uherkovichné Paál Mária2, Varga Levente3, Dobos Ágota1, Kilián Katalin1, Rajczy Katalin1
1
Országos Gyógyintézeti Központ, Budapest; 2Országos Vérellátó Szolgálat, 3Kerpel-Fronius Gyermekkórház, Pécs

Célkitűzés:
a 13. IHWS (Nemzetközi Hisztokompatibilitási Workshop) Coeliakia Munkacsoportja a – betegséggel ismerten összefüggő – HLA-DQ-t kódoló gén mellett a HLA-komplexben található újabb érzékenyítő gének azonosítását tűzte ki célul. A coeliakia becsült előfordulása Magyarországon is 1/100, a diagnosztizált esetek csak a jéghegy csúcsát jelzik. A munkacsoporthoz csatlakozás célja az érzékenyítő gének kimutatása és az ezen alapuló diagnosztika beállítása volt.
Anyag és módszer: Önkéntes jelenkezőket toboroztunk a betegek, családtagjaik és a betegekkel HLA-egyező egészséges személyek körében. Pécsett – ahol a coeliakiás gyermekek gondozására 1976-ban alakult központ – 25 család 72 tagját, a Budapesten lévő immunológiai ambulancián keresztül 14 felnőtt beteget és 64 kontrollt vizsgáltunk. A diagnózis az ESPGAN/ESPGHAN kritériumrendszer alapján történt. Minden személyt tipizáltunk szerológiai, illetve molekuláris módszerrel, legalább a HLA-A, -B, DQA1, DQB1 és DRB1 locusokra. Az IHWG MHC mikroszatellita panelje 12 locusból állt.
Eredmények és következtetések: A magyar betegek és hozzátartozóik allélgyakorisága hasonló volt az IHWS munkacsoportja keretén belül vizsgált teljes (beteg és hozzátartozói) populációéhoz, az alábbi allélek gyakori előfordulása alapján: DR3, DR7, DQ2, D6s2223/177, D6s2239/116, MIB*361, TNFd* 131,135,137. A HLA-ban teljesen azonos egészséges/beteg testvérpárok között a gondozás során további 1/8 esetben igazolták a betegséget. Összesen 4/72 egészségesnek tűnő családtagnál igazoltuk újonnan a betegséget. Ez az eredmény alaposabb molekuláris analízist indukálhat, vagy jelezheti a betegségnek egy rejtett állapotát, de mindenképpen indokolja ezeknek az eseteknek, illetve az érzékenyítő HLA-típust hordozó családtagoknak a szorosabb követését.
A vizsgálatokat a 13. IHWS keretében végeztük, amelynek beszámolója közlés alatt áll (Lie BA, Mora B, Boland A, Thorsby E and Mazzilli MC. Joint report from the 13. IHWS celiac disease component. In: HLA 2002. Immunobiology of the Human MHC. JA Hansen and B Dupont Eds, IHWG press, 2003.)
 


Investigation of new susceptibility factors for celiac disease
The aim of the Celiac Disease Working Group of the 13th IHWS was to identify additional predisposing genes in the HLA complex, other than those that encode the HLA-DQ molecules, with effect on disease susceptibility or resistance. CD has an estimated prevalence of 1/100 in Hungary, too. The diagnosed cases should be only the top of the disease-iceberg. Our goal was to clarify susceptibility loci and find non-invasive diagnostic with joining the study of the IHWS.
Materials and methods: Hungary has participated with recruiting volunteers among CD patients, their families and HLA DR, DQ matched controls. Twenty five families with minimum one affected child were investigated in Pecs, where a centre has existed since 1976 for the care of CD children and their relatives (25 patients and 72 first-degree relatives). In Budapest immunological centre 14 adult onset cases and 64 controls were investigated. Patients were diagnosed following the ESPGAN/ESPGHAN recommended criteria. All persons were HLA-typed at least for HLA-A, -B, DQA1, DQB1 and DRB1 loci, using serology and molecular typing. IHWG MHC microsatellite panel consisted of 12 loci.
Results and conclusions: Allele frequencies of Hungarian patients and their relatives are similar to the whole investigated WS patient/relative population in the respect of high incidence of DR3, DR7, DQ2, D6s2223/177, D6s2239/116, MIB*361, TNFd* 131, 135, 137. Our HLA identical sick-healthy sibling pairs don’t differ from each other in any marker (1/8 has proved CD during our family study). Altogether 4/72 seemingly healthy family members were identified as CD patients. This may indicate a further, more detailed molecular analysis, or may indicate a silent disease state, and we have to follow these cases strictly.
The study has been carried out during the 13. IHWS and the report is under press: Lie BA, Mora B, Boland A, Thorsby E and Mazzilli MC. Joint report from the 13. IHWS celiac disease component. In: Hansen JA, Dupont B (eds.) HLA 2002. Immunobiology of the Human MHC. IHWG press, 2003.
 


79. Rekombináns ellenanyagok variábilis régióinak kicserélése megaprimingtechnikával (P42)

Prechl József1, 2, Erdei Anna1, 2, Sándor Mátyás3
1
Eötvös Loránd Tudományegyetem, Immunológiai Tanszék, 2MTA-Tudományos Kutatóintézet, Immunológiai Kutatócsoport, Budapest; 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, UW-Madison, USA
Monoklonális ellenanyagok rekombináns formában való előállítása lehetőséget ad az ellenanyag-molekula különböző tulajdonságainak tervezett megváltoztatására. A változtatás jelentheti a konstans rész cseréjét (például humanizálás), az aminosavak megváltoztatását az effektorfunkciók vagy az affinitás megváltoztatása érdekében, illetve az ellenanyag-molekulákban eredetileg jelen nem lévő peptidek beépítését. Munkánk során egy T-sejt-epitópokat hordozó IgG1-molekula specificitását változtattuk meg, azzal a céllal, hogy különböző, az antigénprezentáló sejtek felszínén található receptorokat ismerjen fel. A többszörös változtatás kivitelezésének leegyszerűsítése érdekében a megaprimingmódszert adaptáltuk immunglobulin-molekulák variábilis régióira.
A rekombináns ellenanyagok vázát két eukaryota expressziós vektor adja, amelyek a könnyű-, illetve a nehézláncot kódolják (pLC-huCk és pHC-huCg1), továbbá biztosítja a sejtek puromicin- és geneticinrezisztenciáját. A különböző sejtfelszíni receptorokhoz kapcsolódó variábilis régiókat a következő hibridómákból klónoztuk: 7G6 (CD21/CD35), 2.4G2 (CD16/CD32), NLDC145 (CD205), FGK45 (CD40). A PCR-reakciókhoz ismert patkány-Ig-vázszekvenciák alapján tervezett oligonukleotid-készletet használtunk, majd meghatároztuk az optimálisan működő oligonukleotid-párok szekvenciáját.
A megaprimingmódszer lényege, hogy restrikciós enzimek használata nélkül inszertálhatók, deletálhatók, illetve cserélhetők le DNS-szakaszok. A 310–350 bp hosszúságú variábilis régiók (VL, VH) cseréjéhez olyan oligonukleotidokat terveztünk, amelyekből 21 bp a VL/VH régiók 5’ és 3’ végével, 21 bp pedig az Ig-szignálpeptid 3’ vagy a g1/k láncok 5’ végével azonos. Templátként a fenti PCR-reakciók termékeit vagy a klónozóvektorokat használtuk. A módosító PCR terméke tehát egy olyan VL/VH régió, amely az expressziós vektorban található szignál/konstans részekkel megegyező, túllógó végeket tartalmaz. A megaprimingreakció során az eredeti VL/VH régiókat tartalmazó expressziós vektorhoz adtuk a módosító PCR-terméket, ehhez Pfu-polimeráz segítségével hozzákapcsoltuk a teljes vektorszekvenciát. A reakció végén az eredeti vektort metilációfüggő endonukleázzal (DpnI) emésztettük, a módosított expressziós vektort baktériumba transzformáltuk. A VL/VH reakciók cseréje átlagosan 50%-os hatékonysággal működött, sikerült minden fenti variábilis régiót beépítenünk.
Az irányított mutagenezishez kidolgozott megapriming- technika tehát alkalmas a 310–350 bázispárnyi immunoglobulin-variábilis régiók egyszerű és gyors beépítésére Ig-expressziós kazettákba.
 


Replacement of variable regions of recombinant antibodies by megapriming
Generation of monoclonal antibodies in a recombinant form provides the ability to engineer the molecule. Antibody engineering includes changing of the constant region (e.g. humanization), mutating amino acids with the purpose of influencing effector functions or affinity, or fusion of exogenous peptides. We set out to give an IgG1 antibody, carrying fused T-cell epitopes, various specificities so that it can bind to receptors on antigen presenting cells. In order to facilitate the multiple replacement reaction we adapted the megapriming technique for immunoglobulins’ variable regions.
The backbone of our IgG1 molecule is provided by two expression vectors: pLC-huCk and pHC-huCg1 coding for the light and heavy chains, respectively. Variable regions capable of binding to various cell surface receptors were cloned from the following hybridomas: 7G6 (CD21/CD35), 2.4G2 (CD16/CD32), NLDC145 (CD205), FGK45 (CD40). Oligonucleotide primers for the amplification of V regions were based on known rat framework sequences. PCR products from the optimal reactions were sequenced.
Megapriming technique allows the deletion, insertion or replacement of DNA fragments without the use of restriction endonucleases. For the replacement of the 310–350 bp variable regions (VL/VH) we designed oligos that had 21 bp identity to the 5’ and 3’ ends of VL/VH, and the other 21 bp was identical to the 3’ end of the signal peptide or the 5’ end of the g1/k chains. We used PCR products or cloning vectors as templates. Products from this modifying PCR reaction are thus VL/VH regions with flanking sequences identical to the signal/constant regions in the expression vector. In the megapriming reaction these PCR products were added to the original expression vector, and Pfu polymerase was used to elongate the products based on the vector sequences. Then the original vector was digested by a methylation dependent endonuclease (DpnI) and bacteria were transformed. The efficiency of the replacement was about 50%, and all of the above-described VL/VH regions could be inserted.
The megapriming technique is thus suitable for the simple and fast insertion of Ig variable regions into expression cassettes.
 


80. Az alacsony szérumkoleszterin- és a magas C-reaktív-fehérje-szint együttesen előre jelzik a halálozást szívelégtelenségben (P23)

Prohászka Zoltán1, Jánoskuti Lívia1, Förhécz Zsolt1, Bálint Olga2, Duba Jenő2, Füst György1
1Semmelweis Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, III. Sz. Belgyógyászati Klinika és SE-MTA Anyagcsere és Atherosclerosis Kutatócsoport, 2Országos Kardiológiai Intézet, Budapest

Bevezetés: Az alacsony szérumkoleszterin-szint és a csökkent túlélési esély között kapcsolat mutatható ki krónikus szívelégtelenségben. Szívelégtelenségben szenvedő betegeken a rossz prognózis egyes gyulladásos markerek szintjének emelkedésével is kapcsolatban áll. A szérumban található lipoproteinek gátolhatják a bélcsatornából felszívódó lipopoliszacharid immunaktivációt okozó hatását.
Célkitűzés: A vizsgálat célja az emelkedett C-reaktív fehérje (CRP), valamint az alacsony szérumkoleszterin-szint és a halálozás közötti összefüggés megállapítása krónikus szívelégtelenségben szenvedőkön.
Módszerek: Vizsgálatunkba 387 krónikus szívelégtelenségben szenvedő beteget válogattunk be (medián életkor: 58 év). A betegeket átlagosan öt évig követtük. A klinikai adatok rögzítését követően meghatározástuk a szérumösszkoleszterin-szintet és a CRP-koncentrációt. Az adatokat öszszevetettük a halálozási statisztikával.
Eredmények: A magas CRP-szint szignifikáns kapcsolatban állt a halálozással [esélyhányados: 2,54; 95%-os konfidenciatartomány (KI): 1,10–5,91; p=0,029]. A CRP-szint és a halálozás közötti kapcsolat függetlennek bizonyult más tényezőktől (például: életkor, nem, testtömegindex, a szívelégtelenség súlyossága, dohányzás, hypertonia, koleszterinszint). Az alacsony koleszterinszint és a halálozás közötti kapcsolat szintén erős összefüggést mutatott, ez független volt a fenti tényezőktől (esélyhányados: 3,26; 95%-os KI: 1,42–7,50; p=0,0055). Ha az alacsony koleszterin- és a magas CRP-szinteket mint közös jellemzőt analizáltuk, még erősebb összefüggés mutatkozott a halálozással (esélyhányados: 8,26; 95%-os KI: 2,10–32,41; p=0,0026).
Megbeszélés: Eredményeink szerint a csökkent koleszterinszint és az emelkedett CRP-koncentráció erős, független jelzői a rossz prognózisnak krónikus szívelégtelenségben szenvedők esetén. A két változó között erős kapcsolatot találtunk, vagyis az alacsony koleszterin- és magas CRP-értékű betegeknek a legrosszabbak az életkilátásai. Vizsgálatunk alátámasztja azt a hipotézist, amely szerint a szérumban található lipoproteinek meg tudják fékezni a gyulladásos reakciót.
 


Decreased cholesterol level with elevated concentration of C reactive protein may predict long-term mortality in patients with severe coronary artery disease
Objectives: This study aimed to investigate joint effects of raised C-reactive protein (CRP) levels and decreased total cholesterol levels on mortality in patients with chronic heart failure (CHF).
Background: Low total cholesterol (TC) levels associate with worsened survival in CHF. Poor prognosis in CHF is linked to increased immune activation as well. Potential inhibition of immune activation by circulating lipoproteins could be a link between cholesterol and inflammatory markers.
Methods: A group of 387 patients (median age 58 years) with mild or severe HF were followed for a median of five years. Serum total cholesterol and CRP concentrations were measured at enrollment. The relationship between lipoproteins, CRP and survival was explored.
Results: High CRP concentrations were in significant association with severity of HF and predicted worsened survival in CHF patients (odds ratio 2.54, 95% CI 1.10–5.91, p=0.029). The association between CRP levels and mortality was independent of potential confounding factors such us age, body-mass index, severity of HF, smoking habits, hypertension and TC levels. The relationship between low TC levels and mortality was significant after adjustment for these variables (OR 3.26, 95% CI 1.42–7.50, p=0.0055). Furthermore, patients with increased CRP and decreased TC (joint effect) phenotype had 8.26 times higher risk (95% CI 2.10–32.41, p=0.0026) to be non-survivor than patients with low CRP/high TC.
Conclusions: High CRP levels and low TC concentrations are in joint association with worsened survival in CHF patients. Our data indicate that circulating lipoproteins may contribute to the inhibition of inflammatory reactions in HF patients.
 


81. A Magyar Csontvelődonor Regiszter bővítésének jelentősége, különös tekintettel az etnikai kisebbségek igényeire (P45)

Dobos Ágota1, Rajczy Katalin1, Gourraud Pierre-Antoine2, Pozsonyi Éva1, Padányi Ágnes1, Rásonyi Rita1, Garamszegi Mónika1, Gyódi Éva1, Petrányi Győző1, Cambon-Thomsen Anne2
1Országos Gyógyintézeti Központ, Hematológiai és Immunológiai Intézet, Budapest; 2INSERM U558 Toulouse, Franciaország
 
A különböző csontvelődonor-regiszterekben nyilvántartott nagyszámú (9 millió) donor ellenére sem minden beteg részére található megfelelő HLA-egyező csontvelődonor. Ennek oka alapvetően a HLA-régió nagymértékű polimorfizmusa; ebből következően komoly igény merül fel a bizonyos populációkban előforduló ritka haplotípusokra. Ez a tény is alátámasztja, milyen fontos minőségileg növelni a regiszterben képviselt genotípusok diverzitását. Ennek teljesítésére egyik megoldás a ritka típusokat hordozó etnikai csoportok körébe tartozó donorok toborzása. A Magyar Csontvelődonor Regiszter donorállományát etnikai összetételén alapuló összehasonlító elemzésnek vetettük alá.
Módszer: Egy nemzetközi projekt (NAS-MADO) keretein belül roma és csángó donorokkal bővült a magyar regiszter. A HLA-polimorfizmust három szinten hasonlítottuk össze: 1. allélgyakoriság-számítás, a hordozók számlálásával; 2. az egyedi HLA-fenotípus-gyakoriság, illetve -haplotípus-gyakoriság meghatározása (utóbbi maximum likelihood módszerrel, a hiányzó értékeket figyelembe véve); 3. a haplotípus-gyakoriságok segítségével analizálhatók a különbségek az egyes donort adó populációk genetikai szerkezetében.
Eredmények: A HLA-A, -B és -DR locusra vonatkozóan meghatároztuk a fenotípusos allél- és haplotípus-gyakoriságokat. A HLA-meghatározás módja és a nevezéktan fejlődése miatti adateltéréseket az analízist megelőzően korrigáltuk. Az analízis egyértelműen igazolta, hogy a vizsgált etnikai csoportok különleges haplotípusokat és további allél- és fenotípus-frekvenciabeli eltéréseket mutattak.
A kapott eredmények alátámasztják, hogy az irányított donortoborzás az eltérő genetikai hátterű népességből fokozza a donorregiszter diverzitását. A regiszter fejlesztésének tervezésekor hasznos lehet a kiterjedt populációgenetikai és statisztikai analízis.
A munka a MADO EU-konzorcium keretében történt (www.euromado.org).
Részlegesen támogatta az ETT 486-09/2003.

 


The importance of inclusion of ethnic minorities to the hematopoietic stem cell donor registry in Hungary
Despite of the huge number of unrelated haematopoietic stem cell donors represented in various registries some patients lack a suitable unrelated HLA matched donor. This is essentially due to the high polymorphism of HLA region, therefore, there is demand for rare haplotypes existing in certain population. This fact underlines how important is to increase qualitatively the global diversity of the HLA genotypes in the Registries. Recruitment of certain ethnic minorities has been implemented to deal with such issue. We launched a comparative analysis of the members of the Hungarian Bone Marrow Donor Registry (HBMDR) based on the ethnic distribution (Hungarian, Gypsies, Csangos, etc).
Method: HBMDR was expanded recently in the framework of the NAS-MADO project with donors of Gypsy and Chango origin. HLA polymorphism was studied at three levels: 1. Allele frequency was computed throughout the carrier frequency estimated by counting. 2. Individual HLA phenotype frequency can be useful to compare and were also used to perform haplotype frequency estimation by maximum likelihood implementing missing values and HLA nomenclature handling. 3. Haplotype frequencies allow us to analyse differences from the point of view of the genetic structures of the populations where donors are recruited.
Results: HLA frequency at phenotype allelic and haplotype level are available for HLA-A, -B and -DR loci. Formatting the data for population analysis underline the improvement of HLA typing in such context. As expected, ethnic minorities shows particular haplotypes and subsequent differences in allelic and phenotype frequencies.
Discussion: These theoretical findings suggest that donors’ selection process from minorities increase the registry HLA diversity. More population genetics and statistical analysis would benefit the Registries management.
Performed within the MADO EU consortium (www.euromado.org)
Partly sponsored by National Health Research grant ETT 486-09/2003.
 


82. A dendritikus sejtek szerepe a T-sejtes immunválasz szabályozásában (R2)

Rajnavölgyi Éva
Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum, Immunológiai Intézet
 
A dendritikus sejtek kis számú, heterogén és vándorló populációja különböző immunsejtekkel teremthet kapcsolatot, és fontos szerepet játszik azok koordinált működésének szabályozásában. A dendritikus sejtek egyedi sajátsága az elsődleges antigénspecifikus T-lymphocyta-aktiváció elindítása és polarizálása. Eredetüktől és aktivációs állapotuktól függően eltérő szövetekben telepednek le és a környezeti hatásoktól függően különböző funkcionális aktivitással rendelkeznek. A myeloid dendritikus sejtek elsősorban a baktériumok felismerésére specializálódtak, és bakteriális termékek hatására Toll-receptoraik (TLR) révén aktiválhatók; ez gyulladási citokinek termeléséhez vezet. A plasmacytoid dendritikus sejtek elsősorban a virális termékek felismerésére és megkötésére képes Toll-receptorokkal rendelkeznek, és ennek hatására nagy mennyiségű I. típusú interferont termelnek. Az aktivációs jelek természetétől és erősségétől függően mindkét típus képes az antigénspecifikus immunválasz elindítására, vagy a tolerancia kiváltására és fenntartására. A veleszületett és szerzett immunitás között kapcsolatot teremtve a dendritikus sejtek a CD1-molekulák által korlátozott, szabályozófunkcióval rendelkező természetes ölő T-lymphocyták (NKT) aktiválására is képesek. A humán CD1-fehérjék a dendritikus sejtek különböző típusaiban eltérően fejeződnek ki, és különböző módosított lipidek bemutatására képesek. Aktiváció hatására a természetes ölő T-sejtek az effektor-, memóriasejtekhez hasonlóan gyors citokintermeléssel válaszolnak, és képesek a dendritikus sejtek különböző irányú kondicionálására. Az utoreaktív NKT-sejtek nagy mennyiségű IL-4 citokint termelnek, és ezáltal elősegítik a Th2-választ, míg a patogének által kiváltott NKT-sejt-aktiváció nagy mennyiségű IFN-g-termeléshez, és a Th1-sejtek által közvetített gyulladásos válasz kialakulásához vezet. Mivel az NKT-sejtek stimulációja nem igényli a dendritikus sejtek előzetes aktivációját, a folyamat a perifériás nem lymphoid szövetekben, az antigénspecifikus T-lymphocyta-aktiváció előtt is végbemehet. Eredményeink alapján arra következtetünk, hogy a dendritikus sejteknek az NKT-sejtekkel kialakított kapcsolata függ a szöveti környezet lipidegyensúlyától, ez pedig a megváltozott citokinegyensúly következtében az immunválasz polarizálására képes regulációs folyamatokat indíthat el.
 


T lymphocyte responses regulated by dendritic cells
Dendritic cells (DC) represent a rare, heterogeneous and mobile population of cells, which contact various immune cells and regulate their concerted action. The unique feature of DC is their potential to prime and polarize antigen-specific T lymphocyte activation. Depending on their origin and activation state DC reside in various tissues and acquire distinct functional activitites modulated by environmental stimuli. Myeloid DC are specialized for the recognition and internalization of bacteria and can be activated by bacterial compounds through their Toll like receptors (TLR) to produce inflammatory cytokines. Plasmacytoid DC primarily recognize, bind and get activated by TLR specific for viral products, which results in the production of type I interferons. Depending on the nature and strength of the activation signals both DC subsets may induce antigen-specific immune responses or play a role in the induction and maintenance of tolerance. As a link between innate and acquired immune responses DC are also able to activate CD1-restricted Natural Killer T-lymphocytes (NKT) with regulatory potential. Human CD1 proteins are differentially expressed by various DC types and are involved in the presentation of modified lipids. Upon activation NKT-cells act as effector/ memory cells by the secretion of high amounts of cytokines which depending on their nature are able to condition DC. Autoreactive NKT-cells produce IL-4 and promote Th2 responses, while pathogen induced NKT-cells secrete IFNg and support Th1 mediated inflammation. Since the stimulation of NKT-cells does not depend on DC activation, it may occur in peripheral non-lymphoid tissues preceding antigen-specific T-lymphocyte priming occuring in lymphoid tissues. We suggest that the mutual interaction of DC- with NKT-cells is connected to lipid homeostasis of the tissue environment and may initiate regulatory pathways, which are able to polarize immune responses by modifying the cytokine milieu of the DC-T-cell synapse.
 


83. A CD150-szignálok antiinflammatoricus hatásúak a CD40-nel aktivált monocytasejtekből származó dendritikus sejtekben (E5)

Réthi Bence1, Gogolák Péter1, Erdős Erika1, Rajnavölgyi Éva1, Cox Terhorst2, Lányi Árpád1
1Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum, Immunológiai Intézet; 2Division of Immunology Beth Israel Deaconess Medical Center Boston, USA
 
A SLAM (signaling lymphocyte activation molecule, CD150) homoasszociációra képes receptor a T- és B-lymphocyták, a macrophagok és a dendritikus sejtek (DS) felszínén. SLAM-specifikus ellenanyaggal való keresztkötése kostimuláló hatású, ez a T-sejtek intenzívebb proliferációját és IFN-g-termelését eredményezi, és fokozza a CD40-ligandum által aktivált, monocyta eredetű dendritikus sejtek IL-12-szekrécióját. Ezek a megfigyelések azt sugallják, hogy az ellenanyaggal kiváltott, SLAM közvetítette szignálok a T-lymphocyták TH1 irányú polarizációját segítik elő. Mivel in vivo a SLAM homoasszociáció útján aktiválódik, valószínűsíthető, hogy az ellenanyaggal indukált hatások a SLAM-receptor önmagával való kölcsönhatásának gátlásával jönnek létre. Kísérleteink során a SLAM-SLAM interakció dendritikus sejtek működésére gyakorolt hatásait vizsgáltuk. A monocyta eredetű dendritikus sejteket olyan fibroblast-sejtvonalakkal aktiváltuk, amelyek vagy csak CD40-ligandumot expresszálnak, vagy a CD40-ligandum mellett a SLAM-ot is. A dendritikus sejtek CD40-ligandummal történő aktivációját követően, homoasszociáció hatására a SLAM-szignál nem befolyásolta a CD83 DS-aktivációs marker és a CD80, illetve CD86 kostimuláló receptorok megjelenését. A HLA-DQ szabályozását sem befolyásolta a SLAM-szignál. Ellentétben azokkal a korábbi eredményekkel, ahol a SLAM-ot ellenanyaggal stimulálták, a receptor önmagával való kölcsönhatása nagymértékben csökkentette a CD40 által kiváltott IL-12-termelést, de nem volt szignifikáns hatása az IL-10 felszabadulására, amely a SLAM-specifikus IPO-3 ellenanyaggal blokkolható volt. Emellett a SLAM-ot expresszáló fibroblastokhoz hasonlóan, a SLAM-ot kifejező Jurkat-T-sejtvonal is gátolta az IL-12-termelést. Adatainkból következik, hogy a T- és B-sejt-kommunikáció mellett a SLAM szerepet játszik a dendritikus sejtek által közvetített Th1/Th2 irányú polarizációban. Eredményeink összhangban állnak a SAP- és SLAM-deficiens egerekben tett megfigyelésekkel is.

CD150 (SLAM) induces anti-inflammatory signals in CD40 activated, monocyte derived dendritic cells
SLAM (CD150, signaling lymphocyte activation molecule) is a self-ligand cell surface receptor expressed in activated T- and B-lymphocytes, macrophages and dendritic cells (DC).
Ligation of SLAM by SLAM-specific antibodies triggers co-stimulatory signals that result in increased proliferation and IFN-g secretion in T-cells, and elevated IL-12 production in CD40 ligand activated, monocyte derived dendritic cells. These findings suggest that antibody induced SLAM-mediated signals promote Th1 polarization of T-cells. As SLAM is a self ligand, antibody induced stimuli can result from the inhibition of self-association of the SLAM receptor. In these studies, we investigated the effect of the more physiological SLAM/SLAM interaction on dendritic cell function. Monocyte derived DCs were activated by fibroblast cell lines expressing CD40 ligand alone, or together with SLAM. SLAM signaling induced by homophylic interactions did not influence the upregulation of DC activation marker CD83, or the induction of co-stimulatory receptors CD80 and CD86 following CD40 ligand induced DC activation. Upregulation of HLA-DQ was also independent of SLAM signaling. In contrast to earlier results obtained by antibody induced SLAM ligation, SLAM self-association resulted in dramatic inhibition of CD40 induced IL-12 production without significant effect on IL-10 release. This effect was abrogated by the addition of SLAM-specific antibody IPO-3. Moreover, a SLAM-expressing Jurkat T-cell line inhibited IL-12 release similarly to SLAM-expressing fibroblasts. These data suggest that SLAM mediates anti-inflammatory signals in DC and inhibit Th1 polarization, in line with results obtained with Th1-prone mice deficient for SLAM-associated protein (SAP). Our data also indicate that, besides T-cell/B-cell communication, SLAM may be involved in the initial DC mediated instruction processes that govern Th1/Th2 polarization.
 


84. A C-reaktív fehérje és a C1q kölcsönhatásának elemzése: a kötődés térképezése és a C1-aktiváció vizsgálata (E17)

Róvó Zita1, Bíró Adrienn1, Cervenak László1, 2, Varga Lilian1, Füst György1, 2, Potempa Larry A.3, Arlaud Gérard J.4, Prohászka Zoltán1, 2
1Semmelweis Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, III. Sz. Belgyógyászati Klinika, 2Semmelweis Egyetem-MTA, Anyagcsere és Atherosclerosis Kutatócsoport, Budapest; 3ImmTech, Vernon Hills, IL, USA; 4Institute de Biologie Structurale Jean Pierre Ebel, Grenoble, Franciaország

Bevezetés:
A C-reaktív fehérje (CRP) klasszikus akutfázis-fehérje; alapvető biológiai feladata a gyulladás fékezése, a károsodott sejt- és szöveti alkotórészek eltüntetése, a gyó- gyuláshoz vezető folyamatok beindítása. Korábbi eredményeink szerint a CRP módosult formája ligandkötés nélkül is jelentős C1q-kötő képességgel és a komplementkaszkád aktivációjával jellemezhető.
Célkitűzés: Munkacsoportunk célja a módosított CRP- (mCRP-) molekula és a C1q közötti kapcsolat pontos feltérképezése és a C1-komplex aktivációjának vizsgálata volt.
Módszerek: Kísérleteinkhez felszíni plazmonrezonanciás (BIACORE) és ELISA-rendszert, illetve C1-aktivációs tesztet használtunk, antigénként rekombináns úton előállított módosított CRP-t (Cr-mCRP), urea-mCRP-t (u-mCRP) és tisztított C1q-komplexet, valamint hasított fragmenseit (feji, illetve farokrégió) használtunk. A BIACORE kísérletek során CM5 szenzorcsip karboximetil-dextrán mátrix felszínéhez aminkötéssel immobilizáltuk a C1q-t, és mértük az mCRP-kötődés kinetikáját.
Eredményeink szerint a CRP módosított formája és a C1q-komponens közötti interakció 1400 RU válaszdifferenciát adott 100 nM-os mCRP-koncentráció mellett. Az asszociációs és disszociációs sebességállandókat 1:1 Langmuir-kötődési modell (A+B -AB, BIAevaluation 3.1) segítségével határoztuk meg. A kötődés disszociációs konstansa KD=0,375 nM. ELISA-kísérleteink szerint a Cr-mCRP- és a C1q-molekulák kölcsönhatása több ponton is kialakul, részt vesz benne a C1q feji és farokdoménje is. A C1-aktivációs teszttel kimutattuk, hogy a natív CRP 9%-os, az ureával módosított CRP 21%-os, míg a rekombináns úton előállított mCRP 47%-os C1-aktivációt okozott. További megfigyelésünk szerint a Cr-mCRP képes a H-faktor kötésére is.
Következtetés: Eredményeink arra utalnak, hogy a CRP natív, pentamer struktúrájának felbomlása olyan molekulát eredményez, amely erősen és több ponton képes megkötni a komplementkaszkád klasszikus reakcióútjának első komponensét. A módosított CRP C1q-kötése C1-aktivációt is eredményez. A CRP natív, ligandkötés nélküli állapotban nem köt C1q-t és nem aktivál C1-et. A natív és módosított CRP-molekulák közös tulajdonsága az erős H-faktor-kötés, ami a terminális reakcióút fékezéséért és az opszonizációs folyamatok előtérbe kerüléséért lehet felelős.
 


Studies on the interaction between C-reactive protein and C1q: location of binding sites and measurement of C1 activation
Introduction: C-reactive protein (CRP) is a classic acute phase reactant. Its basic features are the control of inflammation, the stimulation of clearance of damaged cell and tissue components, and the initiation of repair functions. Our previous results have indicated that a modified form of CRP treated with citraconic anhydride is able to bind C1q and to trigger activation of the classical complement pathway.
The aim of the present study was to locate the site(s) of C1q responsible for Cr-mCRP binding and to investigate C1 activation by different forms of CRP.
Methods: Binding studies were carried out using surface plasmon resonance spectroscopy and ELISA assays. For BIAcore assays, C1q was immobilized on the carboxymethylated dextran surface of CM5 sensor chip using the amine coupling chemistry, and the kinetics of CRP binding were monitored. C1 activation was measured using C1 reconstituted from purified C1q, C1r and C1s. Native CRP as well as urea-treated (u-mCRP) and recombinant modified CRP (Cr-mCRP) were used as targets.
Results: Binding of mCRP was measured over 1400 resonance units (RU) of immobilized C1q. The association and dissociation constants were determined by global fitting of the data using the 1:1 Langmuir binding model (A+B-AB, BIA evaluation 3.1). Cr-mCRP was shown to bind to C1q with a KD value of 0.38 nM. In the ELISA experiments, interaction between C1q and mCRP was found to involve multiple binding sites located in the “head” and “tail” domains of C1q. C1 activation assays indicated that native CRP only induced weak activation (9%), whereas urea-modified and recombinant mCRP were more potent activators (21% and 47% activation, respectively). A strong binding to factor H was also observed in the case of modified CRP.
Conclusion: Our results indicate that the loss of pentameric symmetry observed in modified CRP correlates with the appearance of a strong ability to bind C1q at different sites, located in both the globular and tail domains. Binding of C1q to mCRP triggers efficient activation of the C1 complex. In contrast, the native, ligand-free form of CRP does not bind C1q and does not trigger C1 activation. A shared characteristic of native and modified CRP is their ability to bind factor H, a property that may be responsible for the inhibition of the terminal complement pathway and therefore the stimulation of opsonization.
 


85. A thrombosis kockázata szisztémás lupus erythematosusban (P57)

Sallai Krisztina, Nagy Eszter, Mohl Adrienn, Bodó Imre, Gergely Péter
Semmelweis Egyetem, Központi Immunológiai Laboratórium, Budapest
 
A thrombocyták membránját alkotó foszfolipidek és az ezekhez kapcsolódó glikoproteinek ellen irányuló immunválasz gyakran vezet thromboemboliás események kialakulásához. Az úgynevezett antifoszfolipid-szindróma (APS) diagnosztikai kritériumai az antifoszfolipid antitestek (aPl) jelenléte, az ismétlődő thrombosis vagy spontán vetélés. A szisztémás lupus erythematosus (SLE) autoimmun betegség, egyik jellemzője a keringő patogén autoantitestek – köztük antifoszfolipidek – jelenléte. Az SLE-hez kapcsolódó szekunder antifoszfolipid-szindróma e betegek jelentős hányadában jelentkezik, tehát az SLE-ben szenvedő betegek a thrombosis fokozott kockázatának vannak kitéve. Emellett a thrombosis kialakulását egyéb, az SLE-től független faktorok is befolyásolják. Nem ismert még, milyen mértékben járulnak hozzá ezek a hajlamosító tényezők az aPl-pozitív SLE-betegek esetében a thrombosis, ezzel a szekunder antifoszfolipid-szindróma kialakulásához.
Célunk az volt, hogy meghatározzuk az általunk vizsgált SLE-populációban a thrombosis gyakoriságát, az egyes betegekre és a populációra jellemző kockázati tényezőket, valamint azt, hogy mely faktorok rutinszerű vizsgálata segítene kiszűrni a thrombosisra hajlamos SLE-betegeket.
A vizsgálatban 53, SLE-ben szenvedő beteg vett részt. Kérdőív segítségével rögzítettük a betegek thromboemboliás kórtörténetét. Szérum-, plazma- és DNS-mintát gyűjtöttünk, majd az alábbi vizsgálatokat végeztük el: antikardiolipin, anti-b2-glikoprotein I, antiprotrombin, anti-foszfatidil-szerin antitestek, lupus antikoaguláns mérése; az V. faktor Leiden-mutációjának és a II. faktor (protrombin) G20210A mutációjának kimutatása; protein C- és protein S-szintek, antitrombin-aktivitás és aktivált protein C-rezisztencia vizsgálata; plazmahomocisztein-szint, VIII. faktor-szint, von Willebrand-faktor-antigénszint és a kollagénkötő aktivitás meghatározása.
A vizsgált 53 személy közül 12-en estek már át thromboemboliás eseményen.
Az általunk vizsgált betegcsoportban az antifoszfolipid antitestek jelenléte, az V. faktor Leiden-mutációja, és az emelkedett VIII. faktor-szint bizonyult jelentős kockázati tényezőnek. Ezek együttes jelenléte kiugróan magas thromboemboliás kockázatot jelent.
Az SLE-ben szenvedő betegek körében rendszeresen végezzük az antifoszfolipid antitestek kimutatását. Az aPl-pozitív betegek esetében érdemes tehát elvégezni a szűrést az V. faktor Leiden-mutációjára, illetve az emelkedett VIII. faktor-szintre.
 


Thrombosis risk in systemic lupus erythematosus
Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease characterized by the presence of a wide range of pathogenic autoantibodies. As phospholipids and associated glycoproteins in the platelet membrane are often targets of these antibodies, patients with SLE are at high risk for developing thromboembolic events. However, other factors not associated with SLE may influence the risk of thrombosis. An ever increasing number of factors are now associated with increased thromboembolic risk (often called thrombophilia) in the general population. The impact of these factors in SLE is currently unknown.
Aim of our study was to determine the prevalence of thromboembolic events in a patient population with SLE; identifying significant risk factors in this population and assign relative risk to these factors. And finally, determining the role of possible screening for thrombophilia in these patients.
Data from 53 patients with SLE (50 females, thr males; mean age 40.3±10.2 ys; mean duration 14.6±8.4 ys) were studied.
A detailed thromboembolic history was taken using a questionnaire. Sera, plasma and DNA samples from all patients were analyzed in the following tests: anti-cardiolipin, anti-b2-glycoprotein I, anti-prothrombin, anti-phosphatidyl-serine antibodies, lupus anticoagulant; factor V Leiden mutation and factor II G20210A mutation detection; protein C, protein S, antithrombin activity and activated protein C resistance. Plasma homocysteine, factor VIII, von Willebrand factor antigen and collagen binding activity levels were also measured.
From the 53 SLE patients 12 persons had a history of thromboembolism.
In the SLE population we studied the presence of anti-phospholipid antibodies, factor V Leiden mutation and elevated factor VIII level were found to be the thrombosis risk factors of highest importance.
The addition of these carries an extreme high risk for the development of thromboembolism.
SLE patients are routinely tested for anti-phospholipid antibodies. Screening of the patients for Leiden and prothrombin mutation and measuring factor VIII levels after positive anti-phospholipid antibody tests may be reasonable.
Patients predisposed to thromboembolism but without a history of a thromboembolic event have to be informed about their increased risk, for the case of this data can be crucial. However, we do not suggest anticoagulant treatment as prevention.
Confirming our data we propose to extend our study on a larger SLE population in the future.
 


86. A TGF-b foszfatázfüggő apoptotikus hatása humán lymphomasejtekben (E4)

Sebestyén Anna, Barna Gábor, Nagy Katalin, Paku Sándor, Kopper László
Semmelweis Egyetem, I. Sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet, Budapest

A TGF-b multifunkcionális citokin; gátolja a lymphoid sejtek proliferációját, differenciációját, s indukálja apoptózisát. Lymphomákban az endogén TGF-b-termelés ellenére a tumorsejtek folyamatos osztódása, a tumor növekedése figyelhető meg. A lymphomasejtek, a non-Hodgkin-lymphoma (NHL-) sejtvonalak esetében gyakran csökken a TGF-b-érzékenység, s a TGF-b-val (TGF-b1-gyel) szemben rezisztencia alakul ki. HT58 humán NHL-sejtekben elmarad az exogén TGF-b1-indukált proliferációgátló hatás, a TGF-b1-kezelés apoptózisindukáló hatása azonban megfigyelhető. Ezekben a lymphomasejtekben tanulmányoztuk a TGF-b időfüggő apoptotikus hatását, a Smad és protein-kináz jelátviteli út elemeit, valamint az indukált apoptózis folyamatait.
NHL-sejttenyészetekben rekombináns TGF-b1-kezelést követően vizsgáltuk az apoptotikus hatást, a mitochondrium depolarizáció folyamatait áramlási citométer, a különböző gének expresszióváltozásait pedig RT-PCR segítségével. A jelátviteli elemek (Smad-ok, foszfo-Smad2, Erk1/2, JNK, p38MAPK) expresszióját, aktivitását és lokalizációját, valamint más proapoptotikus és túlélési faktorok (Bcl-2, Blc-xL, Bid, Bax, Bad, NF-kB, foszfo-IkB) expresszióját specifikus antitestekkel Western blot és konfokális mikroszkópos technikákkal vizsgáltuk. A PP2A-foszfatáz, a MEK1-kináz és a kaszpázok aktivitását különböző inhibitorok (endhothal, okadaic acid, PD980559, Z-VAD-fmk, Z-IETD-fmk, Z-LEHD-fmk) alkalmazásával bizonyítottuk.
A Smad2-fehérje foszforilációja, sejtmagi lokalizációja, valamint a TGF-b-indukált korai gén (TIEG) expressziójának megjelenése a Smad-szignál gyors aktiválódását mutatta. A PP2A-foszfatáz aktiválódásának, az aktív foszfo-JNK- és foszfo-Erk1/2-mennyiség csökkenésének szerepét az indukált apoptózisban igazolta a specifikus PP2A-inhibitor antiapoptotikus, illetve a MEK1-inhibitor proapoptotikus hatása is. Az indukált apoptózis halálreceptor-független úton, de a kaszpáz8 és kaszpáz9 aktív részvételével, elsősorban a mitochondrialis útvonal aktiválásával zajlik. Az indukált apoptózist túlélési faktorok inaktivációja kíséri a lymphomasejtek esetében.
Kísérleteink alapján az exogén TGF-b-kezelés hatása két párhuzamos, egymással összefüggő folyamat segítségével valósul meg. Ezek: a protein-kináz által indukált túlélési faktorok gátlása, valamint az így beindítható Smad-szignál ál-tal indukált apoptotikus folyamatok aktiválódása. Mindezek alapján lehetséges, hogy a lymphomasejtek proapoptotikus faktorokkal szembeni érzékenysége helyreállítható a túlélési szignálutak aktivitásának csökkentésével.
Támogatások: OTKA (T034892), ETT (192/2000, 193/2000), FKFP (0150/2001) and Békésy foundation (118/2001).
 


Phosphatase activity dependent apoptotic effect of transforming growth factor b1 in HT58 human lymphoma cells
Transforming growth factor b1 (TGFb1), a multifunctional cytokine, has antiproliferative and/or proapoptotic effect on lymphoid cells. In lymphoid malignancies there is a continuous accumulation of tumor cells in spite of endogenous TGFb1 production. The lymphoid tumor cells, including non-Hodgkin lymphoma (NHL) cell lines are often less sensitive or insensitive to TGFb1 than normal cells. In HT58 B-cell lymphoma cell line, exogenous TGFb1 did not inhibit the proliferation however was able to induce apoptosis. In these cells we studied 1. the time dependent apoptotic effect, 2. the activity of Smad and protein kinase signals, and 3. the mechanism of induced apoptosis.
NHL-cell cultures were treated with recombinant TGFb1. The apoptotic effect and depolarization of the mitochondria was detected by flow cytometry, the different gene expression was studied by RT-PCR. The amount, the activity (Western blot) and the localization (confocal microscopy) of the signal elements (Smads, phoshpo-Smad2, Erk1/2, JNK, p38MAPK) and other proapoptotic and survival proteins (Bcl-2, Blc-xL, Bid, Bax, Bad, NFkB, phospho-IkB) were also studied. The role of PP2A phosphatase, MEK1 kinase and caspase activity was estimated by different inhibitors (endhothal, okadaic acid, PD980559, Z-VAD-fmk, Z-IETD-fmk, Z-LEHD-fmk) in vitro.
Smad2 phosphorylation, nuclear localization and the increased expression of TGFb1 induced early gene (TIEG) proved the rapid activation of Smad signal. The role of PP2A phosphatase activation followed by decreased expression of active phospho-JNK and phospho-Erk1/2 was supported by the antiapoptotic effect of PP2A inhibitors and the proapoptotic effect of specific MEK1 inhibitor. The activation of apoptosis was death receptor independent. However, both main iniciator caspases (caspase8 and 9) took part in the apoptotic mechanism using the mitochondrial pathway. This induced apoptosis was accompanied by inactivation of survival signal in lymphoma cells.
It seems that exogenous TGFb1 had double but interrelated actions on HT58-cells: 1. suppression the survival signals produced by protein kinases, which 2. allowed the Smads to induce apoptosis. Therefore, it is possible that the lost sensitivity of malignant lymphoid cells to proapoptotic regulators (such as TGFb1) could be reactivated especially by lowering the survival threshold.
The work was supported by OTKA (T034892), ETT (192/2000,193/2000), FKFP (0150/2001) and Békésy foundation (118/2001).
 


87. Hematológiai és immunológiai változások splenectomisalt és lép-autotranszplantált egerekben, kettő és nyolc hónappal a műtétek után (E29)

ifj. Sipka Sándor1, Aleksza Magdolna2, Kulcsár Andrea2, F. Tóth Ferenc1, Bráth Endre1, Fábián Ákos1, Furka István1, Mikó Irén1
Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum, 1Sebészeti Műtéttani Tanszék, 2III. Sz. Belgyógyászati Klinika, Immunológiai Laboratórium
 
Háttér és célkitűzések: A splenectomiát követő lép-autotranszplantáció a lépfunkció részleges megmentésére újonnan bevezetett sebészeti eljárás. A Furka-féle lépköténytechnikával vékony lépszeleteket ültetnek vissza a cseplesz rétegei közé. Korábbi kísérleteinkben sikeresen adaptáltuk a módszert egerekre is. Jelen vizsgálatainkban beltenyésztett egereken vizsgáltuk a lépeltávolítás és az autotranszplantáció – a léptömeg 10%-a visszaültetésének – hematológiai és immunológiai hatásait két időpontban: a műtétet követően kettő, illetve nyolc hónappal.
Módszerek: A 63 nőstény Balb/c egereket két időpontban operáltuk meg. Az első műtéti sorozatban két csoportot hoztunk létre: A: lépirtott (n=9) és B: autotranszplantált (n=9) csoport. Hat hónappal később az állatok három csoportja került műtétre: C: áloperált (csak a has megnyitása/zárása történt) (n=9), D: lépirtott (n=9) és E: autotranszplantált (n=9) – a korábbival hasonló léptömeggel. Az állatok fennmaradó csoportjai alkották a kezeletlen kontrollcsoportot (F és G, n: 2×9=18). A műtétek után kettő, illetve nyolc hónappal vett vérből 1. kvantitatíve és kvalitatíve vérképvizsgálatra (hematológiai automatával), 2. phagocytaaktivitás-mérésre (luminométerrel), 3. lymphocytaalcsoport-meghatározásokra (CD3, CD4, CD8, CD19, CD56 – áramlási sejtfluoriméterrel) és 4. szerológiai vizsgálatokra (immunglobulinok: IgM-, IgG-, IgA-, komplementkomponensek: C3, C4 – lézer-nefelométerrel) került sor.
Eredmények: Az autotranszplantáció mérsékli a splenectomia hatására létrejövő CD3+ T-sejtek számának esését a 2. hónapban, valamint az IgM-szint-csökkenést a 8. hónapban.
Következtetések:
A lépeltávolítás utáni autotanszpantáció pozitív változásokat eredményezett a kísérleti állatok perifériás T-sejtjeinek eloszlásában és IgM-szintjében. Az autotranszplantált léptömeg előnyös hatásai azonban csak időszakosan és részlegesen állítanak helyre egyes lépfunkciókat. Az általunk visszaültetett léptömeg (10%) nem elég a lép összes hematológiai és immunológiai funkciójának helyreállítására.


Comparison of immunological and hematological changes in splenectomised and spleen autotransplanted mice in the 2nd and 8th months postoperatively
Introduction and aims: Spleen autotransplantation is a new surgical method introduced for the possible restoration of the spleen functions after splenectomy. According to the “Furka’s spleen-chip” technique several slices of spleen are inserted between the two layers of the greater omentum. Earlyer we adaptated this technique for mice with microsurgical methods.
Now we aimed at comparing the haematological and immunological changes in splenectomised and spleen autotransplanted (inserted 10% of the original spleen mass) mice, two and ight months after the operations.
Materials and methods: Animals (n=63): female Balb/c mice. The animals were operated in two rounds: round 1 (8 months before the measurements): group A: splenectomy (n=9); group B: spleen autotransplantion (n=9); round 2 (2 months before the measurements): group C: sham operation (n=9); D: splenectomy (n=9); group E: spleen autotransplantation (n=9); F, G: controls – no surgical intervention (n=2×9=18); 1. hematological (quantitative and qualitative cell count determinations by microcell counter, and 2. phagocyte activity measurements (luminometer), 3. lymphocyte subset analysis (CD3, CD4, CD8, CD19, CD56 – flow cytometer) and 4. serological (immunglobulins: IgM, IgG, IgA, complement components: C3, C4 evaluations by laser nephelometry) determinations were carried out in blood at 2nd and 8th months after the operations.
Results: The autotransplantation of spleen could only partially reverse the decrease in the number of peripheral CD3+ T-cell in the 2nd month, additionally the fall of serum IgM levels in the 8th month caused by splenectomy.
Conclusions: Spleen-autotransplantation had some positive effects on the peripheral distribution of T-cells and the IgM levels after splenectomy. The beneficial effects of autotransplanted spleen appeared time dependently and partially and affected only some of the splenic functions. The inserted spleen mass (10%) used in our experiments was not enough to restore the total hematological and immunological functions of the spleen lost by splenectomy.
Grants: OTKA TO34211.
 


88. A kortikoszteroidkezelés hatása a protein-kináz C izoenzimekre szisztémás lupus erythematosusban szenvedő betegek mononukleáris sejtjeiben, valamint modellsejtvonalakban (E33)

Sipka Sándor2, Griger Zoltán1, Aleksza Magdolna2, Kiss Emese2, Bíró Tamás1, Bodolay Edit2, Zeher Margit2, Szegedi Gyula2
Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum, 1Élettani Intézet és 2III. Sz. Belgyógyászati Klinika

A protein-kináz C (PKC) izoenzimcsalád (a kalciumfüggő cPKC; a kalciumfüggetlen nPKC; az atípusos aPKC) a jelátviteli folyamatok egyik központi szabályozó molekulacsoportja. Jelen kísérleteinkben a klinikailag hatásos kortikoszteroidkezelés hatását vizsgáltuk a PKC-izoenzimekre szisztémás lupus erythematosusban szenvedő (SLE-) betegek és egészséges önkéntesek perifériás monocytáiban, valamint akut monocytás leukaemiából (FAB M5) származó MonoMac-6- és akut myeloid leukaemiából származó THP-1-sejtvonalakon.
Megállapítottuk, hogy az egészséges és SLE-s monocyták a cPKCa és -b, az nPKCd, -h és -e és az aPKCz izoformákat fejezik ki, míg a sejtvonalakban (ehhez nagyon hasonlóan) a cPKCa és -b, az nPKCd és -e és az aPKCz izoenzimek expresszálódnak. Áramlásos citometria, valamint Western blot alkalmazásával ugyanakkor kimutattuk, hogy az SLE-s monocytákban az nPKCd és -e, valamint az aPKCz, míg a sejtvonalakban az nPKCe szintje jelentősen alacsonyabb, mint a kontrollmonocytákban. Bebizonyosodott emellett az is, hogy a klinikailag hatásos – azaz mind a betegség tüneteit, mind a laboratóriumi paramétereket javító –, hosszú távú in vivo kortikoszteroidkezelés jelentős mértékben normalizálta a PKC-izoenzimek többségének kifejeződését; azaz az nPKCd és -e expressziója az egészséges monocytákban tapasztalt szintekhez közelített.
Vizsgáltuk továbbá az in vitro kortikoszteroidkezelés (10 µM, két napig) hatását is a PKC-izoformák expressziójára. Kvantitatív “real-time” PCR, Western blot, valamint áramlásos citometria segítségével kimutattuk, hogy mind a perifériás monocytákban, mind a MonoMac-6- és THP-1-sejtvonalakban a kortikoszteroid szelektíven – azaz a többi izoforma szintjét nem befolyásolva – jelentős mértékben megnövelte a PKCe expresszióját.
Mindezen eredményeink azt valószínűsítik, hogy az SLE-s monocytákban bizonyos PKC-izoformák szintje alacsonyabb az egészséges kontrollokénál; ezt a változást a klinikailag hatásos kortikoszteroidkezelés izoforma-specifikus módon revertálhatja. Feltételezhető emellett az is, hogy az nPKCe vonatkozásában a MonoMac-6-sejtvonal az SLE-s monocyták jó modelljének tekinthető.
 


Effect of corticosteroid treatment on the protein kinase c system in monocytes of patients with systemic lupus erythematosus and in modell cell lines
Protein kinase C (PKC) comprises a family of serine/threonine kinases (calcium-dependent “conventional” cPKC; calcium-independent “novel” nPKC; atypical aPKC) that play central roles in the signal transductional processes in numerous cell types. In the present study, we investigated the effect of clinically effective corticosteroid treatment on the PKC isoforms in monocytes of patients with systemic lupus erythematosus (SLE) and of healthy controls, and in cell lines MonoMac6 and THP-1.
We found that the monocytes of healthy controls and SLE patients expressed the cPKCa and b; the nPKCd, h and e; and the aPKCz, whereas in the cell lines (very similarly to those found in monocytes) we could detect the cPKCa and b; the nPKCd and e; and the aPKCz isoenzymes. As revealed by Western blot and flow cytometry techniques, the levels of nPKCd and e and the aPKCz in the monocytes of patients with SLE, and, in addition, the level of nPKCe in MonoMac6 cells were decreased compared to those of healthy monocytes. We also observed that in vivo cortico-steroid treatment, in parallel with its effect to improve clinical status and laboratory parameters, normalized the levels of most (but, notably, not all) of the isoforms.
We, furthermore, investigated the effect of in vitro corticosteroid treatment (10 µM, 2 days) on the expressions of the PKC isoforms. Using quantitative PCR, Western blot and flow cytometry techniques, we found that corticosteroid treatment both in human peripherial monocytes and in MonoMac6 and THP-1 cell lines selectively and markedly increased the expression of nPKCe.
Our data, therefore, argue for that in the monocytes of patients with SLE the levels of certain PKC isoforms decreased compared to the healthy control, which supressions could be reverted isoform-specifically by the clinically efficient corticosteroid treatment. Finally, our data also suggest that the MonoMac6 cell line (at least with respect to the nPKCe) may partly function as a model system for monocytes of SLE patients.

89. A CD14, TLR2 és TLR4 gének polimorfizmusainak vizsgálata autoimmun és immunpatomechanizmusú betegségekben (P62)

Sümegi Andrea1, Dankó Katalin2, Kiss Emese2, Szegedi Andrea3, Tar Tünde2, Ponyi Andrea2, Szegedi Gyula2, Antal-Szalmás Péter1
Debreceni Egyetem, Orvos és Egészségtudományi Centrum, 1Klinikai Biokémiai és Molekuláris Patológiai Intézet, 2III. Sz. Belgyógyászati Klinika, 3Bőrgyógyászati Klinika

A CD14-Toll-like receptor (TLR) komplex jelentős szerepet játszik mind a természetes, mind az adaptív immunrendszer működésének szabályozásában. Arra a kérdésre kerestünk választ, hogy a komplex komponenseit kódoló gének ismert polimorfizmusainak gyakorisága mutat-e eltérést a külön- böző immunpatomechanizmusú megbetegedésekben. A CD14 (C-159T), TLR2 (Arg677Trp, Arg753Gln) és TLR4 (Asp299Gly, Thr399Ile) gének polimorfizmusait PCR+ és RFLP módszerek segítségével vizsgáltuk. A 34, szisztémás lupus erythematosusban szenvedő beteg esetében nem találtunk szignifikáns eltérést a genotípusok és az allélfrekvenciák megoszlásában, az egészséges kontrollok (n=52) adataihoz képest. Az idiopathiás inflammatoricus myopathia (polymyositis, n=71; dermatomyositis, n=36) miatt gondozott betegeknél a CD14-polimorfizmus esetében a C/C genotípus mutatott emelkedett értéket (28,0% vs. 16,7%). A betegség lefolyását vizsgálva a monofázisos betegek genotípus-megoszlása megegyezett az egészséges kontrollokéval (C/C: 21%, T/C: 61%, T/T: 18%), a polifázisos betegek esetében a C/C (C/C: 39%, T/C: 53%, T/T: 8%), míg érdekes módon a krónikus lefolyás esetén a T/T (C/C: 6%, T/C: 47%, T/T: 47%) genotípus dominanciáját észleltük. A tesztelt 28 atópiás dermatitises beteg esetében a CD14-polimorfizmus C/C genotípusának aránya mutatott emelkedést (36% vs. 21%), az irodalmi adatoknak megfelelően, ugyanakkor nem volt szignifikáns eltérés a TLR2 és TLR4 gének polimorfizmusainak megoszlásában. A krónikus idiopathiás urticariás betegek (n=34) mintáiban a CD14-polimorfizmus megoszlása nem tért el lényegesen az egészségesekétől, ugyanakkor a TLR2–Arg753Gln heterozigóták aránya alacsonyabb (2,9% vs. 10,3%), a TLR4– Asp299Gly, Thr399Ile heterozigóták aránya jelentősen magasabb (17,6% vs. 2,6%) volt ebben a betegcsoportban. Eredményeink alapján a vizsgált gének polimorfizmusai jellegzetes megoszlást mutatnak egyes immunpatomechanizmusú megbetegedésekben; vélhetően ez szerepet játszhat a betegség kialakulásában és lefolyásában is, ennek megerősítése azonban további vizsgálatokat igényel.
 


Distribution of polymorphisms of the CD14, TLR2 and TLR4 genes in autoimmune and immune-mediated disorders
The CD14/Toll-like receptor (TLR) complex plays an important role in the regulation of both the innate and adaptive immune system. We tried to characterize the distribution of the known genetic polymorphisms of the components of this complex in different immune-mediated disorders. The C-159T polymorphism of the CD14 gene, the Arg677Trp, Arg753Gln polymorphisms of the TLR2 gene and the Asp299Gly, Thr399Ile polymorphisms of the TLR4 gene were studied by specific PCR+RFLP methods. In the case of the 34 patients suffering from systemic lupus erythematosus the distribution of the genotypes and the allele frequencies was not different from the data of 52 healthy controls. The patients followed because of idiopathic inflammatoric myopathy (polymyositis, n=71; dermatomyositis, n=36) showed the dominance of the C/C genotype of the CD14 polymorphism (28.0% vs. 16.7%). Concerning the course of the disease patients with a monophase disorder showed similar distribution of this polymorphism as the healthy controls (C/C: 21%, T/C: 61%, T/T: 18%), the polyphase disease course was associated with the dominance of the C/C (C/C: 39%, T/C: 53%, T/T: 8%), while interstingly the chronic disease course with the T/T genotype (C/C: 6%, T/C: 47%, T/T: 47%). In the case of patients suffering from atopic dermatits (n=28) the rate of the C/C genotype of CD14 was elevated (36% vs. 21%) similarly to literature data, while the distribution of the polymorphisms of the TLR4 and TLR2 genes were not significantly different from that of the controls. In the case of the patients followed because of chronic idiopathic urticaria the frequency of the CD14 genotypes were not altered, while the rate of those who were heterozygous for the TLR2–Arg753Gln polymorphism decreased (2.9% vs. 10.3%) and who were heterozygous for the TLR4–Asp299Gly, Thr399Ile polymorphisms increased (17.6% vs. 2.6%) in this patient group. Our data suggest specific distribution of the tested genetic polymorphisms in certain immune-mediated disorders that might have role in the development and course of these diseases, but this theory still needs further investigations.
 


90. A card15/nod2 gén három mutációjának vizsgálata Wegener-granulomatosisos betegeken és egészséges kontrollokon
(P30)

Sütő Gábor1, Nagy Zsuzsanna2, Karádi Oszkár2, Kiss Csaba1, Kumánovics Gábor1, Lövei Csilla1, Nagy Zoltán1, Nusser Nóra1, Varjú Cecília1, Czirják László1
Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, 1Immunológiai és Reumatológiai Klinika, 2I. Sz. Belgyógyászati Klinika
 
Bevezetés: A Wegener-granulomatosis szisztémás immunológiai betegség; elsősorban a légutak granulomato- sus gyulladása és szisztémás nekrotizáló vasculitis jellemzi, az inflammatoricus sejtek apoptózisának zavarával. A CARD15/NOD2 gén az egyik intracelluláris patogénasszociált molekuláris mintázatot felismerő fehérjét kódolja. A granulomaképződéssel járó Crohn-betegség kialakulásában az apoptózis szintén károsodik, valamint a CARD15/NOD2 gén mutációinak (Arg702Trp, Gly908Arg és Leu1007fsinsC) szerepe tűnik jelentősnek.
Célkitűzés: A három mutáció allélfrekvenciájának vizsgálata Wegener-granulomatosisban szenvedő betegeken és egészségeseken.
Módszer: A vizsgálatba 16 Wegener-granulomatosisos beteget és 107 kontrollt vontunk be. A Gly908Arg mutációt vizsgálva polimeráz láncreakciót követően az amplifikált mintákat a mutációspecifikus HhaI restrikciós enzimmel emésztettük. Az Arg702Trp és Leu1007fsinsC mutációkat allélspecifikus primerekkel végzett polimeráz láncreakcióval vizsgáltuk. A csoportok allélfrekvenciáját c2-próbával hasonlítottuk össze.
Eredmények: Wegener-granulomatosis esetében az Arg702Trp allélfrekvenciája 6,25% (a kontrolloké 4,67%, nem szignifikáns), a Gly908Arg 6,25% (a kontroll 1,42%, nem szignifikáns), a Leu1007fsinsC 0,00% (a kontroll 2,80%, nem szignifikáns).
Következtetések: A CARD15/NOD2 gén Gly908Arg mutációja tendenciáját tekintve Wegener-granulomatosisban gyakoribb, ezért ennek a szerepe további vizsgálatokat igényel.
A vizsgálatot az Országos Tudományos Kutatási Alapprogramok (OTKA) F042912, F037639, T046437 és az Egészségügyi Tudományos Tanács (ETT) 98/2001, 573/2003 pályázat támogatta.
The examination of three mutations in the CARD15/NOD2 gene in Wegener’s granulomatosis and healthy controls

Introduction: Wegener’s granulomatosis is characterized by granulomata of the respiratory tract and systemic necrotizing vasculitis associated with abnormal apoptosis of inflammatory cells. CARD15/NOD2 gene is coding a pathogene associated molecular pattern recognizing intracellular receptor. The pathologic hallmarks of Crohn’s disease are granuloma formation and impaired apoptosis of inflammatory cells, and the mutation of CARD15/NOD2 gene (Arg702Trp, Gly908Arg and Leu1007fsinsC) seems to have a pathogenetic role in its development.
Aim: The allele frequency of the three mutations were evaluated in Wegener’s granulomatosis patients and healthy controls.
Methods: 16 Wegener’s granulomatosis patients and 107 controls were examined. To detect the Gly908Arg mutation after the polymerase chain reaction the DNA sequence was digested by the mutation specific HhaI restriction enzyme. The Arg702Trp and Leu1007fsinsC mutations were detected with polymerase chain reaction using sequence specific primers. The allele frequencies of the groups were compared with c2 analysis.
Results: Allelic frequency in Wegener’s granulomatosis: Arg702Trp: 6.25% (in controls: 4.67%, not significant); Gly908Arg: 6.25% (in controls 1.42%, not significant); Leu1007fsinsC: 0.00% (in controls 2.80%, not significant).
Conclusions: There is a tendency to carry much frequently the Gly908Arg mutation of the CARD15/NOD2 gene in Wegener’s granulomatosis. The examination of the mutations of CARD15/NOD2 genes may provide further insight into the development of Wegener’s granulomatosis.
The study was supported by grants of National Research Found (OTKA), Hungary (No. F042912, No. F037639, No. T046437) and Hungarian Ministry of Health (ETT 098/2001, 573/2003).
 


91. COMP – új lehetőség a porcpusztulás vizsgálatára (E25)

Szabó Zsófia1, Aleksza Magdolna2, Miklós Kata1, Sipka Sándor2, Németh Julianna1 1Országos Gyógyintézeti Központ, Immundiagnosztikai Osztály, Budapest; 2Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum, III. Sz. Belgyógyászati Klinika, Klinikai Immunológiai Tanszék
 
Amikor az ízületi porc anyaga betegség hatására degradálódik, többféle fehérjefragmentum keletkezik és kerül az ízületi folyadékba. Ezek közül néhány – mint például a COMP (cartilage oligomeric matrix protein) – bekerül a vérkeringésbe, és így alkalmassá válik a porcpusztulás előrehaladásának monitorozására. A COMP öt alegységből álló pentamer fehérje; a porcon kívül előfordul az inakban és a synovialis membránban. A szérum COMP-szintje és a porcdegradáció mértéke között kvantitatív összefüggést mutattak ki.
Rheumatoid arthritises, egyéb szisztémás autoimmun betegségben szenvedők, vírusfertőzöttek, valamint egészséges véradók szérum-COMP-szintjét vizsgáltuk. Az úgynevezett korai rheumatoid arthritises (két évnél rövidebb ideje zajló betegség) csoportban 10-ből nyolc esetben mértünk pozitív COMP-szérum-szintet. A két évnél hosszabb ideje rheumatoid arthritisben szenvedő 39 beteg közül 35 esetben találtuk pozitívnak a COMP-értékeket. Nem rheumatoid arthritisesnek diagnosztizált autoimmun betegségben 16 esetből nyolcszor szintén pozitív eredményt kaptunk. Ezzel szemben a vírusfertőzésben szenvedő betegek, illetve az egészséges véradók szérum-COMP-szintje negatívnak adódott.
A két évnél hosszabb ideje fennálló rheumatoid arthritisben szenvedő betegek esetében az erősen pozitívak aránya 70% felett volt. A korai rheumatoid arthritisben szenvedők között 50%-ban, míg az egyéb autoimmun betegségben szenvedők mintáiban 30%-ban mértünk magas pozitív COMP-értéket.
Eredményeink alapján a szérum-COMP-érték jól jellemzi a betegség aktivitását és előrehaladottságát. Korai rheumatoid arthritisben a COMP-koncentráció alkalmas lehet a kórkép későbbi enyhe vagy súlyos lefolyásának előrejelzésére, egyéb autoimmun kórképekben pedig a pozitív szérum-COMP-szint előrevetítheti a betegség kedvezőtlen irányú változását, rheumatoid arthritissel kombinálódását. A jövőben e betegek követéses vizsgálatával lehetőség nyílik a fenti feltételezések tisztázására.
 


COMP – new possibility in the diagnostics of cartilage degradation
When articular cartilage is degraded by a disease, protein fragments are produced and diffuse out into the joint fluid. Some of these fragments, like COMP (cartilage oligomeric matrix protein) get into the blood circulation and become suitable for monitoring the progress of cartilage degradation. COMP is a pentameric protein built up by five monomers that beside the cartilage can be found in tendons and synovial membranes. A quantitative relation has been demonstrated between the COMP level of sera and the extent of cartilage degradation.
We investigated the COMP level in sera of patients suffered from rheumatoid arthritis (RA), non-RA systemic autoimmune diseases, virus infection and healthy blood donors. We measured positive COMP level in sera in eight cases out of 10 in the group of early RA (disease history shorter than two years). We found positive COMP value in 35 patients out of 39 suffered from RA for more than two years. We found also eight positive results out of 16, when the diagnosis was non-RA autoimmune disease. In contrast to these results, the COMP level in sera was found negative in patients suffering from virus infection and in healthy blood donors.
In case of patients suffering from RA more than two years, the rate of strongly positive instances was higher than 70%. In cases of patients suffering from early RA and non-RA autoimmune diseases, the ratio of highly positive COMP level was 50% and 30%, respectively.
Our results suggests, that the COMP level in sera characterizes the activity and progress of the disease quite well. In early RA the measurement of COMP concentration may be a proper tool for the prediction of further (light or serious) development of the disease. In case of non-RA autoimmune disease the positive COMP level may predict the unfavorable change of the disease, its combination with RA. Follow-up observation of these patients can give opportunity for elucidating the above suggestions in the future.
 


92. Az L-szelektin és a CD44 szerepe a korai neutrophil extravasatióban; in vivo videomikroszkópos vizsgálatok arthritises állatmodellben (E11)

Szántó Sándor1, Gál István1, 2, Gonda Andrea2, Bajnok Éva2, Glant Tibor2, Mikecz Katalin2
1Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum, III. sz. Belgyógyászati Klinika; 2Rush Egyetem, Orvosi Centrum, Ortopédsebészeti Intézet, Biokémiai és Molekulárbiológiai Részleg, Chicago, USA
Az L- (leukocyta-) szelektin (CD62L) és a CD44 fontos adhéziós molekulákként elősegítik a leukocyták endothelen történő gördülését (rollingját) mint a leukocyták gyulladásos szövetekbe való beáramlásának első lépését. Ez ideig nem vizsgálták az L-szelektin és a CD44 specifikus szerepét a gyulladásos ízületekbe való sejtvándorlásban. Antigénindukált arthritisben CD44-deficiens, CD62L-deficiens és CD44/L-szelektin dupla knockout egereket használtunk e receptorok gyulladásos sejtfelszaporodásban betöltött szerepének tisztázására. Intraperitonealis immunizáció hasonló antigénspecifikus immunválaszokat eredményezett a vad típusú és a knockout egerekben. Azonban a neutrophil granulocyták térdízületekbe való extravasatiója L-szelektin és dupla knockout egerekben jelentősen meglassult az intraartikuláris antigéninjekció után; a T-sejtekkel kapcsolatban nem észleltünk hasonló eltérést. A synovialis mikrocirkuláció intravitális videomikroszkópos vizsgálata gyorsult leukocytarollingot és csökkent adherenciát mutatott akár a CD44, akár az L-szelektin hiánya esetén, de a CD44-deficientia nem hatott jelentősen az L-szelektin-nullsejtek felszaporodására. Vad típusú leukocytákkal összehasonlítva, az L-szelektin expressziója csökkent a lépben, a perifériás vérben és a gyulladt ízületekben, utalva arra, hogy az L-szelektin csökkent expressziója – inkább, mint a CD44 hiánya – lehet felelős a granulocyták késleltetett beáramlásáért a CD44-knockout egerek ízületébe. Összefoglalva, az L-szelektin nagyobb mértékben járul hozzá a neutrophil extravasatióhoz az antigénindukált arthritis korai fázisában.
 


Role of L-selectin and CD44 in early neutrophil extravasation; in vivo videomicroscopy in an arthritic animal model
L (leukocyte) -selectin (CD62L) and CD44 are major adhesion receptors that support the rolling of leukocytes on endothelium, the first step of leukocyte entry into inflamed tissue. The specific contribution of L-selectin or CD44 to the regulation of cell traffic to joints in arthritis has not been investigated. We used CD44-deficient, L-selectin-deficient, and CD44/L-selectin double knockout mice to determine the requirement for these receptors for inflammatory cell recruitment during Ag-induced arthritis. Intraperitoneal immunization resulted in similar activation status and Ag-specific responses in wild-type and gene-targeted mice. However, extravasation of neutrophil granulocytes, but not the emigration of T-cells, into the knee joints after intra-articular Ag injection was significantly delayed in L-selectin-deficient and double knockout mice. Intravital videomicroscopy on the synovial microcirculation revealed enhanced leukocyte rolling and diminished adherence in mice lacking either CD44 or L-selectin, but CD44 deficiency had no significant effect on the recruitment of L-selectin-null cells. Compared with wild-type leukocytes, expression of L-selectin was down-regulated in CD44-deficient cells in the spleen, peripheral blood, and inflamed joints, suggesting that reduced expression of L-selectin, rather than the lack of CD44, could be responsible for the delayed influx of granulocytes into the joints of CD44-deficient mice. In conclusion, there is a greater requirement for L-selectin than for CD44 for neutrophil extravasation during the early phase of Ag-induced arthritis.
 


93. A PPAR-g magreceptor aktiválása szabályozza a dendritikus sejtek differenciálódását és a CD1 géncsalád expresszióját (E12)

Szatmári István1, Gogolák Péter2, Rajnavölgyi Éva2, Nagy László1
Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségügyi Centrum, 1Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet, 2Immunológiai Intézet
A PPAR-g (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor g) ligandfüggő transzkripciós faktor; fontos szerepet játszik a lipidmetabolizmus szabályozásában, ezen túlmenően nélkülözhetetlen az adipocyták differenciálódásához. Jelen tanulmányunkban megvizsgáltuk a PPAR-g magreceptor lehetséges szerepét a monocyta eredetű dendritikus sejtek differenciálódása során. Eredményeink szerint a dendritikus sejtekben a PPAR-g magreceptor mRNS-szintje drasztikusan megemelkedett. Ez a megfigyelés arra utal, hogy a PPAR-g-receptor szerepet játszhat ezen differenciálódási folyamat regulációjában, ezért részletesen tanulmányoztuk a PPAR-agonisták hatásait a dendritikus sejtek funkcionális sajátságaira: a PPAR-g magreceptor aktiválását követően a sejtek T-sejt-aktiváló képessége nem változott, a sejtek fagocitáló képessége azonban fokozódott, és több, dendritikus sejtekre jellemző marker expressziója is megváltozott. Érdekes módon a lipid természetű antigének bemutatásáért felelős CD1-molekulák expresszióját koordináltan szabályozták a PPAR-g-specifikus ligandok: a PPAR-g-aktivátorok hatására a dendritikus sejtekben csökkent a CD1a-szint, a CD1d-szint viszont emelkedett. A PPAR-g-liganddal kezelt sejtek fokozott CD1d-expressziója lehetővé tette, hogy e sejtek a CD1d-re specifikus ligandum (a-galaktozil-ceramid) jelenlétében elősegítsék a CD1d-dependens NKT (natural killer T-sejtek) fokozott proliferációját. Eredményeink azt sugallják, hogy a lipidek által aktiválható PPAR-g magreceptor hatására olyan speciális dendritikus sejttípus keletkezik, amelynek erőteljes a fagocitáló és lipidprezentáló képessége és fokozottan elősegíti a natural killer T-sejtek aktiválódását.
 


Activation of PPAR-g modulates dendritic cells differentiation and CD1 expression
PPAR-g (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-g) is a ligand dependent transcription factor that has well-established roles in the regulation of lipid metabolism and adipocyte differentiation. We examined the role of PPAR-g in dendritic cell (DC) differentiation and function using human monocyte-derived DC as a model system. We found that PPAR-g expression is dramatically increased in immature DCs as compared to monocytes. These data prompted us to investigate the role of PPAR-g in the differentiation of DC. Activation of the receptor in DC did not effect T-cell proliferation capacity, but altered the phenotype by increasing the phagocytic capacity and changing the expression pattern of cell surface markers. Unexpectedly, we found that CD1 glycoproteins, a class of molecules responsible for the presentation of self and foreign modified lipids, were coordinately regulated by PPAR-g activation. CD1a levels were reduced, whilst CD1d expression was induced. Enhanced expression of CD1d was coupled to the selective induction of natural-killer T-cell (NKT-cell) proliferation in the presence of a-GalCer. These results suggest that the lipid activated transcription factor, PPAR-g orchestrates a transcriptional response leading to the development of a DC subtype with increased internalizing capacity, efficient lipid presentation and the augmented potential to activate NKT-cells.
 


94. Az erőteljes C3-felhasználás komplementaktiválódásra utal ischaemiás stroke-ban és tranziens ischaemiás attakban (E34)

Széplaki Gábor1, Varga Lilian1, Széplaki Zoltán2, Harcos Péter3, Nagyné Vers Mária1, Füst György1
Semmelweis Egyetem, 1III. sz. Belgyógyászati Klinika, Kutató Laboratórium, 2Kútvölgyi Klinikai Tömb, Neurológiai Klinikai Csoport; 3Szent Imre Kórház, Neurológiai Osztály, Budapest
Állatkísérletekben valószínűsítették, hogy a komplementrendszer szerepet játszik a vascularis eredetű agyi ischaemiás történések okozta szöveti károsodás létrejöttében, azonban ennek alátámasztására még nem végeztek szérumkomplement-méréseket.
Vizsgálatunkban 49 akutan felvételre kerülő, ischaemiás stroke-ban vagy tranziens ischaemiás attakban (TIA) szenvedő beteg szérumában mértük öt pozitív [C3 komplement (C3), C9 komplement (C9), C1-észteráz-inhibitor (C1-INH), C-reaktív fehérje (CRP), haptoglobin] és egy negatív [a2HS-glikoprotein (a2HSGP)] akutfázis-fehérje szintjét. Betegeinktől a felvételt követően 6–9 nappal újabb vérmintát vettünk, hogy összehasonlíthassuk az akutfázis-fehérjék szintjének változását.
Az akutfázis-reakciónak megfelelően a betegek pozitív akutfázis-fehérjéinek szintje megemelkedett, és a 6–9. napra tovább nőtt (CRP: p=0,0208, C9: p=0,0092, C1-INH: p=0,0004, haptoglobin: p=0,0130), míg az a2HSGP – negatív akutfázis-fehérje – szérumszintje csökkent a betegekben (p<0,0001). A szérum-C3-koncentráció azonban, annak ellenére, hogy pozitív akutfázis-fehérje, szignifikánsan csökkent egy héttel az agyi ischaemiás károsodás után [0,94 (0,80–1,12) vs. 0,79 (0,57–0,98) p=0,0016].
Tehát vizsgálatunkban a C3 mint akutfázis-fehérje paradox módon viselkedett; ez valószínűleg annak tudható be, hogy ischaemiás stroke és TIA kezdetekor komplementaktiváció megy végbe, amelynek során C3-felhasználás jön létre. Ennek igazolására és a komplementaktiváció mechanizmusának tisztázására a továbbiakban komplementaktivációs termékek kimutatását tervezzük ebben a betegcsoportban.
Támogatás: ETT 522/2003.
 


Strong C3 consumption shows the systemic activation of the complement system in ischaemic stroke and transient ischaemic attack
Animal experimental models suggested that complement system might play an important role in the generation of ischaemic tissue damage in vascular brain infarcts; however measurements of serum complement components are not available to support these findings.
In our present study we investigated the presence of systemic complement activation in 49 patients presenting with ischaemic stroke or transient ischaemic attack (TIA) by measuring concentrations of six different acute phase proteins; fiv positive acute phase reactants [complement component C3 (C3), complement component C9 (C9), C1-esterase inhibitor (C1-INH), C-reactive protein (CRP), haptoglobin] and a negative one, a2HS-glicoprotein (a2HSGP). Blood samples were taken at time of admission to the hospital and 6–9 days later to study the changes in serum concentrations of the acute phase reactants.
We found that concentrations of the positive acute phase reactants were elevated at time of admission and further increased in 6–9 days (CRP: p=0.0208, C9: p=0.0092, C1-INH: p=0.0004, haptoglobin: p=0.0130), whereas a2HSGP level decreased in the patients (p<0.0001). In contrast, serum concentration of C3 falls significantly [0.94 (0.80–1.12) vs. 0.79 (0.57–0.98), p=0.0016] one week after the brain infarct in our patients.
Thus C3 behaved itself inversely as an acute phase reactant in our present study. The strong consumption of C3 suggests that systemic activation of the complement cascade occurs in the acute phase of ischaemic stroke and TIA. To further support this present finding and to determinate the way of complement activation, we plan to measure complement activation products in the sera of patients with ischaemic stroke.
The study was supported by the ETT 522/2003 grant.
 


95. Az emberi 6-os b herpeszvírus (
Hhv-6
b) citokintermelése
cd4-pozitív
t-lymphocytákban
(E32)

Szilágyi Melinda1, Sonkoly Enikő2, Kövesdi Valéria3, Ongrádi József3
1Semmelweis Egyetem, Bőr- és Nemikórtani Klinika, Budapest; 2Szegedi Tudományegyetem, Bőrgyógyászati és Allergológiai Klinika; 3Országos Bőr- és Nemikórtani Intézet, Budapest
 
A HHV-6B és a rokon HHV-6A, valamint a HHV-7 CD4+ T-lymphocytákat fertőznek, azokban lappanganak, de nem azonos – akut és senyvesztő – betegségeket okoznak. Ennek oka, hogy fertőzésük után eltérőek a lymphocytákból felszabaduló citokinmintázatok. A HHV-6A és a HHV-7 citokinindukciójának tanulmányozása után a sokféle kórképben szerepet játszó HHV-6B hatását vizsgáltuk. A vírusreplikációs ciklus egymást követő szakaszaiban is eltérő az egyes citokinek termelése, ezért a vírusfertőzés különböző időpontjaiban mértük a betegségek szempontjából legfontosabb citokinek génexpresszióját és fehérjetermelését. Ultracentrifugálással koncentrált nagy mennyiségű HHV-6B-szuszpenzióval szinkronizáltan fertőztünk MOLT-3-sejteket, majd a sejtek pusztulásáig tartó 240 óra alatt nyolc felülúszó mintában szendvics ELISA-val meghatároztuk a sejtekből kibocsátott citokinfehérje mennyiségét és a sejtek citokin-mRNS-tartalmát, valós idejű RT-PCR révén. Kontrollként fertőzetlen sejtek szolgáltak. Megállapítottuk, hogy a HHV-6B az interleukin-2 (IL-2) és az interferon-g (IFN-g) termelését először csökkentette, majd fokozta; az IL-12 szekréciója ezzel ellentétes volt. Szinergizmusuk megbomlása a HHV-6B immunszuppresszív hatásához járul hozzá, amelyet fokoz a transzformáló növekedési faktor-b1-szint (TGF-b1) jelentős emelkedése. Az IL-15-kibocsátás csökkenése gátolhatja a természetes és lymphokinaktivált ölősejtek tevékenységét. A granulocyta-monocyta növekedési faktor (GM-CSF) és az IL-3 fehérje szintjének jelentős csökkenése a B-sejtek érését zavarva lymphomák kialakulását segítheti. Az IL-4-kibocsátás csökkenése a daganatellenes hatás és az antitesttermelés gyengülését, az IL-10-termelés csökkenése a B-sejtek érésének gátlását és az antitesttermelés csökkenését eredményezheti. A tumornekrózis-faktor-a- (TNF-a-) és kisebb fokban a TNF-b-termelés csökkenése ad magyarázatot arra, hogy a HHV-6B nem képes a HIV aktiválására. A vírusszaporodás csúcspontján az IL-1b-szint jelentős növekedése az akut fertőzésben tapasztalt magas láz keletkezését világítja meg. A Th1- és Th2-rendszert egyaránt gátló hatások kiegyensúlyozottak, az akut fertőzések gyorsan gyógyulnak, az idültek azonban súlyosak.
Az OTKA T29299 és ETT 08-060/2000 pályázatok támogatásával.
 


Cytokine induction by human herpesvirus 6B (HHV-6b) in CD4+ T-lymphocytes
HHV-6B and related HHV-6A as well as HHV-7 infect and establish latency in CD4+ T-lymphocytes, but cause different acute and chronic diseases. This might, probably depend on different cytokine pattern secreted from infected lymphocytes. After preceding studies on cytokines induced by HHV-6A and HHV-7 we investigated similar effects of HHV-6B that plays an important role in many disorders. In the subsequent phases of the viral replication cycle, induction of individual cytokines might be different, therefore, gene expression and protein secretion of key cytokines concerning pathological conditions were quantitated during the complete course of replication. Concentrated HHV-6B stock was produced by ultracentrifugation. Large amount of MOLT-3 cells were infected at high multiplicity for synchronised HHV-6B infection. Subsequently eight supernatant samples were collected at different time intervals during 240 h when cells died. Cytokine secretion was quantitated by sandwich ELISA while the intracellular mRNA content by real time RT-PCR. Uninfected cells served as controls. It was established that, HHV-6B first increased subsequently decreased interleukin (IL) -2 and interferon (IFN) -g production; the effect on IL-12 secretion was the opposite. Disruption of their synergism might lead to immunosuppressive effects of HHV-6B augmented further by increased level of tumour growth factor (TGF) -b1. Diminished production of IL-15 can inhibit the activity of natural and lymphokine activated killer cells. Significant suppression of granulocyte-monocyte colony stimulatory factor (GM-CSF) and IL-3 secretion disturbe B-cell maturation leading to lymphomagenesis. Suppressed IL-4 production might result in diminished antibody production and anti-tumour activity, suppressed IL-10 level retards B-cell maturation and antibody production. Decreased production of tumour necrosis factor (TNF) -a and, in lesser extent, TNF-b explains that, HHV-6B is not able to transactivate HIV. Significantly elevated IL-1b level at time of the peak of virus replication might be the cause for high fever in acute infections. HHV-6B seems to affect both Th1 and Th2 cytokine systems equally. Acute infection normalises rapidly but chronic ones might be devastating.
Supported by grants from OTKA T29299 and ETT 08-060/2000.
 


96. A 60 kDa-os hősokkfehérjék elleni autoantitestek kialakulásának vizsgálata ischaemiás szívbetegeken (P53)

Udvarnoki Katalin1, Sármán Balázs2, Németh Ilona3, Rugonfalvi Kiss Szabolcs1, Cervenak László1, Vecsey Tibor2, Füst György1, Prohászka Zoltán1
1
Semmelweis Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, III. Sz. Belgyógyászati Klinika és SE-MTA Anyagcsere és Atherosclerosis Kutatócsoport, 2Budai Irgalmasrendi Kórház, 3Semmelweis Egyetem, Általános Orvostudományi Kar (hallgató), Budapest

Bevezető:
Irodalmi adatok és munkacsoportunk korábbi eredményei szerint kapcsolat mutatható ki a 60 kDa-os hősokkfehérje (Hsp60) elleni autoantitestek és az ischaemiás szívbetegség között. Anti-Hsp60 autoantitestek keletkezhetnek bakteriális infekciók után keresztrekció miatt, és származhatnak a természetes autoantitest-repertoárból is. Korábbi megfigyeléseink szerint különbségek mutathatók ki az antihumán és az antibakteriális Hsp60-antitestek között.
Vizsgálatunkban coronariaangiográfiával igazolt ischaemiás szívbetegségben szenvedők körében hasonlítottuk össze az antihumán és az antichlamydia Hsp60 antitesteket.
Módszerek: Százhúsz beteget válogattunk be a vizsgálatba, medián életkoruk 59 év volt (33–80 év); a betegek 27%-a volt nő. Rögzítettük a klinikai adatokat és a koronarográfia adatai alapján a coronariabetegség kiterjedtségét. Az antihumán és a Chlamydia trachomatis elleni, Hsp60-ellenes IgG-t kereskedelmi forgalomban kapható ELISA-kittel (medac, Wedel, Németország) határoztuk meg.
Eredmények: Az anti-hHsp60 IgG-pozitivitás prevalenciája 68% volt, míg az anti-cHsp60 IgG-é 64%. Kettős antitest-negativitást a betegek 24%-ánál, kettős pozitivitást azonban csak 28%-uknál tapasztaltunk. A betegek 40%-ánál csak anti-cHsp60 antitesteket detektáltunk, a fennmaradó 8% csak anti-hHsp60-pozitív volt. A csak anti-hHsp60-pozitív személyek (nyolc) egy kivételével mind igen kiterjedt athe- rosclerosist mutattak (három coronariaág érintettségét) (p=0,0043 a csak anti-cHsp60-pozitívakhoz képest); a csak cHsp60-ra pozitív betegek 70%-a (28/40) egy- vagy kétér-beteg volt.
Következtetés: Eredményeink megerősítik korábbi hipotézisünket, amely szerint az antihumán Hsp60 autoantitestek nem csupán bakteriális fertőzéseket követően, keresztreakció által képződhetnek. Hipotézisünk szerint e megváltozott tulajdonságú autoantitestek forrása a természetes autoantitest-repertoár is lehet. A „valódi” anti-Hsp60 autoantitestek eredményeink szerint súlyosabb coronariabetegséggel járnak. További kísérleteinkkel azokat a környezeti és genetikai tényezőket kívánjuk azonosítani, amelyek ezen „valódi” autoantitestek kialakulására hajlamosítanak.
 


Development of antibodies to 60 kDa heat shock proteins (Hsp60) in patients with ischemic heart disease
Introduction: Recent observations indicate an association between the auto-antibodies against Hsp60 and ischemic heart disease. Anti-Hsp60 antibodies can be created by cross-reaction after bacterial infection and can be originated from the natural auto-antibody repertoire, too. Previously, we reported on marked differences between anti-human and anti-bacterial Hsp60 antibodies.
The aim of our study was to compare anti-human and anti-chlamydia Hsp60 antibodies in patients with ischemic heart disease justified by coronary angiography.
Methods: 120 patients were called in the examination, median years of age 59 (33–80, min.–max.); 27% of the patients were woman. We registered the clinical data and based on the coronarography data the severity of the coronary disease. The amounts of IgG-type antibodies reacting with human and Chlamydia trachomatis Hsp60 were assessed by ELISA Kit available commercially (Medac, Wedel, Germany).
Results: In all the patients, prevalence of IgG-type anti-hHsp60 antibody positivity was 68%, however, IgG-type anti-cHsp60 was 64%. Both antibodies were negative in 24% of the patients, while 28% of them had double positivity. Fourty percent of the patients were only anti-cHsp60, while 8% were anti-hHsp60 antibody positive. Patients with single anti-hHsp60 positivity (7/8) suffered from extensive atherosclerosis (three vessels disease, p=0.0043 compared with the only anti-cHsp60 positive patients). At the same time, 70% (28/40) of the patients who had only anti-cHsp60 antibody positivity were diagnosed with on or two vessels disease.
Discussion: Our results consolidate our previous hypothesis that anti-human Hsp60 auto-antibodies can be produced not only by cross-reaction after bacterial infections, but even by the natural auto-antibody repertoire. According to our results, the “real” anti-Hsp60 auto-antibodies are accompanied by more serious coronary disease. Futher examinations are needed to identify the environmental and genetic factors which can be involved in the development of these “real” auto-antibodies.
 


97. Új SAP-mutáció X-kromoszómához kötött lymphoproliferativ betegségben (P28)
Uzvölgyi Éva1, Erdős Melinda2, Nemes Zoltán3, Török Olga4, Rákóczi Éva2, Went-Sümegi Mária1, Sümegi János1 Maródi László2
1
Cincinnati Gyermekkórház és Egészségtudományi Centrum, Hematológiai/Onkológiai Osztály, Cincinnati, OH; Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum, 2Infektológiai és Gyermekimmunológiai Tanszék, 3Patológiai Intézet és 4Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika
 
A SLAM- (signaling lymphocyte activation molecule) asszo-ciált protein (SAP) mutációja X-kromoszómához kötött lymphoproliferativ betegséghez (XLP) vezet, ennek egyik fő jellemzője az Epstein–Barr-vírus- (EBV-) fertőzések súlyos, gyakran végzetes kimenetele. Az általunk vizsgált család két férfi tagja fatális mononucleosis infectiosában exitált. Az egyik beteg molekuláris genetikai vizsgálatával a SAP gén 1-es exonján missense pontmutációt mutattunk ki (G47A). E mutációra nézve az anya és a nagymama heterozigótának bizonyult. Az irodalomban korábban még nem közölt G47A mutáció eredményeképpen a SAP-fehérje szekvenciájában glicin helyett aszparaginsav található a 16-os pozícióban (G16D). A COS-7-sejtekben klónozással előállított mutáns fehérje féléletideje a vad típushoz képest jelentősen megrövidült. Kotranszfekcióval vizsgáltuk a SAP/G16D-protein kötődését a természetes receptoraihoz. Az eredmények arra utaltak, hogy a mutáns fehérje elveszíti kötődési képességét a SLAM- és a 2B4-molekulákhoz. Vizsgálataink alapján megállapítható, hogy a G16D-aminosav-szubsztitúció a SAP-fehérje funkcióját súlyosan károsítja, ezért kóroki szerepet játszhat az XLP és a fatális mononucleosis kialakulásában.
 


Characterization of a disease causing mutation in the SAP protein observed in a family with X-linked lymphoproliferative disease
Two male patients with fatal infectious mononucleosis (FIM) were identified in a Hungarian family. Patient 1 was admitted at eight months of age with fever, hepatosplenomegaly, maculopapulous exanthemas, and generalized lymphadenopathy. Rapidly developing respiratory arrest required assisted ventilation and he died in four days despite intensive therapy. Histopathology studies revealed T-cell proliferation with CD8 predominance and intact B-cell areas in lymph nodes and the liver. Patient 2, the maternal uncle of patient 1, was well until nine years of age when he was admitted with hepatosplenomegaly, lymphadenopathy, respiratory distress, jaundice and lethargy. He died 10 hours after admission due to rapidly developing cerebral edema, shock and cerebellar herniation. Elevated anti-EBV IgM titer in the patient’s serum indicated FIM.
In patient 1, sequence analysis of the SAP (SH2D1A) gene revealed hemizygous G to A transition at nucleotide position 47 in exon one. This mutation results in asparagine instead of glycine in the sequence of the SAP protein at the amino acid position 16. Heterozygosity for this mutation was found in genomic DNA from the mother and maternal grandmother of patient 1. The mutant SAP (SAP/D16G) protein is defective in protein folding as manifested by the significantly reduced half-life compared to that of the wild type SAP. Furthermore, SAP/D16G is defective in binding to its physiological ligand, signaling lymphocyte activating molecule (SLAM), a glycosylated transmembrane protein also known as CD150.
These results suggest that defects in protein folding and ligand binding collectively contribute to the loss of function of the SAP protein in these patients.


98. Porc-autoantigének thymuson belüli ectopiás expressziójának vizsgálata (P54)

Valkó Luca, Nagy Orsolya, Mazán Mercédesz, Falus András, Buzás Edit
Semmelweis Egyetem, Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet, Budapest
 
Az avascularis hyalinporc molekulái arthritisben autoimmun reakciók támadáspontjává válhatnak.
Míg részlegesen deglikozilált humán aggrekán ismételt intraperitonealis oltásával arra érzékeny egértörzsekben krónikus, progresszív polyarthritis indukálható, addig sem a natív, sem a részlegesen deglikozilált egéraggrekánnal végzett hiperimmunizálás nem idéz elő hasonló tüneteket.
Munkánk során az immunprivilegizált porcalapállomány molekuláival szemben kialakuló immuntolerancia mechanizmusát vizsgáltuk BALB/c egérben.
Egéraggrekánnal végzett oltást követően a periférián a TGF-b-, az IL-10-, a CTLA-4- és a foxp-3-expressziónak, illetőleg a CD3+/CD4+/CD25+ sejtek arányának változását vizsgáltuk. Eredményeink nem igazoltak jelentősebb expressziós vagy sejtpopulációs változást az egéraggrekánnal végzett immunizálást követően.
A továbbiakban a porc makromolekuláival szemben kialakuló centrális tolerancia lehetőségét vizsgáltuk. Nested RT-PCR, illetőleg realtime PCR segítségével elsőként sikerült igazolnunk az aggrekán és a II. típusú kollagén thymuson belüli ectopiás expresszióját.
Eredményeink arra utalnak, hogy míg az aggrekán thymuson belüli ectopiás expressziójában az aire és a Sox9, addig a II. típusú kollagénében a Sox9 transzkripciós faktor játszik szerepet.
A fentiek alapján feltételezzük, hogy az immunprivilegizált porc autoantigénjeivel szembeni centrális tolerancia jelentős szerepet játszhat a porcepitópokkal szembeni autoreaktivitás szabályozásában.
 


Ectopic thymus expression of cartilage autoantigens
Molecules of the avascular hyaline cartilage are potential targets of autoimmune reactions in arthritis. While repeated intraperitoneal immunizations with partially deglycosylated human aggrecan lead to the development of a chronic, progressive polyarthritis in susceptible mouse strains, hyperimmunization with either native or partially deglycosylated self (murine) aggrecan did not elicit arthritic symptoms.
Thus, we investigated immune tolerance mechanisms towards molecules of the immune privileged cartilage matrix in BALB/c mice. In the periphery we tested changes in the expression of TGF-b, IL-10, CTLA-4 and foxp-3 as wells as in the frequency of CD3+/CD4+/CD25+ cells after immunization with mouse aggrecan. Our results did not reveal any significant changes in the above parameters upon injection with the self cartilage proteoglycan. Next, we investigated if central tolerance could possibly develop to cartilage macromolecules. Using nested RT-PCR as well as real-time PCR we could prove intrathymic ectopic expression of both cartilage aggrecan and type II collagen.
Our results suggest that transcription factor Sox9 is a positive regulator of the ectopic thymic expression of both aggrecan and collagen. Furthermore, expression of aggrecan is also positively regulated by the transcription factor aire.
Based on the above results we hypothesize that central tolerance may play a significant role in regulation of autoimmunity towards immunosequestred self epitopes of hyaline cartilage.


99. Az intracelluláris hisztamininhibitorok hatása a humán cd34-pozitív, illetve a monocyta eredetű dendritikus sejtek érésére
(P63)

Veszely Gizella, Fent János, Lakatos Zsuzsanna, Fűrész József
Magyar Honvédség, Egészségvédelmi Intézet, Kórélettani Kutató Osztály, Budapest

A hisztaminnak a dendritikus sejtek érési folyamatában játszott szerepe tisztázására a hisztamin kötődését gátló DPPE [N’ N’-diethyl-2-4-(fenilmetil) fenoxietán-amin-HCl], illetve a hisztidin-dekarboxiláz enzimet gátló a-fluorometil-hisztidin (a-FMH) hatását vizsgáltuk monocyta-, illetve CD34+ eredetű tenyészetekben. A monocytákat az első három napban, a CD34+ sejteket az első öt napban GM-CSF és IL-4 jelenlétében tenyésztettük, ezt további két napig úgynevezett maturációs koktéllal (TNF-a, IL-6, IL-1b és prosztaglandin E2) egészítettük ki. A monocyta eredetű dendritikus sejtek mindkét gátlószer jelenlétében a 7. napon jellegzetes, az éretlen és a teljes érés közötti állapotnak megfelelő morfológiát mutattak. A 7. napon a CD83-pozitivitást mutató érett sejtek aránya 49–88% volt. A gátlószerek jelenléte nem változtatta meg a sejtfelszíni markerek expresszióját, és nem befolyásolta a sejteknek sem az IL-10-, sem az IL-8-termelését. A tenyészetekben nem tudtunk IL-12-termelést mérni. Ezzel szemben a CD34+ eredetű dendritikus sejtek morfológiája nagy heterogenitást mutatott: kerek és nyúlványos sejteket is megfigyeltünk. A CD34+ sejtek – ellentétben a monocytákkal – a rövid (egyhetes) tenyésztés során csak 2–11%-ban váltak CD83-pozitivitást mutató érett dendritikus sejtekké. A hisztamingátlószerek ezt nem befolyásolták. A kostimuláló molekulák és az adhéziós markerek expressziója, valamint a sejtek citokintermelése donorspecifikusan változott a hisztamingátlószerek hatására.
További kísérletek szükségesek annak eldöntésére, hogy a hisztamin kötődését, illetve szintézisét gátló anyagok jelenléte az érés kinetikájára vagy a teljes differenciálódásra hat-e.



Effect of intracellular histamine inhibitors on maturation of human CD34+ or monocyte derived dendritic cells

To reveal the effect of histamine on the maturation process of either monocyte or CD34+ derived dendritic cells histamine binding or synthesis were inhibited by the addition of the intracellular histamine antagonist {[N’-N’-diethyl-2-4-(phenylmethyl)-phenoxyethan-amine-HCl]:DPPE} or by the addition of histidine decarboxylase inhibitor (a-fluoromethyl histidine: a-FMH), respectively to culture media. Dendritic cells were cultured in the presence of GM-CSF and IL-4. In case of monocyte on the 3rd day and in case of CD34+ cells on the 5th day the culture medium was supplemented with a maturation cocktail containing TNF-a, IL-6, IL-1b and prostaglandin E2.
The presence of histamine binding and synthesis inhibitors (DPPE or a-FMH) in the culture medium resulted in monocyte derived dendritic cells with an intermediate morphology between that of the immature and fully matured ones. By the 7th day 44–88% of cells turned into CD83+, matured dendritic cells. The presence of inhibitors did not affect the surface antigen patterns, either IL-8 or IL-10 production of cells. None of these cultures produced IL-12 in a detectable amount.
The morphology of CD34+ derived dendritic cells was highly heterogeneous. Both spherical and extended, dendric cell shapes could be observed in the cultures. In contrast to monocyte derived cells, only 2–11% of the CD34+ derived cells became CD83+ matured cells in the course of a short (one week) maturation period independently of the presence of histamine inhibitors. However expression of costimulatory molecules and adhesion markers, as well as cytokine productions were donor dependent in the presence of histamine inhibitors. Further experiments are needed to decide whether inhibition of histamine binding or synthesis arrest the differentiation of dendritic cells or affect just the maturation kinetics.
 


100. A táplálékban található 1-es típusú interferon lehetséges szerepe az immunológiai autotolerancia kialakításában (P12)

Vizler Csaba
MTA-SZBK Biokémiai Intézet, Szeged

Irodalmi adatok szerint a kis dózisú, orális, 1-es típusú interferonnal végzett kezelés megakadályozhatja egyes kísérletes autoimmun betegségek kialakulását. Kevéssé ismert tény, hogy a táplálékként szolgáló állati szövetek interferontartalma elérheti ezt a biológiailag hatásos szintet. Mivel a különböző emlősfajok interferonjainál gyakori a keresztreakció, húsevő vagy mindenevő emlősök rendszeresen ki lehetnek téve az orális citokinok hatásos dózisainak. A tápálékban jelen lévő potenciális immunogének tipikusan immunológiai toleranciát indukálnak. Végeredményben a nyers állati eredetű táplálék potenciális autoantigénjeit biológiailag aktív citokinekkel együtt fogyasztják a húsevők, amelyek így különösen hatékonyan indukálhatnak toleranciát.
Ezt a hipotézist vizsgáltuk a kísérletes autoimmun agyvelőgyulladás (EAE) egy egérmodelljében. B6 egereket immunizáltunk MOG35–55 peptiddel, majd gyomorszondán keresztül kis mennyiségű (körülbelül 1/10 lépnek megfelelő) lépsejttel kezeltük őket. Ez hozzávetőleg megfelel a napi energiaigényét hússal fedező egér által naponta elfogyasztott fehérvérsejt-mennyiségnek. A kezelés az átlagos klinikai score enyhe csökkenését eredményezte.
A kísérleteket kis dózisú rekombináns egér eredetű a-interferonnal (10 egység/kezelés két naponta, 5×) és MOG35–55 peptiddel (100 µg/kezelés) is megismételtük. Mindkét kezelés kivédte a súlyos kísérletes autoimmun agyvelőgyulladás kialakulását.
Feltételezésünk szerint ragadozó és mindenevő emlősökben – őseinket is beleértve – az állati eredetű táplálékokban jelen lévő interfon részt vehet az immunológiai autotolerancia kialakulásában és fenntartásában.
 


Alimentary type I interferons may play a role in building up and maintaining immunological auto-tolerance
Type I interferons applied orally in very low doses may protect against experimental autoimmune diseases. An overlooked fact is that the interferon content of raw animal tissues serving as food may overlap with the therapeutical doses. Since interferons of different mammalian species are frequently cross-react, carnivorous or omnivorous mammals can regularly be exposed to biologically active doses of oral interferons. On the other hand, food antigens are known to induce immune tolerance rather than immune response. Consumption of raw meat containing potential auto-antigens dosed together with biologically active amounts of interferons may effectively induce immune tolerance to the potential auto-antigens.
This hypothesis was tested in a mouse model of EAE. EAE was induced in B6 mice with MOG35–55 peptide, then the mice were administered low quantities of normal syngenic spleen cells (corresponding to 1/10 spleen) via a gastric tube – this equals the average immune cell content of 4 g meat, corresponding to the daily food ration of an adult mouse. The treatment resulted in a slight decrease of average clinical score of EAE.
The experiments were repeated with low doses of recombinant mouse IFN-a (10 U/treatment, five times, every other day from day 0) and MOG35–55 peptide (100 µg/treatment). Both treatments prevented the development of severe EAE in B6 female mice.
Our hypothesis is that oral type I interferons might have a role in the development and maintenance of immunological auto-tolerance in carnivorous and omnivorous mammals, including prehistoric man.
 


101. A Toll-like receptor 4 Asp299Gly és Thr399Ile polimorfizmusainak szerepe spondylitis ankylopoeticában (P35)

Weiszhár Zsóka, ifj. Gergely Péter, Blazsek Antal, Poór Gyula
Országos Reumatológiai és Fizioterápiás Intézet, Budapest

Bevezetés:
A spondylitis ankylopoetica (SPA) ismeretlen eredetű, főként a gerincet érintő gyulladásos megbetegedés; etiopatogenezisében régóta felmerült az infektív ágensek szerepe. A Toll-like receptor 4 (TLR4) – a bakteriális sejtfalkomponensek felismerése révén – a Gram-negatív fertőzések elleni gyulladásos válasz megindításában vesz részt. A TLR4 +896A/G (Asp299Gly) és +1196T/C (Thr399Ile) mutációi emberben csökkentik az endotoxinokra adott reakcióképességet.
Célkitűzés: Azt vizsgáltuk, vajon a TLR4 Asp299Gly- és Thr399Ile-polimorfizmusai mutatnak-e összefüggést a spondylitis ankylopoetica előfordulásával, illetve a betegség klinikai paramétereivel.
Módszer: PCR-RFLP segítségével végeztük 96 spondylitis ankylopoeticában szenvedő és 81, nem gyulladásos, degeneratív eredetű reumatológiai (kontroll-) beteg genotipizálását.
Eredmények: Mindkét polimorfizmus esetében a heterozigóta allél gyakorisága kisebb volt a spondylitis ankylopoeticában szenvedő betegek körében, mint a kontrollcsoportban (+896A/G: 6,8% spondylitis ankylopoeticában, 14,8% kontrollokban, +1196T/C: 6,3% spondylitis ankylopoeticában, 12,3% kontrollokban). Az egyes genotípusok előfordulása és a vizsgált klinikai, illetve laboratóriumi paraméterek (axiális, perifériás, extraartikuláris érintettség, Schober-index, mellkasi kitérés, vörösvértest-süllyedés, CRP-szint, HLA-B27-pozitivitás, nem) között nem találtunk összefüggést.
Következtetés: Eredményeink alapján a TLR4 Asp299Gly- és Thr399Ile-polimorfizmusa fontos szerepet játszhat a spondylitis ankylopoeticára való genetikai fogékonyságban. A TLR4 patogenezisben betöltött szerepének tisztázásához további vizsgálatok szükségesek.
 


Potential role of Toll-like receptor 4 Asp299Gly and Thr399Ile polymorphisms in ankylosing spondylitis
Background: Toll-like receptor 4 (TLR4) is a potent activator of innate immunity and inflammation by binding bacterial cell wall components, exogenous and endogenous heat shock proteins. The +896 G allele (Asp299Gly) and +1196 T allele (Thr399Ile) in the TLR4 gene reduce the response to stimulation with LPS and probably endogenous ligands. Ankylosing spondylitis (AS) is an inflammatory disease of unknown etiology in which Toll-like receptors might play a role.
Objectives: Our aim was to investigate whether the TLR4 Asp299Gly and TLR4 Thr399Ile polymorphisms are associated with AS disease susceptibility and clinical features.
Methods: Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) was used to determine the genotypes of 96 patients with AS and 81 patients with non-inflammatory osteoarthritis as controls.
Results: We found that the frequencies of heterozygous genotypes of both polymorphisms (+896A/G and +1196T/C) were lower in AS compared to control samples (+896A/G: 6.8% in AS to 14.8% in control, +1196T/C: 6.3% in AS to 12.3% in control). We did not find any correlation between clinical manifestation (peripherial/extraarticular inflammation, Schober-index, chest expansion, age of onset, We, CRP, HLA-B27 positivity, gender) and the observed TLR4 polymorphisms.
Conclusion: According to our results TLR4 Asp299Gly and Thr399Ile polymorphisms may be important in the susceptibility of AS. Further studies are needed to determine whether the functional abnormalities mediated by Toll-like receptors play key roles in the etiopathogenesis.
 


102. Génexpressziós változások az egér mucosalis hízósejtek in vitro differenciációja során (P13)

Wiener Zoltán1, Keszei Márton1, Szalai Csaba2, Falus András1, 2
1Semmelweis Egyetem, Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet, 2MTA-Semmelweis Egyetem, Molekuláris Immunológiai Kutatócsoport, Budapest

A hízósejtek először az allergiás és asztmatikus folyamatokban játszott szerepük miatt váltak ismertté. Granulumaikban a hisztamin mellett más mediátorokat, valamint különböző citokineket előre gyártott formában (például TNF-a) is raktároznak. Ezek a citokinek a fertőzés helyén azonnal felszabadulnak, ezáltal a kórokozók elleni immunvédekezés egyik első lépését biztosítják. A hízósejtek aktuális citokintermelő képessége azonban jelentős mértékben a helyi mikrokörnyezettől függ.
Az egér hízósejtjei két alapvető csoportba sorolhatók: kötőszöveti és mucosalis típusú sejtek. Nemrég leírták, hogy TGF-bI és IL-9 jelenlétében in vitro érett mucosalis hízósejtek állíthatók elő, amelyek a jellegzetes egérhízósejt-proteázokat, az mMCP-1-et és mMCP-2-t expresszálják. Ezek alapján kísérleti célul a differenciálódó mucosalis hízósejtek génexpressziós változásainak vizsgálatát tűztük ki.
Balb/c nőstény egerek csontvelőiből a c-kit+ progenitor sejtfrakciót mágneses eljárással szeparáltuk, majd a sejteket IL-3, IL-9, SCF és TGF-bI jelenlétében differenciáltattuk. A mintavételi időpontok a differenciáció 4. (éretlen stádium), 9. (köztes stádium) és 20. (érett stádium) napjára estek. A génexpresszió vizsgálatát oligoneukleotid DNS-csippel (Agilent) végeztük el, majd néhány változást valós idejű PCR-technikával is megerősítettünk.
A 22 000 vizsgált gén közül több mint 1400 mutatott legalább 2,5-szeres expressziós emelkedést vagy csökkenést p<0,001-es szignifikanciaszinten. Az expressziós változás háromszázharminc gén esetében nem csak két időpont között volt jelentős. A citokinek és receptoraik közül jellegzetes expressziós változást tudtunk kimutatni az IL-4Ra, IL-18RI, IL-10Ra, IL-25, c-kit, IL-15, IL-3Ra, IL-11RaI és az IL-7R mRNS-szintjében. Az extracelluláris mátrix átalakításában fontos szerepet játszó mátrix metalloproteináz- (Mmp-) 13, Mmp-3, Mmp-14 és Mmp-12 termelődése is változott a különböző vizsgált időpontok között. Több integrin- és kemokinreceptor expressziójában szintén eltéréseket mutattunk ki. Az mMCP-proteázokat két csoportba lehetett sorolni: míg az mMCP-5 és mMCP-7 mRNS-szintje a korai differenciációs folyamatok során jelentősen megemelkedett, majd később nagyjából állandó maradt, addig az mMCP-1 és mMCP-2 esetében a jelentős expressziós növekedést csak a késői fázisban mutattuk ki. Érdekes módon a hisztamin bioszintéziséért felelős hisztidin-dekarboxiláz enzim szintje a hízósejtérés késői fázisában csökkent.
Minthogy az adatok feldolgozása és csoportosítása még folyamatban van, további érdekes felfedezések is várhatók.
 


Gene expression profiling of mucosal mast cell homologues during in vitro differentiation
Mast cells were first discovered as important participants in the allergic and asthmatic reactions. They store histamine and other mediators, as well as pre-made cytokines (for example TNF-a) in their granules. These cytokines are released immediately at the site of infection, thereby providing the first step in the anti-pathogen defence of our body. However, the actual mediator content and cytokine producing ability of mast cells greatly depends on the local environment.
Mouse mast cells can be clustered into two main groups: mucosal and connective-tissue mast cells. Recently it has been published that TGF-bI and IL-9 are needed to obtain mucosal-type mast cells in vitro which can be characterized by their mouse mast cell protease (mMCP)-1 and -2 expression. Based on these results we aimed to determine the gene expression profile changes of differentiating mucosal mast cells.
The c-kit+ progenitor fraction was separated by magnetic coloumns from the bone marrows of Balb/c female mice. Cells were differentiated in the presence of IL-3, stem cell factor, IL-9 and TGF-bI. Samples were taken on day4 (immature state), d9 (intermediate state) and d20 (mature state). For the DNS-microarray analysis the Agilent Mouse Toxicology microarrays were used. Some interesting results were validated by real-time PCR method.
More than 1400 out of the 22 000 genes had >2.5 fold increase or decrease at a significance level of p<0.001. Among them, 330 showed differential expression between more than two time points. Among the cytokines and their receptors a characteristic expression change can be observed in the level of IL-4Ra, IL-18RI, IL-10Ra, IL-25, c-kit, IL-15, IL-3Ra, IL-11RaI and IL-7R. The expressions of matrix metalloproteinase (Mmp) -13, Mmp-3, Mmp-14 and Mmp-12 are also changing over time. There are more integrins and chemokine receptors which also show differential gene expression. Mouse mast cell proteases can be clustered into two groups: while the levels of mMCP-5 and -7 are increasing during the early differentiation phase and remain thereafter constant, only a late expression “burst” can be detected in case of mMCP-1 and -2. Somehow surprisingly, the level of histidine decarboxylase (HDC) is decreasing in the late phase of maturation. Further detailed data clustering processing is still under progress.