ABSZTRAKTOK
  
A Magyar Immunológiai Társaság XXXIII. Vándorgyűlése
Győr, 2003. október 15-17.
 
 
 


Magyar Immunol/Hun Immunol 2003;2 (3): 10-58.

1. Immunológiai eltérések Hodgkin-kórban (P37)
Aleksza Magdolna, Miltényi Zsófia, Keresztes Katalin, Sipka Sándor, Illés Árpád
Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum, III. Sz. Belgyógyászati Klinika

Munkánk során 127, komplett remisszióban lévő, Hodgkin-kórban szenvedő beteg sejtfelszíni CD markereit és intracitoplazmatikus, valamint szolúbilis citokinszintjeit vizsgáltuk áramlási citométerrel és ELISA technikával.

Hasonlóan az irodalmi adatokhoz, az egészséges kontrollok eredményeihez képest csökkent a CD3+ T-sejtek aránya, ezen belül csökkent a T-helper és fokozódott a T-citotoxikus sejtarány. A B- és NK-sejt aránya fokozódott. Az intracitoplazmatikus citokinekkel kapcsolatban eddig nem álltak rendelkezésre irodalmi adatok. A CD4+ és a CD8+ sejtek stimulációra bekövetkezett IFN-gamma-expressziójában nincs eltérés a referens egyénekhez képest, azonban a T-helper sejtek IL-4-expressziója csökkent. A CD4+ és a CD8+ sejtek IL-10-expressziója egyaránt szignifikánsan emelkedett. A szolúbilis IFN-gamma-, IL-4- és IL-10-szintek nem követik az intracitoplazmatikus változásokat.

Munkánk során arra is választ kerestünk, hogy a tapasztalt immunológiai eltéréseket okozhatta-e Helicobacter pylori-(HP-) fertőzés. A HP-átfertőzöttség és az eltérések között nem tapasztaltunk összefüggést, míg a 13C-ureakilégzési teszttel kimutatott friss Helicobacter pylori-fertőzött Hodgkin-kóros betegek CD8+ sejtjeinek IFN-gamma-expressziója szignifikánsan magasabb volt, mint a nem fertőzött betegcsoporté.



2. A reumafaktor és az anti-CCP-antitest meghatározása rheumatoid arthritisben szenvedő betegek szérumából (E30)
Aleksza Magdolna, Sipka Sándor, Szekanecz Zoltán
Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum, III. sz. Belgyógyászati Klinika

A rheumatoid arthritis diagnosztikája elsősorban a klinikai tüneteken alapul. A szérum reumafaktor- (RF-) koncentrációjának meghatározása az egyetlen olyan szerológiai teszt, amellyel a laboratórium is hozzá tud járulni a diagnózis felállításához. Azonban az RF viszonylag nagy százalékban kimutatható egyéb autoimmun megbetegedésekben, infekciókban, idősebb referens egyének szérumában is. A rendkívül jó specificitású és a betegség aktivitásával korrelációt mutató anti-CCP-antitest meghatározása újabb lehetőséget jelenthet a rheumatoid arthritis diagnosztikájában.

Korai rheumatoid arthritisben szenvedő 44 beteg, valamint 35 egészséges kontrollszemély szérumából végeztünk anti-CCP-antitest-meghatározást ELISA technikával (Euro-Diagnostica), valamint reumafaktor-meghatározást turbidimetriával.

A 44 beteg közül 20 bizonyult anti-CCP-antitest-pozitívnak (45,4%), míg az egészséges kontrollok közül egy esetben kaptunk pozitív eredményt. Az RF meghatározása során a betegek 47,7%-a mutatott pozitivitást (21/44); a referens egyéneknél nem találtunk RF-pozitív szérumot. Az anti-CCP-antitest és az RF koncentrációja egymással jól korrelált; a betegség fennállásának ideje nem mutatott korrelációt sem az anti-CCP-antitest, sem az RF koncentrációjával.

Az anti-CCP-antitest meghatározása hasznos segítséget nyújthat a rheumatoid arthritis diagnózisának felállításában.

Rheumatoid factor and anti-cyclic citrullinated peptide (anti-CCP) antibody in serum of patients with early rheumatoid arthritis

The diagnosis of rheumatoid arthritis (RA) depends primarily on clinical manifestation of the disease. The only serological test used routinely is the determination of the presence of rheumatoid factor (RF) in serum. However, this antibody is also presents in relatively high percentages in other autoimmune diseases, infections and older healthy individuals. Anti-CCP antibodies were recently incorporated into newly proposed diagnostic criteria for RA for their high specificity and strong association with erosive diseases.

We studied sera in 44 patients with early RA and 35 healthy donors as control. Anti-CCP antibody was measured by ELISA (Euro-Diagnosztika) and RF by turbidimetry.

Anti-CCP antibody was present in 20 patients (45.4%) with early RA, whereas it was positive only in one control subject. 21 of RA patients were RF positive (47.7%), all controls were negative. The serum levels of anti-CCP highly correlated with serum levels of RF. There was no correlation between the duration of disease and the levels of anti-CCP and RF.

These results support the earlier findings on the usefulness of anti-CCP measurements in diagnosis of RA.



3. A természetes immunrendszer komponenseinek vizsgálata poly- és dermatomyositises betegek esetében (E1)
Antal-Szalmás Péter1, Sümegi Andrea1, Sarudi Sára1, Sipka Sándor2, Dankó Katalin2
Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum,
1Klinikai Biokémiai és Molekuláris Patológiai Intézet;
2III. Sz. Belgyógyászati Klinika

A sejtfelszíni CD14/Toll-szerű receptor (TLR) komplex a myeloid sejtek aktiválódásának egyik fontos útvonala. Számos autoimmun betegség esetében írták le e sejtek CD14-expressziójának változásait és a szérum sCD14-szintjének emelkedését. Munkánk során e paramétereket és a CD14 gén C-159T-polimorfizmusának megoszlását vizsgáltuk 35 polymyositises (PM) beteg (10 aktív stádiumban - aPM, 25 inaktív stádiumban - iPM), 20 dermatomyositises (DM) beteg (9 aDM, 11 iDM) és 17 egészséges kontroll mintáiban. Az sCD14-koncentrációt egy korábban kidolgozott áramlási citometriás módszerrel, a CD14-izotípusok megoszlását immunoblotting segítségével határoztuk meg. A teljes vérben lévő fehérvérsejtek CD14-expresszióját QIFIKIT beadek és citofluorometria segítségével kvantitáltuk. A CD14 gén promóterrégiójának polimorfizmusát PCR+RFLP módszerrel azonosítottuk. A monocyták és PMN-ek sejtfelszíni CD14-expressziója mindkét betegcsoportnál az inaktív betegek esetén mutatott emelkedett értéket, a kontrollokhoz és az aktív betegekhez képest. Ezzel szemben a szérum sCD14-szintjét aPM-ben és aDM-ben találtuk emelkedettnek; az emelkedésért a sejtek által közvetlenül szekretált 56 kDa-os sCD14 izotípus fokozott ürítése lehet felelős, mert az aktív betegeknél ennek aránya emelkedett. Bár a CD14 gén promóterrégiójának genotipizálása polymyositisben és dermatomyositisben egyaránt a C allél frekvenciájának emelkedését mutatta a kontrollokhoz képest, de az sCD14-szintek és a sejtek CD14-expressziója nem mutatott szignifikáns összefüggést az egyes genotípusokkal.

Eredményeink alapján megállapítható, hogy az inaktív stádiumú myositises betegek leukocytáin emelkedett a CD14-molekulák száma; a betegség akut fázisában az intracelluláris CD14 fokozott direkt szekréciója eredményezheti az emelkedett szérum-sCD14-szintet, és részben hozzájárulhat a leukocyták csökkent CD14-expressziójához.

Alterations in the components of the natural immune system in patients suffering from poly- and dermatomyositis (PM and DM)

The cell-surface CD14/Toll like receptor (TLR) complex is an important pathway in the activation of myeloid cells. Several autoimmune disorders are characterized by altered CD14-expression on these cells and by elevated serum sCD14 concentrations. We determined these parameters and the distribution of the C-159T polymorphism in samples of 35 PM patients (10 in active state - aPM, 25 in inactive state - iPM), 20 DM patients (nine aDM, 11 iDM) and 17 healthy controls. The sCD14 concentrations were calculated by an inhibitory flow cytometric method and the rate of the sCD14 isoforms by immunoblotting. The CD14-expression of whole blood leukocytes were quantitated by the QIFIKIT bead set and cytofluorometry. The CD14 promoter region polymorphism was assessed by a PCR+RFLP assay.

In both patient groups in samples of the inactive patients monocytes and PMN showed reduced CD14-expression compared to the leukocytes of active patients and controls. In contrast the serum sCD14 values were higher in aPM and aDM and this increase might be explained by the enhanced secretion of the 56 kDa isoform of CD14, as the rate of it was elevated in the active patients. Though the genotyping of the CD14 gene promoter polymorphism showed that frequency of the "C" allele was higher in PM and DM but the sCD14 levels and CD14-expression did not show significant correlation with the different genotypes. Our results suggest an increased expression of CD14 on leukocytes in inactive myosits patients and the enhanced direct secretion of the intracellular CD14 might explain the elevated serum sCD14 levels and might partly contribute to the lower CD14-expression of leukocytes observed in active patients.



4. A lymphotoxin-béta-szignalizáció és az NKX2.3 homeodomén faktor eltérő szerepe a lépendothel-kompartmentek képződésében (E8)
Balogh Péter1, Balázs Mercédesz1, Debra S. Weih2, Hans-Henning Arnold3, Browning L. Jeffrey4, Falk Weih2
1Pécsi Tudományegyetem, Immunológiai és Biotechnológiai Intézet, Pécs;
2Forschungszentrum Karlsruhe, Department of Toxicology and Genetics, Karlsruhe;
3Technical University of Braunschweig, Institute for Biochemistry and Biotechnology, Department of Cell and Molecular Biology, Braunschweig, Németország;
4Department of Exploratory Biology, Biogen, Cambridge, MA

A külső antigének hatékony felismeréséhez és eltávolításához elengedhetetlen az adaptív immunrendszert alkotó lymphoid és járulékos sejteknek a nyirokszövetek megfelelő anatómiai kompartmentekbe való elrendeződése. A különböző perifériás nyirokszövetek szerkezete között fennálló jelentékeny különbségek ellenére két alapvető jellegzetesség mindegyikben megtalálható: az egyik az érpálya specializált elemeivel való kontaktus révén megvalósuló sejtbeáramlás, a másik a nyirokszöveteket alkotó stromalis és mobilis haemopoeticus sejtek irányított és kapcsolt elkülönülése.

Jelen munkánkban a lymphotoxin-béta-receptor (LTbétaR) ligandkötésének és az NKX2.3 homeodomén transzkripciós faktor expressziójának szerepét vizsgáltuk az egérlép érképződésének szabályozásában, az egyes érelemeket borító endothelsejtekre specifikus monoklonális patkányantitestek segítségével (IBL-7/1: marginális sinus és vöröspulpa-sinus alcsoport; IBL-9/2: vöröspulpa-komplementer sinus alcsoport; MAdCAM-1: marginális sinus; IBL-7/22: panendothel marker). Egy blokkoló hatású szolúbilis LTbétaR-Ig fúziós fehérje újszülöttkori alkalmazása, valamint az LTbétaR általi jelátvitelben szereplő NFkappaB komplex egyes tagjainak deletiója egyaránt megakadályozta a marginális sinus fenotípusérését, ugyanakkor nem befolyásolta a vörös pulpa érfejlődését és kompartmentalizációját. Ezzel ellentétben a vörös pulpa érdifferenciálódása nagymértékben függött az NKX2.3 jelenlététől; ennek hiányában az IBL-7/1- és az IBL-9/2-pozitív sinusalcsoportok megoszlása a normálistól jelentékenyen eltérőnek bizonyult. Emellett az NKX2.3 a marginálissinus-endothel fenotípuséréséhez is szükségesnek tűnt, hiányában a marginális sinust bélelő sejtek felszínén nem expresszálódott sem a MAdCAM-1 antigén, sem az IBL-7/1, valamint az IBL-7/22 marker. Adataink az eltérő anatómiai területekben elhelyezkedő, különböző immunfenotípust mutató endothelsejtek eltérő differenciálódási szabályozására utalnak.
 
Distinct roles for lymphotoxin-beta signalling and homeodomain factor NKX2.3 in the formation of splenic endothelial compartments

The formation of organised peripheral lymphoid tissues is indispensable for the efficient recognition and elimination of external antigens by the lymphoid and accessory cells of adaptive immune system. Despite the considerable structural differences existing between the various secondary lymphoid tissues, they share two common features: one is the continuous influx and traffic of lymphocytes involving specialised vascular elements, the other is the directed segregation of both their sessile (mesenchymal) and mobile (haemopoietic) cellular constituents. In this work we investigated the importance of lymphotoxin b receptor (LTbetaR) engagement and the role of NKX2.3 transcription factor in the formation of murine splenic vasculature using rat monoclonal antibodies directed against various endothelial subsets (IBL-7/1 against marginal sinus and red pulp subset, IBL-9/2 against a complementary red pulp subset, MAdCAM-1 against marginal sinus and IBL-7/22 against a pan-endothelium marker, respectively). We found that both the neonatal administration of soluble LTbetaR-Ig fusion protein or the deletion of various LTbetaR-linked signalling components of the NFkappaB family inhibited the phenotypic maturation of marginal sinus, but had no effect on the vascular compartmentalisation of the red pulp. Moreover, the marginal sinus integrity also appeared to be controlled by the NKX2.3 transcription factor, as its lack resulted in the lack of the expression of MAdCAM-1, IBL-7/1 and IBL-7/22 markers from the sinus-lining cells. However, the presence of NKX2.3 transcription factor also proved necessary for the proper segregation of red pulp sinus subsets, as judged by the disproportionate distribution of IBL-7/1 and IBL-9/2 positive subsets. Our data indicate that the phenotypic heterogeneity of different vascular elements at distinct anatomical locations reflects their distinct developmental pathways.



5. Komplementparaméterek - CH50, C3, C4 - követéses vizsgálata malignus lymphomában szenvedő betegek autológ haemopoeticus őssejt-transzplantációja során (P5)
Bányai Anikó1, Varga Liliann2, Barta Anikó1, Gopcsa László1, Pálóczi Katalin3
1Országos Gyógyintézeti Központ, Immunológiai és Allergológiai Osztály, Budapest;
Semmelweis Egyetem, ÁOK,
2III. Sz. Belgyógyászati Klinika,
3Immunológiai-Hematológiai-Transzfuziológiai Tanszéki Csoport, Budapest

Malignus lymphomában szenvedő betegeknél a komplementrendszer szerzett deficientiája az immunrendszer effektor- mechanizmusainak defektusához vezethet, fokozva ezáltal a súlyos infekciós szövődmények kialakulásának veszélyét. Munkánk célja a komplementfunkciók és -komponensek, így a CH50-, C3-, C4-szérumszint, valamint a keringő immunkomplexek (CIC) szintjének mérése szövődménymentes autológ haemopoeticus őssejtátültetés (auto-BSCT) során, összehasonlítva azokat a néhány szövődménnyel kísért esetben mért értékekkel.

A komplementparaméterek változásait 14, malignus lymphomában szenvedő beteg szövődménymentes transzplantá-ciója során követtük, 1995-2001 között. A betegek lymphomájuk első vagy második komplett remissziójában voltak. A kondicionáló kezelés 11 esetben BEAM protokoll, három beteg esetén teljestest-besugárzás és cyclophosphamidterápia volt. A transzplantáció mind a 14 betegnél teljes remissziót eredményezett.

További három beteg adatait követtük még. Közülük két betegünk súlyos korai szeptikus-toxikus tünetek miatt meghalt, egy nőbetegnél a relapsus gyors kialakulását észleltük.

A transzplantáció előtt a -7. napon normális CH50-, C3-, C4- és CIC-értékeket mértünk. A nagy dózisú kondicionáló kezelés után, a -2. napon a CH50- és C3-, C4-szintek csökkentek; a CH50- és a C3-szint mérséklődése szignifikánsnak bizonyult (p<0,05). A transzplantációt követő 7. és 21. napon az értékek mérsékelt növekedését észleltük. A 35. és 42. napon a paraméterek hasonlóvá váltak a kiindulási, a -7. napi értékekhez. Egy nőbeteg esetében a transzplantációt követő második hónapban a CH50-, C3-, C4-szint szignifikánsan csökkent, megelőzve a lymphoma kiújulását. A CIC-értékekben lényeges változás nem mutatkozott.

Két másik szövődményes transzplantáció során a betegeket a 7. és 11. napon súlyos szeptikotoxikus állapot miatt elveszítettük; értékeikben a CH50- és C3-szint jelentős emelkedését figyeltük meg a transzplantáció után (p<0,01).

Az adatokat összegezve az autológ haemopoeticus őssejtátültetés nem okozott súlyos komplementdeficientiát a betegeknél. Szövődménymentes esetekben sem aktiváció, sem consumptio, sem nagymértékben károsodott termelődés bizonyítékait nem találtuk. Ismert, hogy a komplementrendszer komponensei fontos résztvevői a súlyos akut citokinreakcióknak, az ezáltal kialakuló szövetkárosodások és a halálos kimenetelű többszervi elégtelenség esetén hasítási termékeik szintje jelentősen emelkedik. Két, szövődményben szenvedő betegünk esetében a súlyos szeptikotoxikus állapotot komplementaktiváció és emelkedő szérumszintek jellemezték. Fontos lehet a komplementparaméterek mérése olyan esetekben is, ahol a lymphoma relapsusának korai jeleként észlelhető a normalizálódott szintek transzplantációt követő csökkenése. Az aktiváció és emelkedett szérumszintek előre jelezhetik a szeptikotoxikus állapot kialakulását.

Támogatás: NKFP 1/024/2001.

Longitudinal measurements of complement functions and complement components C3, C4 during the autologous bone marrow transplantation of patients with malignant lymphomas

Acquired deficiencies of complement system observing in the malignant lymphomas suggest abnormalities in the effector mechanisms of the immune system and predispose to serious infections. The aim of this study was to determine the complement functions and serum levels of the complement components C3 and C4 during the autologous bone marrow transplantation (ABMT) with or without infections complications.

Fourteen lymphoma patients in the first or second complete remission transplanted between 1995 and 2001 were involved in this study by their complications free transplant state. BEAM protocol was used for conditioning regimen in 11 cases and total body irradiation with cyclophosphamide in three cases. ABMT resulted in complete remission in all 14 patients. Laboratory data of two toxic infectious transplant patients were also analysed.

Normal values of CH50, CIC, C3 and C4 in sera of patients were detected on day -7 before the ABMT. After the high dose conditioning treatment (on day -2 pre-transplant) the activity of CH50 and levels of C3 and C4 decreased significantly (p<0.5).

On days 7 and 21 the CH50, C3 and C4 levels showed a moderate increase. On days 35 or 42 these values showed a tendency to be normal and were similar to that on day -7. A transplant patient showed significant decrease in her CH50, C3 and C4 levels after three months post-ABMT as an early sign of relapse. The changes of CIC levels were not significant during the period examined. In two transplant patients suffering from toxic infectious state and early toxic death, elevated CH50 and C3 levels were documented during the post-transplant period (p<0.1).

The ABMT as a procedure can not be regarded as a cause of the acquired deficiencies of complement functions. We did not find any evidences of the consumption or activation caused decreases in the complement levels in 14 patients during ABMT. Because the complement components would be important participants in the serious acute cytokine mediated reactions causing tissue damages and fatal multiorgan failure the measure of complement parameters seems to be important. The later decrease of the normalized complement values would be the sign of the relapse. However, in case of severe toxic-infectious complication the complement system become activated but the outcome of this complication depends on other cellular and humoral abnormalities of the recovering immune system.

Supported by grant 1/024/2001 Hungarian NKFP.



6. A humán B-sejtek által termelt szerin-proteáz jellemzése és sejtfelszíni szubsztrátjainak azonosítása (P24)
Barad Zsuzsanna1, Janáky Tamás2, Gráf László3, Sármay Gabriella1
Eötvös Loránd Tudományegyetem, Természettudományi Kar,
1Immunológiai Tanszék,
3Biokémia Tanszék, Budapest;
2Szegedi Tudományegyetem, Orvosi Vegytani Intézet

Proteolízis következtében megváltozhat a sejtfelszíni fehérjék összetétele: szolúbilis receptorformák keletkezhetnek, így az immunválasz során e folyamat fontos szabályozófunkciót tölthet be.

A membránfehérjék lehasadását általában a sejt aktiválódása előzi meg. Számos Fc-receptorról ismert, hogy létezik szolúbilis formája; a kis affinitású Fcgamma-receptorok (sFcgamma) szolúbilis formáinak megjelenését a sejtek felülúszójában leírták aktivált T- és B-sejtek, macrophag- és monocyta-sejtvonalak és polimorfonukleáris sejtek esetében. Megfigyelték, hogy a humán FcgammaRII leválása az aktivált B-sejtek és Langerhans-sejtek membránjáról szintén proteolyticus folyamat eredménye. A hasítás helye és az ebben részt vevő enzimek szerepe nem pontosan ismert.

Munkacsoportunk korábban leírt egy proteázt az aktivált B-sejtek felszínéről és a sejtek felülúszójából. A továbbiakban a membránfehérjék leválásának körülményeit vizsgáltuk. Különböző gátlószerek B-sejtekre gyakorolt hatását hasonlítottuk össze. Megállapítottuk, hogy egy Ca2+-függő, tripszinszerű szerin-proteáz felelős a membránmolekulák hasításáért; a metalloproteázok szerepét kizártuk ebben a folyamatban.

Affinitáskromatográfia segítségével szójatripszin-inhibitorral fedett Sepharose gyöngyökön tisztítottuk az enzimet BL41/95 Burkitt-lymphoma-sejtvonal sejtjeinek felülúszójából. A 85-90 kDa tömegű enzim zselatinázaktivitása alapján kimutatható a zimogramon. Nyugvó fenotípusú, a proteázt nem expresszáló sejtekhez adva az enzim számos membránfehérje leválását katalizálja. A proteolízissel keletkező szolúbilis molekulák azonosítását Western-blot módszerrel és tömegspektrometriás analízissel kíséreltük meg. FcgammaRIIb-specifikus monoklonális ellenanyag segítségével Fc-receptor-fragmenteket detektáltunk a sejtek felülúszójából, a továbbiakban IgG-fragmenteket azonosítottunk tömegspektrometria módszerrel.

Eredményeink szerint az aktivált típusú B-sejtek expreszszálnak egy tripszinszerű szerin-proteázt, ez befolyásolja a sejtfelszíni receptor-összetételt, szolúbilis formákat generál, így szabályozza a B-sejt-aktivációt.

Characterization of a serine protease and its substrates expressed on B cells

Proteolysis plays an important regulatory role during immune response, influencing the expression and/or activity of membrane molecules and generating soluble receptors forms, which can bind ligands in the fluid phase.

The release of membrane proteins is usually initiated by cell activation. Soluble forms of the low-affinity Fcgamma receptors (sFcgammaR) have been found in supernatants of cells of the immune system such as activated T and B cells, macrophage and monocyte cell lines, and polymorphonuclear cells. Release of human soluble FcgammaRII from cell membrane as a result of proteolytic cleavage was also observed from activated B cells and from Langerhans cells. Very little is known about the precise cleavage site and the enzyme(s) involved in soluble Fcgamma receptor production.

Previously we described a surface expressed and secreted protease on activated B cells. We have examined further the conditions of the release of membrane proteins due to proteolytic cleavage. Comparing the effects of various inhibitors we have proved that the enzyme responsible for the release of membrane proteins is a calcium dependent tryp-sine-like serine protease. Furthermore, we excluded that metalloproteinases have any role in the cleavage. We isolated the protease from the supernatant of BL41/95 Burkitt lymphoma cell line by affinity chromatography using soy been trypsin inhibitor-coated Sepharose beads. The 85-90 kDa protease excerted a gelatinolytic activity. When added to cell, which does not express it, the protease cleaved several proteins from the cell surface. We have attempted to identify the released proteins by Western blot and by mass spectrography. Fragments of FcgammaRIIb were isolated and identified by using FcgammaRIIb specific monoclonal antibody. Further, we found IgG fragments in the supernatants of BL41/95 cells corresponding to sequences in IgG Fc.

These results indicate that activated B cells express a typsin-like serine protease, which can produce soluble forms of membrane receptors, thus regulating B cell activation.



7. A CD4+CD25(high) szabályozó T-sejt-populáció aránya plazmaferetizált és nem plazmaferetizált SLE-s betegek esetén (E36)
Baráth Sándor, Kiss Emese, Aleksza Magdolna, Soltész Pál, Zeher Margit, Sipka Sándor, Szegedi Gyula
Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum, III. Sz. Belgyógyászati Klinika

Bevezetés: A CD4+CD25+ szabályozó T-sejtek kiemelkedő szerepet játszanak az immunregulációban. Az autoreaktív T-sejtek aktivációjára és proliferációjára szuppresszor hatást fejtenek ki, ezáltal részt vesznek az autoimmun betegségek létrejöttének megakadályozásában. A szisztémás lupus erythematosus (SLE) multifaktoriális kóreredetű, poliszisztémás autoimmun megbetegedés; gyulladásos elváltozásokat legfőképpen a bőrben, a vesében, az ízületekben és a központi idegrendszerben okoz; szinte valamennyi szervet érintheti, leginkább a fiatal felnőttkorú nőknél alakul ki. A betegség kezelésére jó terápiás módszer a plazmaferézis.

Cél: Kérdésünk, hogy befolyásolja-e a plazmaferézis a CD4+CD25(high) sejtpopulációt.

Módszer: Plazmaferézisen átesett (n=4) és át nem esett (n=12), SLE-ben szenvedő betegek esetén teljes vérben, áramlási citometriás módszerrel vizsgáltuk a CD4+CD25(high) szabályozó T-sejt-arányokat a CD4+ sejtpopuláción belül, s ezeket az eredményeket egészséges kontrollpopulációval (n=32) vetettük össze.

Eredmények: A kontrollcsoportot az SLE-s csoporttal összehasonlítva, az irodalmi adatoknak megfelelően, a sejtarány szignifikánsan kevesebbnek bizonyult (kontroll: 4,55±0,39%, SLE: 3,21±0,31%, p=0,038). Új eredményként sikerült kimutatni, hogy a plazmaferézis jelentősen növeli a szuppreszszorsejtek arányát. A kezdeti 2,5-3,8%-os CD4+CD25(high) sejtarány a kezelésekkel fokozatosan növekedett, s a kezelés befejezésekor 8,8-16,8%-os szintet ért el.

Következtetés: Ez az első megfigyelés a plazmaferézisnek a CD4+CD25(high) szuppresszor T-sejt-arányt emelő hatására. A CD4+CD25(high) T-sejt-arány emelkedése valószínűleg az egyik tényező az SLE-s betegek plazmaferézissel végzett kezelésének hatékonyságában.

Percent of CD4+CD25(high) regulatory T cells in SLE patients treated with plasmapheresis and non-plasmapheresis

Background: CD4+CD25+ regulatory T cells play an important role in immune regulation. They have got suppressor effect on the activation and proliferation of autoreactive T cells, hereby they can pervent autoimmune disorders. Systemic lupus erythematosus (SLE) is a multifactorial, polysystemic autoimmune disease which causes inflammation in skin, kidneys, joints and central nervous system but can affects all other organs. Most frequently it appears in young, adult women. Plasmapheresis is a useful therapeutical tool to treat the patients with severe forms of SLE.

Aim: Has plasmapheresis got some effect for CD4+CD25(high) regulatory T cells?

Methods: We measured the proportion of CD4+CD25(high) T cells in CD4+ T cells population by flow cytometry in whole peripheral blood of SLE patients treated with plasmapheresis (n=4) and non-plasmapheresis (n=12). We compared the results with a control population (n=32).

Results: The proportion of CD4+CD25(high) T cells was significantly lower in SLE population than in control population (control: 4.55±0.39%, SLE: 3.21±0.31%, p=0.038). There was a new observation that plasmapheresis could increase the proportion of CD4+CD25(high) T cells population. The basic 2.5-3.8% level increased by plasmapheresis and at the end of treatment this average value reaches 8.8-16.8%.

Conclusion: These are the first data on the elevation of CD4+CD25(high) suppressor T cells by plasmapheresis in peripheral blood. This effect can contribute the beneficial therapeutic influence of plasmapheresis in SLE.



8. A glükokortikoid hormon hatása a T-sejt-receptor jelátviteli útra TCR transzgenikus egér thymocytáin (P25)
Berki Tímea, Pálinkás László, Boldizsár Ferenc, Németh Péter
Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Immunológiai és Biotechnológiai Intézet

A T-sejt-fejlődést az endogén és a terápiásan alkalmazott glükokortikoid hormon (GC) egyaránt befolyásolja: apoptózist okoz az éretlen thymocyta-előalakokon. Emellett helyileg képződő glükokortikoidhormon-termelődést is leírtak a thymusban. Még nem teljesen tisztázott e thymuseredetű glükokortikoid hormon fiziológiás szerepe a thymocytaérésben és -differenciálódásban. GC-receptor-gén- (GCR-) kiütött egerek esetében normális T-sejt-differenciálódást írtak le. Saját korábbi munkánk alapján is a legalacsonyabb GCR-szintet - mind fehérje-, mind mRNS-szinten - a legérzékenyebb kettős pozitív (DP) thymocyta-alcsoport expresszálja. Az úgynevezett "kölcsönös antagonizmus" modell képviselői leírják, hogy a glükokortikoid hormon hatásával felfüggeszthető a T-sejt-receptor (TCR) indukálta apoptózis, ezáltal a thymocyták pozitív szelekcióját okozva. A fejlődő thymocyták túlélése a pozitív és a negatív szelekcióban a TCR jelátviteli útjától függ. A TCR és a glükokortikoid hormon okozta szignál közti párbeszédet már leírták T-sejt-hibridoma-sejteken is: a két jelátviteli út önmagában apoptózist okoz, míg együtt a T-sejtek túlélését segítik elő.

Jelen munkánkban az antigén (TCR) és a glükokortikoid hormonnal végzett kezelés hatását vizsgáltuk a fejlődő thymocyták túlélésére és szelekciós lépéseire, egy TcR-AND transzgenikus [galamb-citokróm C- (PCC-) specifikus Vbéta3-TCR] egérmodell felhasználásával. Az állatokat antigénnel (PCC) vagy glükokortikoidhormon-analóggal (dexamethason, DX) kezeltük, majd vizsgáltuk a thymocyták összetételét, Vb3-TCR-expressziójukat és CD69-expressziójukat. Z-VAD-FMK kezelést használtunk a TCR és a glükokortikoid hormon hatására beinduló apoptózis-útvonal vizsgálatára. Intracelluláris jelölést követően mértük a thymocyta-alcsoportok aktív kaszpáz-3-expresszióját és Bcl-2-szintjüket. Az antigén- (PCC-) vagy DX-kezelés külön-külön és együttesen is a teljes thymocytaszám csökkenését okozta, de a kombinált kezelés ezzel párhuzamosan szignifikánsan emelte a CD4/DP sejtarányt. A kombinált kezelés hatására a CD69-expresszió (a pozitív szelekció markere) mind a DP, mind a CD4+ sejteken növekedett. A Vbéta3-TCR-t hordozó DP-thymocyták aránya az antigén- és DX-kezelések hatására nem változott, de kombinált kezelés esetén szignifikánsan csökkent. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy az MHC II-n keresztül bemutatott PCC peptidfragmentumok glükokortikoid hormon jelenlétében fokozott pozitív szelekciót eredményeznek (Vbéta3-pozitív DP-sejtek érett CD4+ stádiumba jutnak), míg arányában a Vb3-negatív sejtek többsége az éretlen DP-szinten reked. Összehasonlítva a TCR jelátviteli út és a glükokortikoidhormon-kezelés hatására bekövetkező apoptotikus jelátviteli utakat, megállapítottuk, hogy mindkettő kaszpázútvonalon zajlik, mert a pánkaszpáz-inhibitor kezelés mind a spontán, mind a TCR és a glükokortikoid hormon indukálta késői apoptózist meg tudta akadályozni a thymocytákban. Ezzel szemben az aktív kaszpáz-3-expresszió különbségeket mutatott a glükokortikoid hormon és a TCR által indukált apoptózis során. Összehasonlítva a különböző thymocyta-alcsoportokat, a legkisebb Bcl-2-expressziót a DP-sejtek mutatták; ez azt jelzi, hogy ezek a sejtek sokkal érzékenyebbek az apoptotikus hatásokra, mint a kettős negatív (DN) és az érett (SP) sejtek. E megfigyelésekből arra következtetünk, hogy a kettős pozitív thymocyták glükokortikoid hormon indukálta jelátviteli útja egy nem genomikus mechanizmus, amely befolyásolja a TCR jelátviteli utat.

Glucocorticoid hormone (GCs) influence TCR signals in TCR transgenic mouse thymocytes

Both endogenous and therapeutically injected glucocorticoid hormones (GC) influence T-cell maturation by inducing apoptosis of immature thymocytes. In addition locally produced GCs were also identified in the thymus. The physiological role of these thymus-derived GCs in thymocyte development and selection is still controversial. Normal T cell development was described in GC receptor (GCR) KO mice. We have demonstrated that among the different thymocyte subpopulations the most GC sensitive DP thymocytes express the lowest GC receptor (GCR) level both at protein and mRNA level. Supporting the mutual antagonism model others describe that GC-signaling can prevent TCR-induced apoptosis and induce positive selection of thymocytes. The survival of developing thymocytes during positive and negative selection steps depends on the TCR signaling. The crosstalk between TCR-signaling and the GC induced signal was described in T-cell hybridoma cells: independently both signals induce apoptosis, yet together they promote T cell survival.

Our goal was to investigate the antigen (TCR) and GC induced effects on the survival and selection of developing thymocytes using a TcR-AND transgenic mouse model [pigeon cytochrome-C (PCC) specific Vbeta3 TCR]. Animals were treated with PCC and/or GC (dexamethasone) and the composition, Vbeta3 expression, CD69 expression of thymocytes were detected by flow cytometry. Z-VAD-FMK treatment was used to investigate the TCR and GC induced apoptosis signaling pathways. Intracellular caspase-3 expression and Bcl-2 level was detected in different thymocyte subpopulations after the treatments. The administration of PCC and/or DX resulted in reduced total thymocyte numbers in both cases however combined treatment induced a significantly increased CD4/DP cell ratio. CD69 expression (marker of positive selection) increased on both DP and CD4 SP cells. The ratio of Vbeta3 TcR bearing DP thymocytes showed no change after DX or PCC administrations alone, but decreased significantly after combined treatment. These results indicate, that MHC-II-bound PCC-peptides in the presence of GCs induced enhanced positive selection (maturation from DP into CD4 SP stage), therefore the Vb3-negative cells remained mostly in the DP immature stage. Comparing the apoptotic pathways induced by TCR signaling or GC treatment we were able to demonstrate, that each is mediated through the caspase pathway, because using a pan-caspase inhibitor we were able to prevent both spontaneous and antigen or GC induced apoptosis of thymocytes. In contrast, the active caspase-3 expression differed in GC and TCR induced apoptotic pathways. Comparing the thymocyte subpopulations DP cells showed the lowest Bcl-2 expression, indicating that these cells are more susceptible to the induction of apoptotic death, than are DN or SP mature cells. We conclude, that in DP thymocytes the GC induced signaling pathway is a non-genomic mechanism which can influence the TcR signaling.



9. Monoklonális antikoleszterin-antitest előállítása és karakterizálása (P1)
Bíró Adrienn1, Cervenak László1, László Glória2, Uray Katalin3, Horváth Anna1, Romics László1, Karádi István1, Füst György1
1Semmelweis Egyetem, III. sz. Belgyógyászati Klinika;
Eötvös Loránd Tudományegyetem,
2Immunológia Tanszék,
3Szerves Kémia Tanszék, Budapest

Bár a koleszterin elleni természetes autoantitestek minden egészséges ember vérében megtalálhatók, funkciójuk, keletkezésük mechanizmusa kevéssé ismert. Alving és munkatársai feltételezték, hogy az antikoleszterin-antitest (ACHA) szerepet játszhat a lipidmetabolizmus szabályozásában. Saját eredményeink arra utaltak, hogy vírusfertőzések - HIV, HCV - során az ACHA hozzájárulhat a lipidanyagcsere felborulásához. Az irodalomban eddig kizárólag IgM izotípusú monoklonális ACHA-t állítottak elő és karakterizáltak.

Olyan IgG izotípusú monoklonális ACHA előállítását tűztük ki célul, amelynek segítségével pontosabban leírhatjuk a koleszterinnel reagáló antitestek funkcióját, szerepüket a lipidanyagcsere és a vírusfertőzések folyamataiban. (A monoklonális ACHA-nak gyakorlati haszna mellett - könnyebb tisztíthatóság és karakterizálhatóság - elméleti jelentősége is lehet.)

A monoklonális ACHA előállításához Balb/c egereket immunizáltunk nagy koleszterintartalmú liposzómákkal, majd hibridómatechnikával állítottuk elő az ellenanyagokat. A sejtek felülúszójából Protein-G Sepharose oszlopon affinitáskromatográfiával tisztítottunk ellenanyagot, ezeket ELISA rendszerben teszteltünk.

Sikerült IgG izotípusú koleszterinnel reagáló monoklonális ellenanyagot előállítanunk. A monoklonális ACHA-specificitás vizsgálata azt mutatta, hogy a koleszterin korábban feltételezett 3béta-OH csoportja mellett más szerkezeti elem is szerepet játszhat az ellenanyag kötődésében. A monoklonális ACHA reagál a humán lipoproteinekkel.

Production and characterization of monoclonal anti-cholesterol antibody

Although naturally occurring autoantibodies against cholesterol are present in the sera of all healthy individuals, their function and production is still unclear. Alving and his coworkers supposed that anti-cholesterol antibody (ACHA) might play a role in the regulation of lipid metabolism. Our previous results indicated that ACHA may contribute to the development of hypocholesterolaemia frequently observed in viral infections (HIV, HCV). Only IgM isotype of monoclonal ACHA was produced and characterized till now.

The aim of our study was to produce IgG isotype of monoclonal ACHA (which has not only practical benefits but also theoretical significance) to specify their function and their role in the lipid metabolism and viral infections.

To produce monoclonal anti-cholesterol antibodies Balb/c mice were immunized with cholesterol rich liposomes and hybridoma technique was used. We purified antibodies from supernatant of the cells on Protein-G Sepharose column by affinity chromatography, and tested the antibodies in ELISA system.

The production of IgG isotype monoclonal antibodies reacting with cholesterol was successful. The specificity test of monoclonal ACHA showed that beside the previously supposed 3beta-OH group of cholesterol other structural elements might also play role in the binding of the antibody. The monoclonal ACHA reacts with human lipoproteins.



10. Immuntoxikológiai vizsgálatok színes-, illetve nehézfémekkel exponált dolgozók körében (P39)
Bíró Anna, Oláh Gábor, Magyar Balázs, Major Jenő, Tompa Anna
OKK, Országos Kémiai Biztonsági Intézet, Budapest

Bevezetés és célkitűzés: Az Országos Kémiai Biztonsági Intézetben a Széchenyi-pályázat keretében a fokozott daganatkockázatú dolgozók egészségvédelme érdekében célzott kemoprevenciós stratégiák kidolgozását kezdtük. Ennek keretében a foglalkozásuk során exponáltak körében részletes anamnézist veszünk föl, elvégezzük a donorok teljes klinikai laboratóriumi vizsgálatát, felmérjük a citogenetikai és immuntoxikológiai állapotot. A kapott eredmények alapján célzott kemoprevenciós lépéseket javasolunk az üzemorvos részére, és immuntoxikológiai, klinikai laboratóriumi eredmények segítségével ellenőrizzük az egy hónapos kezelés hatékonyságát.

A foglalkozásuk során nehéz-, színes, valamint nemesfémekkel exponáltak körében - a munkavédelem szigorítása mellett - a fémionháztartásban bekövetkezett változások és azok következményeinek elhárítása érdekében kemoprevenció vált indokolttá. Ennek lehetséges módja a káros fémek eltávolítása a szervezetből, a vizsgálatainkba bevont kelátképző készítmény, a Humetta segítségével. A Humetta-adás indikációi: anaemia (vashiány, alacsony hemoglobinszint), egyéb hematológiai vagy immunológiai eltérés, a kromoszómatörés gyakoriságának növekedése.

Módszerek és vizsgálati csoportok: A vizsgálatokban a foglalkozásuk során nehéz-, színes-, nemesfémekkel exponáltak vettek részt (összesen 47 fő). Az adatokat 25 kontroll adataihoz hasonlítottuk. Teljes körű klinikai laboratóriumi kivizsgálás mellett a következő immuntoxikológiai vizsgálatokat végeztük el a kemoprevenció előtt és után: a lymphocyta-szubpopulációk arányának meghatározása citofluorimetriával, a lymphocytaaktivációs markerek (CD25, CD56, CD71) meghatározása citofluorimetriával, a fehérvérsejtek általi reaktívoxigén-intermedier (ROI) termelésének mérése Phagoburst segítségével.

Eredmények: A fémexponált személyek között szembetűnően gyakori az anaemia, a magas szérumglükózszint és a vesefunkció-eltérés. A kemoprevenciós kezelést követően javultak a klinikai laboratóriumi értékek. Az immunológiai változások közül az alábbi tendenciák emelhetők ki: 1. A kontrollcsoportéhoz viszonyítva növekedett a T-lymphocyták aktivációsmarker- (CD25-, CD56-, CD71-) expressziója. Ez a jelenség a CD71 (transzferrinreceptor) esetében volt a legkifejezettebb. 2. A B-lymphocyták esetében a fémexponáltak CD71-expressziója kisebb volt a kontrollokénál, ez a kemoprevenció után a kontrollok szintjére emelkedett. 3. A fémexponáltak leukocytáinak ROI-termelése kisebb a kontrollcsoporténál, de az eltérés nem szignifikáns. Kemoprevenció után kissé nőtt a leukocyták ROI-termelése.

Eredményeink azt mutatják, hogy a fémexponáltak körében a Humetta-kezelés sok esetben kivédheti az expozíció káros hatásait.

Támogatás: Széchenyi K+F, OTKA T-032224.

Immunotoxicological studies of workers exposed to non-ferrous and heavy metals

Introduction and aim: In the National Institute of Chemical Safety, aided by a Széchenyi grant, we have started to work out a chemopreventive strategy for the improvement of health status in workers at high risk of cancer. For this purpose detailed anamnesis is taken, clinical laboratory tests are carried out, and cytogenetic and immunological status is assessed in workers exposed to toxic substances at the workplace. On the basis of the results of these studies, we indicate chemopreventive measures to the factory medical consultant, and measure the efficiency of a month's treatment with clinical laboratory and immunological tests.

In workers exposed to non-ferrous and heavy metals, chemopreventive measures should be taken to prevent detrimental changes in the metal-ion homeostasis. This can be achieved by eliminating harmful metals from the body by administering Humetta, a product with metal chelating properties. The indications of administering Humetta were anaemia, other haematological or immunological disturbances, or a rise in chromosome aberration frequency.

Groups and methods: 47 workers exposed to non-ferrous and heavy metals were studied. The data was compared to 25 controls. Besides clinical laboratory tests the following immunological studies were carried out: determining lymphocyte subpopulations by cytofluorimetry, measurement of lymphocyte activation markers (CD25, CD56, CD71) by cytofluorimetry, measurement of leukocyte reactive oxygen intermediate (ROI) production with Phagoburst.

Results: In the metal exposed group the incidence of anaemia, high serum glucose values and renal function disturbances were high. After chemopreventive measures the clinical laboratory results improved. In the immunological parameters the following tendencies can be mentioned: 1. The activation marker (CD25, CD56, CD71) expression of the T lymphocytes of the metal exposed group was higher than the control. This tendency was the most pronounced in the case of CD71. 2. The expression of CD71 on the B lymphocytes of metal exposed group was lower than the control group. After chemoprevention this value was raised. 3. The production of leukocyte ROI in the metal exposed group was lower than the control, although the difference was not statistically significant. After chemoprevention the prodution of ROI increased.

Our results indicate that administering Humetta may be beneficial in the prevention of harmful effects of metal exposition.

Supported by Széchenyi K+F, OTKA T-032224.



11. A humán aggrekán immunodomináns peptidepitópjával szembeni T-sejt-reaktivitás jellemzése BALB/c egérben (P2)
Buzás Edit1, Hudecz Ferenc2, Rajnavölgyi Éva3, Szalai Csaba4, Kozma Gergely4, Uray Katalin2, Simon Ágnes5, Glant Tibor6, Falus András1
1Semmelweis Egyetem, ÁOK, Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet;
2MTA-Eötvös Loránd Tudományegyetem, Peptidkémiai Kutatócsoport, Budapest;
3Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum, Immunológiai Intézet;
4Heim Pál Gyermekkórház, Budapest;
5MTA Enzimológiai Intézet, Budapest;
66Rush Presbyterian Medical Center, Chicago, IL, USA

Mint arról korábban beszámoltunk, aggrekánnal indukált arthritises egerekből általunk izolált T-sejt-hibridómák egyike szisztémás oltást követően arthritisszerű tüneteket idéz elő egérben, míg egy másik testvérklón esetében nem figyelhető meg ízületi elváltozás. A fenti két hibridóma az epitóphierarchia csúcsán álló, immunodomináns epitóppal szemben kialakuló poliklonális T-sejt-válaszba enged betekintést - ezt igen nagy számú T-sejt-aktivációs marker fokozott expressziója jellemzi.

Mára meghatároztuk a fenti két klón által létrehozott immunológiai szinapszis molekuláris szerkezetét: a T-sejt-receptorhoz kapcsolódó és az MHC II- (IAd-) kötő aminosavak pozícióját, a T-sejt-receptorok variábilis régiójának aminosavsorrendjét.

Annak ellenére, hogy a két klón T-sejt-receptorainak CDR1-, CDR2- és CDR3-aminosav-szekvenciája 100% egyezést mutat, a két, funkcionálisan is eltérő hibridómaklón egyértelműen megkülönböztethető a módosított peptidligandumok felismerési mintázata alapján.

Az arthrogenitásért - hipotézisünk értelmében - a humán epitóptól két aminosavban különböző saját peptidnek mint módosított peptidligandnak jelentősen eltérő felismerése tehető felelőssé, ez befolyásolhatja az antigénspecifikus sejtek extravasatiójának helyét.

T-cell recognition of an immunodominant, human aggrecan epitope in BALB/c mice

Several years ago we have isolated aggrecan-specific T cell hybridoma clones from mice suffering from aggrecan-induced arthritis. The polyclonal T cell activation to this immunodominant epitope is characterized by the high expression of several T cell activation marker genes. The complexity of this single T cell epitope directed immune response was clearly reflected by the finding that one of our T cell hybridoma clones induced arthritis-like symptoms when injected systemically to naive mice, while a sister clone with the same epitope specificity failed to elicit any joint-related symptoms.

By now we have determined the elements of the corresponding immune synapses including the TCR-contact and MHC II (IAd) anchor residues of the recognized immunodominant epitope and the TCR variable region sequences.

Surprisingly, while CDR1, CDR2 and CDR3 sequences of both hybridomas proved to be 100% identical, recognition pattern of altered peptide ligands by the two clones still clearly distinguished these functionally discordant hybridomas.

We hypothesize that differential recognition of the corresponding self (murine) epitope as an "altered peptide ligand" could be responsible for the different "arthritogenicity" of the two hybridomas since it could have a strong impact on the site of extravasation of the cells.



12. A természetes immunitás vizsgálata hisztaminhiányos, génkiütött egérben (E2)
Buzás Edit1, Pállinger Éva2, Pós Zoltán2, Bene László3, Fülöp A. Kristóf1, Bíró Adrienn4, Füst György4, Irun Cohen5, Falus András1, 2
1Semmelweis Egyetem, ÁOK, Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet;
2MTA Molekuláris Immunológiai Kutatócsoport;
3Péterfy Sándor utcai Kórház, Gasztroenterológiai Osztály;
4Semmelweis Egyetem, III. Sz. Belgyógyászati Klinika, Budapest;
5The Weizmann Institute of Science, Rehovot, Izrael

A hisztaminhiányos, hisztidin-dekarboxiláz-gén-kiütött egérmodell eddigi vizsgálata a hisztamin - a metabolom 112 daltonos, dekarboxilált aminosavkomponense - általános szabályozószerepét igazolja. A hisztaminhiányos egerek adaptív immunitásának egyik legmarkánsabb jellemzője a Th1 irányú eltolódás, ezt számos kísérletes rendszer megfigyelései igazolják. A természetes immunitás celluláris komponensei közül nem mutatható ki különbség a génkiütött és a vad típusú egerek monocyta-, granulocyta-, NK- és gamma/delta T-sejt-számát illetően. Ugyanakkor a hisztaminhiányos egerek peritonealis hízósejtjeinek száma, azok szemcsézettsége, a granulumok heparin- és proteázkoncentrációja drámai módon csökkent.

A természetes immunitás szolúbilis tényezői közül a keringő természetes autoantitestek felismerési mintázatában jelentős különbség figyelhető meg a génkiütött és a vad típusú egerek között, elsősorban az IgM típusú keringő autoantitestek esetében; a termelésükért felelősnek tartott CD5+ B1-sejtek száma nem különbözik a hisztaminhiányos génkiütött és a vad típusú egerekben. Hisztamin hiányában az IL-6 indukálhatósága jelentős mértékben csökkent, míg az IL-6-receptor gp130-expressziója fokozott a génkiütött egerek májában. Az akutfázis-fehérjék közül elsősorban a haptoglobin szintjének csökkenése jellemző a hisztaminhiányos állapotra.

További vizsgálatok hivatottak annak eldöntésére, hogy milyen kapcsolat áll fenn a fenti megfigyelések és a normális bélflórának a hisztaminhiányos egerekre jellemző eltérései között.

Natural immunity in histamine deficient, gene targeted mouse

The phenotype of histamine deficient, gene targeted mice strongly supports the notion that histamine (a 112 dalton, a decarboxylated amino acid component of the metabolome) performs multiple regulatory functions in vivo. Previous research has focused on the adaptive immunity of the above transgenic mouse model and showed a marked Th1 shift in the absence of histamine synthesis. Herein, we investigated the natural immunity of histamine deficient, gene targeted mice.

No significant differences were detected in the frequency of cellular components (monocytes, granulocytes, NK and gamma/delta T cells) of wild type and knockout mice. However, histamine deficient mice were characterized by a dramatic decrease in the number of peritoneal mast cells. Furthermore, mast cell granules of these animals were present in a significantly reduced number and had decreased heparin and protase content. From among the soluble factors of natural immunity we found a significant difference in the recognition pattern of circulatig natural autoantibodies of wild type and ko mice (in particular in that of IgM type autoantibodies), while there was no difference betwen the frequencies of CD5+ B1 cells. In vivo histamine deficiency resulted in a reduced inducibility of IL-6 with a concomitant upregulation of the IL-6 receptor/gp130 gene expression. Histamine deficient gene targeted mice were also found to have a decreased serum haptoglobin level.

Further studies are needed to confirm the association between the above observations and the significantly altered normal intestinal flora found in histamine deficient, gene targeted mice.



13. A CD45RC epitóp azonosítása fágdisplay segítségével egér-B-sejteken és előalakjaikon (P21)
Czömpöly Tamás, Lábadi Árpád, Balázs Mercédesz, Németh Péter, Balogh Péter
Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Immunológiai és Biotechnológiai Intézet

A leukocyta közös antigénjei (L-CA, CD45) N-terminális-közeli exonjainak alternatív splicingja és változó expressziója egymás-tól eltérő izoformák megjelenéséhez vezet a különböző funkciójú és fejlődési stádiumú sejteken. Jelen munkánk során egy új, egér-CD45 elleni, monoklonális patkányellenanyag- (mAb-, IBL-8-) reaktivitás mintázatát és epitópspecificitását vizsgáltuk. Eredményeink alapján ellenanyagunk egy, a B-sejteken és előalakjaikon - az újszülött lépből és a felnőtt csontvelőből származó sejteken egyaránt - jelenlévő epitópot ismer fel. A perifériás nyirokszövetből származó CD8+ T-sejtek közepes intenzitással, a CD4+ T-sejtek gyengén jelölhetők az IBL-8 monoklonális ellenanyaggal. Az ellenanyag által felismert epitópot az M13 filamentózus fág felszínén megjelenített ciszteinek által közrefogott randompeptid-könyvtárral határoztuk meg. A feltételezett epitópot hordozó fágok izoforma-specifikusan gátolták az exonspecifikus monoklonális antitestek célsejtekhez kötődését. Az e bakteriofágokon megjelenített peptidek aminosav-sorrendje alapján az IBL-8 monoklonális antitest által felismert epitóp az egér-CD45 molekula C-exonján belül a 136-144. aminosavak között található, központjában a TAFP szekvenciával.

Use of cyclic peptide phage display library for the identification of a CD45RC epitope expressed on murine B cells and their precursors

The alternative splicing and variable expression of the exons near to the N-terminus of the leukocyte common antigen (L-CA, CD45) result in distinct extracellular isoforms expressed by cells with different functional and developmental properties. Here we report the tissue reactivity pattern and epitope specificity of a novel rat monoclonal antibody (mAb, IBL-8) against a restricted epitope of mouse CD45. We found that this mAb reacts with an epitope displayed by B cells and their precursors (both in newborn spleen and adult bone marrow). Moreover, peripheral CD8-positive T cells were also recognized at an intermediate intensity, whereas the CD4T cell subset was weakly reactive. The epitope of this mAb was determined with M13 filamentous phages that display cysteine constrained nonapeptides on their coat proteins. The isolated bacteriophages expressing the putative epitope showed an isoform-specific inhibition of the binding of exon-specific mAbs. Deduced amino acid sequence data of these phages indicate that the epitope recognized by the IBL-8 mAb lies at the 136 -144 region of the mouse CD45 molecule within its C exon, with a TAFP consensus sequence at its centre.



14. A mannózkötő lektinszintek vizsgálata szisztémás lupus erythematosusban szenvedő betegek szérumában (E3)
Csípő István, Kiss Emese, Baráth Sándor, Sipka Sándor, Szegedi Gyula
Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum, III. Sz. Belgyógyászati Klinika

A mannózkötő lektin (MBL) kollagén- és lektindoménekkel jellemezhető, kalciumfüggő lektin; fontos szerepet játszik a nem specifikus immunológiai védelemben. Az MBL génjének polimorfizmusa jelentősen befolyásolja a szérumban mérhető MBL-szinteket. Az 1-es exon 54-es kodonjának mutációja és a promóterrégió polimorfizmusa szignifikáns csökkenést eredményez a szérum-MBL-koncentrációkban. Az MBL-szintekben tapasztalható deficientia együtt járhat az infekcióra és autoimmunbetegségekre - például szisztémás lupus erythematosusra (SLE) - való fokozott hajlammal.

Jelen munkánkban a mannózkötő lektin szintjét határoztuk meg volt SLE-betegek (n=74) és egészséges kontrollok (n=26) szérumában, MBL-oligomer ELISA felhasználásával. Meghatároztuk a C3-, C4-komplementkomponens-koncentrációkat, a CH50, anti-ds-DNS- és anti-ENA-szinteket. SLEDAI indexet számítottunk, hogy az MBL-szinteket összevethessük a betegség aktivitásával. Tizennégy eset kapcsán megvizsgáltuk a plazmaferézis MBL-szintekre gyakorolt hatását.

Eredményeink azt mutatták, hogy nincs szignifikáns különbség az átlagos MBL-szintekben, továbbá az MBL-deficientia gyakoriságában az SLE-s betegek és a kontrollok között. A plazmaferézis - más szérumfehérjék szintjéhez hasonlóan - mérsékelten csökkentette az MBL-szinteket. Nem találtunk korrelációt az MBL-szintek és az SLEDAI index, továbbá az SLE-re jellemző szérumparaméterek szintje között; ez arra utal, hogy az MBL-deficientia nem játszik döntő szerepet az SLE patogenezisében. Megjegyzendő ugyanakkor, hogy a bevezetőben említettek miatt nagy jelentőséget kaphat az MBL-szint-mérések elterjedése a magyar immunológiai laboratóriumokban.

Investigation on mannose-binding lectin levels in sera of patients with systemic lupus erythematosus

Mannose-binding lectin (MBL) is a Ca2+-dependent lectin characterized by both collagenous and lectin domains, and plays an important role in innate immune defence. Serum MBL levels are greatly affected by the polimorphism ot the MBL gene. In particular, codon 54 mutation in exon 1 and various promoter region polimorphism result in significant reduction of serum MBL. Deficiency in MBL may be associated with an increased susceptibility to infection and autoimmune disorders such as systemic lupus erythematosus (SLE).

The aim of our study was to investigate the levels of MBL in the patients with SLE (n=74) and healthy individuals (n=26) using a MBL-oligomer ELISA. Concentrations of complement component C3, C4, as well as hemolytic activation of classical pathway (CH50) was also measured together with anti-dsDNA and anti-ENA levels. To compare disease activity and MBL levels SLEDAI index was calculated. Effect of plasmapheresis on MBL levels including 14 patients was also studied.

Our data demonstrate that there are no significant difference on the avarage level of mannose binding lectin and the frequency of MBL deficiency in the sera of patients with SLE compared to healty controls. Plasmapheresis decreased mannose binding lectin concentration moderately in the patients without MBL deficiency. No correlation was found among MDL levels and SLEDAI index as well as other characteristic serum parameters suggesting that MBL deficiency plays not a major role in the pathogenesis of SLE in the patients treated at our department. On the other hand, the spreading of MBL measurements in the repertoire of immunological laboratories has a great importance in Hungary.



15. Humán monocyta eredetű dendritikus sejtek érése a C1q komplementfehérje hatására (P6)
Csomor Eszter, Bajtay Zsuzsa, Erdei Anna
Eötvös Loránd Tudományegyetem, Immunológiai Tanszék, Budapest

A dendritikus sejtek (DC) hivatásos antigénprezentáló sejtek; kapcsolatot teremtenek a természetes és az adaptív immunrendszer között. Éretlen állapotban képesek felvenni a kórokozókat, majd a legközelebbi nyirokcsomóba vándorolva érett dendritikus sejtekké alakulnak. Eközben a sejtek felszínén csökken az antigénfelvételhez szükséges receptorok - például: mannózreceptorok, Toll-szerű receptorok - száma, és növekszik a kostimulátormolekulák (CD80, CD86), a CD83 érési marker és az MHC II-molekulák expressziója. Az érést többek között a gyulladás során felszabaduló citokinek és kórokozó eredetű molekulák (például LPS) válthatják ki.

Az antigén - in vivo, a szervezetben - immunkomplex formájában fordul elő. A legújabb adatok szerint az IgG az LPS-hez hasonló hatást gyakorol az éretlen dendritikus sejtekre (J Immunol 2003;170:3963.). Mivel az immunkomplexekben IgG mellett komplementfehérjék is találhatók, megvizsgáltuk, hogy a C1q, az MBL és a C3 miként befolyásolja a dendritikus sejtek érési folyamatait. Vizsgálataink során az in vitro IL-4 és GM-CSF hatására monocytából öt nap alatt éretlen DC-vé differenciálódott sejteket C1q-val, MBL-lel, illetve C3-mal (35 mikrogramm/ml) fedett felszínen tenyésztettük további két napig. Kontrollként LPS-t adtunk az éretlen dendritikus sejtekhez. A komplementfehérjéknek a DC-k érésére gyakorolt hatását a sejtfelszíni molekulák [CD83, CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), mannóz-R, MHC II] expressziójának citofluorimetriás követésével és funkcionális tesztekkel - allogén T-sejt-aktiváció, a citokintermelés mérése ELISA-val - követtük nyomon.

Eredményeink azt mutatják, hogy az éretlen dendritikus sejtek C1q-val fedett felületen két napig tenyésztve érett sejtté alakulnak; MBL hatására nem történik változás. C1q hatására az érés jelentős volt, az LPS hatásához hasonlóan. A C1q-molekula jól kötődik az éretlen dendritikus sejtekhez, ez a kötődés azonban visszaszorul az érés során. Az MBL kötődését nem sikerült kimutatnunk. A C1q-val fedett felületen éretté vált dendritikus sejtek által termelt IL-6 mennyisége megközelítette az LPS hatására szekretálódott IL-6-szintet, MBL hatására viszont nem szabadult fel jelentős mennyiségű IL-6. Érdekes módon azonban MBL hatására megközelítően négyszer több TNF-alfa szabadult fel, mint az éretlen sejtekből, illetve a C1q-val fedett felszínen tenyésztett sejtekből. A C3 hatását vizsgálva csak kismértékű érést figyeltünk meg, a citokinszekrécióban és az allogén T-sejt-aktivációban nem találtunk eltérést az éretlen sejtekhez képest.

Eredményeink arra utalnak, hogy a dendritikus sejtek felszínén jelen lévő C1q-kötő molekulák nem kötik az MBL komplementfehérjét, ami összhangban áll a munkacsoportunk által korábban monocytákon végzett kísérletek eredményeivel. Kimutattuk továbbá, hogy a C1q-molekulát is tartalmazó immunkomplexek - hasonlóan az IgG-hez - képesek indukálni a dendritikus sejtek érését.

Immobilized C1q induces maturation of human monocyte-derived dendritic cells

Dendritic cells (DC) link innate and adaptive immunity by their ability to present antigens to naive T lymphocytes. During their development to mature DC (mDC) expression of receptors required for phagocytosis (e.g. mannose-receptor, Toll-like receptors) are down regulated, while MHCII and CD83 proteins and co-stimulatory molecules such as CD80 and CD86 are up-regulated. Maturation of DC can be induced by several stimuli, including inflammatory cytokines, microbial products (e.g. LPS) and also by immobilized IgG - as described recently (J Immunol 2003;170:3963.).

Since immune complexes occuring in vivo contain several complement proteins in addition to Ig, our aim was to study whether they influence maturation of DC. The effect of immobilized C1q, MBL and C3 was investigated using human monocyte-derived dendritic cells. Immature DCs were generated in the presence of IL-4 and GM-CSF and on day 5 these cells were transfered to plates coated with any of the complement proteins used at 35 microgramm/ml. As control, LPS was added to the cells. On day 7 DCs were characterized by expression of various cell membrane molecules using cytofluorimetry, by their cytokine secretion pattern utilizing ELISA systems and the by the cells' efficiency to activate allogeneic T lymphocytes, measured by thymidine incorporation.

We found, that immobilized C1q, but not MBL induces maturation of DCs to a similar extent as LPS. Regarding the interaction of these complement proteins with DCs, the binding of C1q was strong to immature DCs and decreased with maturation of the cells, while MBL did not bind at all. IL-6 secretion and T-cell stimulation by DCs cultured on immobilized C1q were almost as high as in the case of LPS-induced control cells, with no detectable release by cells cultivated on MBL-coat. Interestingly, TNF-alpha-secretion when compared to non-treated DC was negligible by cells cultured on C1q-coat, however approximately 4* higher in the case of cells cultivated on MBL. When maturation of DC was tested utilizing immobilized C3, only slight effect was found which was not reflected in cytokine secretion and T cell activation.

Our data show that C1q-binding molecules on DCs do not bind MBL - in accrodance with our findings on monocytes. Moreover, complement-containing immune complexes may induce DC maturation via C1q, in addition to IgG.



16. A membránceramid a T-lymphocyták sorsát az aktivációs, a sejthalál- és a túlélési szignálok egyensúlyán keresztül szabályozza (E10)
Detre Cynthia1, Kiss Endre1, Ludányi Katalin2, Pászty Katalin3, Enyedi Ágnes3, Réthi Bence2, Rajnavölgyi Éva2, Matkó János1
1Eötvös Loránd Tudományegyetem, Immunológiai Tanszék, Budapest;
2Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum, Immunológiai Intézet;
3Országos Hematológiai és Immunológiai Intézet, Budapest

A különféle jelek - Fas/FasL-, TNF-alfa-, IL-1alfa-, stressz-szignál - hatására a plazmamembránból (PM) felszabaduló ceramid a Bcl-2-függő foszfolipid-mitochondrium apoptózis-jelátviteli pálya egyik alapvető mediátora (másodlagos hírvivője). Ezenkívül számos egyéb hatását is leírták a T-sejt-aktiváció/sejtciklus, valamint a halálreceptor-jelátvitel szabályozásában, például: a plazmamembránraftok koaleszcenciájának kiváltása, az Src-kinázok vagy a T-sejtek aktivációs kalciumszignáljában fontos szerepet játszó K+-csatornák (Kv1.3) szabályozása.

Jelen munkánk során egér T-helper-sejtvonalain vizsgáltuk a ceramid korai és késői hatásait, exogén C2-ceramid alkalmazásával, amely az előzőekben említett szignálok hatására felszabaduló ceramid hatását modellezte. A C2-ceramid több markáns, gyors membránhatást produkált, például: a membránfluidizálás, a plazmamembrán depolarizációja, enyhe és koncentrációfüggő citoszólikus Ca2+-szint-emelkedés és a GM-1 gangliozid membránraftok (patch) aggregációja. Valamennyi korai hatás erősen függött a ceramid dózisától és a ceramidstimulus hosszától. Kis dózisban (gyenge, illetve közepes erősségű kiváltó jel) a sejtek többségében apoptotikus választ váltott ki, nagy dózisban (>50 mikroM) a T-lymphocyták többsége a nekrotikus sejthalál jeleit mutatta, különösen hosszabb
(1-6 órás) stimulusok esetén. Rövid, kis dózisú (<50 mikroM) ceramidstimulusok a sejtek nagy többségében (80%) még 24 óra alatt sem váltottak ki apoptotikus válaszokat (például: mitochondriumdepolarizáció, PARP-hasítás, DNS-fragmentáció). E rövid ceramidstimulusok növelték a c-FLIP antiapoptotikus gén mRNS-szintjét, ugyanakkor nem befolyásolták a proapoptotikus gének (például Nurr77) szintjét.

Korábban leírták, hogy a T-sejtek FAS/CD95-receptoron keresztüli stimulációja humán T-lymphocytákban gátolta a Ca2+-csatorna-aktivitást és a CD3 által mediált jelátvitelt. Ezért azt is vizsgáltuk, hogy a plazmamembrán-ceramid Fas-mediált felszabadulása befolyásolja-e a T-lymphocyták válaszát olyan szuperaktivációs körülmények között (például nagy antigén- és kostimulátordenzitás az APC-n), amely többnyire a T-sejtek aktivációindukált sejthalálához (AICD) vezet. Ezt egy influenzavírus- (HA317-329-) peptiddel tetszőlegesen "tölthető" egér-B-lymphoblast (2PK3,I-Ed+) APC és egy erre specifikus IP12-7 Th-hibridómasejtekből álló immunszinapszis-rendszerben tanulmányoztuk. A kis, rövid ceramidstimulus és a Fas/CD95 keresztkötése egyaránt gátolta az APC által indukált T-sejt-aktivációs szignálokat (például: citoszólikus Ca2+-szignál, a CD69 aktivációs antigén expressziója vagy az IL-2 szintézise/szekréciója), a kontroll-T-sejtekhez képest. Az antigénspecifikus aktiváció hatására megjelenő apoptotikus sejtek aránya (DNS-fragmentáció alapján) is csökkent e kezelések hatására.

Eredményeink szerint a plazmamembránban a különböző T-sejteket érő stimulusok (SM-áz-aktiváció) hatására felszabaduló ceramid befolyásolhatja a T-sejtek további sorsát. Például egyes T-sejtek - a ceramid T-sejt-aktivációt gyengítő hatása következtében - megmenekülhetnek az aktivációindukált sejthaláltól, így egyes jól válaszoló T-sejt-memóriaklónok túlélhetnek. A megfigyelt jelenség hátterében álló mechanizmusok pontos megismerése további vizsgálatokat igényel, azonban a korai membránhatások (például a feszültségvezérelt K+-csatornák gátlása) és a FLIP antiapoptotikus gén fokozott expressziója minden bizonnyal alapvetően fontosak a megfigyelt hatások kialakulásában.

Támogatás: MTA, OTKA T034393.

Membrane ceramide release may control the sensitive balance of activation, survival and death signals in T-cells: implications in rescuing AICD

Ceramide, released from the plasma membrane (PM) by different signals (Fas/FasL, TNFalpha, IL-1beta, or stress signals) is assumed as a key mediator (second messenger) in the Bcl-2-dependent phospholipid/mitochondrium apoptosis signal pathway. In addition, recent studies indicated that ceramide may control both T-cell activation/cell cycle signaling and the death-receptor mediated signals via promoting raft-coalescence in the PM or by regulating downstream signal steps. Among others, it can modulate activity of K+-channels (Kv1.3) implicated in regulation of the T-cell calcium signals generated by antigen stimuli.

In the present study we investigated the early and late cellular responses of a murine helper T-cell line (IP12-7) to exogenous C2-ceramide (CER) stimuli mimicking signal-induced ceramide release. C2-ceramide induced several rapid changes in the PM, such as membrane fluidization, PM-depolarization, aggregation of GM1/raft patches and a gentle rise in cytosolic free calcium level. The latter effect sharply increased above 50 microM dose. All these effects were dependent on both the CER-dose and the duration of the treatment. Low CER doses induced mostly apoptotic cell response, while doses >50 microM caused significant necrotic cell death, especially at long-term treatments, as demonstrated by morphological and functional apoptotic markers. In contrast, a short-term (10 minutes) CER stimulus up to 50 microM dose did not induce apoptotic cell death in the majority (~80%) of cells, as monitored by the different apoptotic markers (e.g. mitochondrium potential, PARP cleavage, DNA fragmentation) through 24 hours. Short-term CER treatment increased mRNA level of c-FLIP antiapoptotic gene in a concentration dependent manner, but did not influence those of the proapoptotic genes (e.g. Nurr77). Stimulation of FAS/CD95 receptors on T-cells was reported to inhibit Ca2+-channels and suppress CD3-mediated signal transduction in human T-lymphocytes. This suggests that Fas-mediated PM ceramide release may also interfere with TCR signaling in a situation where T-cells are under superactivating conditions (such as high antigen and costimulator density) resulting in activation-induced cell death (AICD). This condition could be fulfilled and flexibly controlled by peptide (influenza virus HA317-329) loading in our T-cell synapse model, the murine 2PK3 B-lymphoblasts (I-Ed+) and the IP12-7 Th hybridoma (with specificity to influenza virus) cells mixed and promoted for conjugate formation. We found that the APC-induced activation signals (cytosolic calcium signal, expression of the CD69 activation antigen, or IL-2 synthesis/secretion) were inhibited in T-cells prestimulated by either 50 microM CER or crosslinking of CD95 with anti-Fas antibody, relative to control, untreated T-cells. Prestimulation with 50 microM CER also markedly decreased the fraction of apoptotic cells generated by the antigen-specific activation, as assessed by monitoring DNA-fragmentation kinetics. These results together suggest that ceramide released from PM (through sphingomyelinase activation) by different stimuli received by T-cells may determine the further fate of T-cells. In case of strong antigen-specific stimuli it may rescue some activated T-cells from AICD (by lowering the strength of T-cell activation) and resulting thereby in survival of some strongly responding memory cells. Among others, inhibition of voltage-gated K+-channels (consistent with the observed PM depolarization) or activation of anti-apoptotic genes (e.g. FLIP) may underline these CER effects, the clarification of which still needs further investigations.

Supported by OTKA grant T 034393 from the Hungarian Academy of Sciences.



17. Coelomasejt-alpopulációk azonosítása Eisenia fetidában monoklonális ellenanyagokkal és epitóptérképezés fágdisplay technikával (P27)
Engelmann Péter1, Czömpöly Tamás1, Pálinkás László1, Cooper L. Edwin2, Németh Péter1
1Pécsi Tudományegyetem, Orvostudományi Kar, Immunológiai és Biotechnológiai Intézet;
2Laboratory of Comparative Neuroimmunology, Department of Neurobiology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, California 90095-1763, USA

A természetes immunitás már a gerinctelenekben is jelen van; különböző típusú védekezősejtek alakulnak ki, ezek más-más funkcióban vesznek részt. A gyűrűsférgek törzsébe tartozó földigiliszták védekező sejtjei a coelomasejtek. Ezek a sejtek fagocitózisra és antimikrobiális peptidek termelésére képesek. Korábbi vizsgálatainkban a coelomasejteket fizikai paraméterek alapján három csoportra (R1, R2, R3) karakterizáltuk. A sejtek közül két populáció (R1, R2) reagált emlős konzervatív antigénekre előállított monoklonális ellenanyagokkal. A pontosabb vizsgálatokhoz coelomasejtekre állítottunk elő specifikus monoklonális ellenanyagokat. A hibridómatechnika segítségével előállított EFCC klónok ellenanyagai intenzíven reagálnak a coelomasejtek különböző alpopulációival. Immunmorfológiai és áramlási citometriás vizsgálatokkal azt tapasztaltuk, hogy a 3/C2 klón az összes sejtpopulációt festi a sejtmembránon, ezzel szemben az 1/B1 klón markánsan festi az egyik sejtpopuláció citoplazmatikus granulumait. Az 1/B1 klón által festett sejtek feltételezésünk szerint a chloragogén sejtek lehetnek, ezek jellegzetességeikben eltérnek a többi coelomasejttípustól. A chloragogének igen összetett funkciójúak, részt vesznek a táplálék szállításában és a hemoglobin, illetve az antimikrobiális anyagok termelésében. Két másik monoklónunk segítségével azonosítani tudtuk a coelomasejtek másik két populációját, a hialin- és a granuláris amoebocytákat. Az 2/B1 klón specifikusan jelöli a nagy, aggregálódó, kitapadásra hajlamos sejteket, a fagocitózisban elsődleges szerepet játszó hialin-amoebocytákat. Egy sokkal ritkább sejtpopulációt jellemez a 3/C1 klón, ezeket granuláris amoebocytaként tudtunk azonosítani.
A hialinsejtek mellett e sejtpopuláció játszik szerepet az enkapszuláció folyamatában is. Áramlási citometriás méréseink igazolták az immuncitokémiában kapott eredményeket. Kriosztátos metszeteken vizsgálva határoztuk meg a sejtpopulációk eredési helyét. A 3/C2 által felismert antigént az összes szöveten jól ki tudtuk mutatni, míg az 1/B1 a bél egyes területein - typhlosolis, bélepithelium - adott reakciót. A 2/B1 és a 3/C1 klónok a bél, illetve a coelomaepithelben mutatnak festődést.

A 3/C2 klónnal immunprecipitálva egy 200 kDa tömegű peptidet találtunk, a 3/C1 klón pedig egy 80-90 kDa tömegű peptidet ismer fel. A 3/C2 klón epitópját (SLSDC) fágfelszínen megjelenített randompeptid-könyvtárral sikerült azonosítanunk. Ezt az ellenanyagklónt más gerinctelen és gerinces (emlős-) sejteken tesztelve is tapasztaltunk reakciót.

Összefoglalásul elmondható, hogy a létrehozott monoklonális ellenanyagokkal sikerült azonosítani a giliszta főbb immunsejt-populációit, ezek funkcionálisan is különböznek egymástól. Szövettani metszeteken végzett festéseink alátámasztják azt az elképzelést, amely szerint a coelomasejtek a coelomaepithelből erednek, azaz mesodermalis eredetűek, más-más lokalizációval. A továbbiakban a sejtek egymás közötti leszármazási viszonyait kívánjuk figyelemmel kísérni.

Identification of coelomocyte subpopulations by specific monoclonal antibodies in Eisenia fetida and epitope mapping by phage display

The innate immunity is present in invertebrates, different population of immune cells are developed which have various functions. The coelomocytes are involved in the immune reactions of the annelid earthworms. These cells have a primarily role in cellular mechanisms, however bioactive molecules produced by them can mediate humoral reactions as well. In our previous report we describe the characterization of coelomocyte subpopulations (R1, R2, R3) of Eisenia fetida earthworm on the basis of physical and immunological parameters.

In our recent study we present the results of the development of coelomocyte specific monoclonal antibodies. The mABs of EFCC clones produced by hybridoma technology reacted intensely with coelomocyte subpopulations. The results of immuno-morphology and flow cytometric studies show that 3/C2 clone labels all coelomocytes on the membrane while 1/B1 clone stains strongly only the cytoplasmic granules of one population. These cells seem to be the chloragogen population which differs from the other coelomocytes in having role in haemoglobin synthesis, nutrition transport and producing of antimicrobial molecules. Two another clones are capable to identify the other subpopulations of coelomocytes as hyaline and granular amoebocytes. The 2/B1 clone labels specifically the big aggregating, spreading cells, which have main role in phagocytosis: the hyaline amoebocytes. A more rare population is characterized by 3/C1 clone, which are the granular amoebocytes. This population is mediated some reaction beside the hyaline cells in encapsulation process. Our flow cytometric measurements justified the results of immunocytochemistry. For the examinations of the origin of different populations were used cryostat sections of whole earthworm tissues. The antigen recognized by 3/C2 clone present in all tissues. 1/B1 clone shows reaction only on some areas of gut (typhlosolis, gut epithelium). The 2/B1 and 3/C1 clones stained on the epithelia of gut and coelom, respectively in the gut. We found a 200 kDa peptide using 3/C2 clone for immunoprecipitation, in the case of 3/C1, the antibody recognize a 80-90 kDa peptide. The fine epitope structure of 3/C2 clone (SLSDC) was determined using phage display random peptide library. Testing this mAb on other invertebrate and vertebrate (mammalian) cells we found different staining patterns.

In conclusion we can say that the produced mAbs are capable to identify different subpopulations of coelomocytes, which have different functional role. Our staining on earthworm whole tissues shored up the epithelial and mesodermal origin of earthworm immune cells. These antibodies can be a capable tool for monitoring the development and maturation of earthworm coelomocytes.



18. Az in ovo szikvezeték-lekötés hatása a mikrokörnyezetre, a madarak bursájában (E28)
Felföldi Balázs1, Imre Gergely2, Iván Judit3, Igyártó Botond1, Mihalik Rudolf2, 4, Oláh Imre1, Magyar Attila1
Semmelweis Egyetem, Általános Orvostudományi Kar,
1Humánmorfológiai és Fejlődésbiológiai Intézet,
2I. Sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet, Budapest;
3MTA Állatorvos-tudományi Kutatóintézete, Budapest;
4MTA-Semmelweis Egyetem, Egyesült Kutatási Szervezet, Molekuláris Patológiai Kutatócsoport, Budapest

A madaraknak a B-sejt-fejlődésért felelős primer nyirokszerve - a bursa Fabricii - a bursavezetéken keresztül közvetlen összeköttetésben áll a kloáka üregével. A madarakban a bursában a B-sejt-érés enteralis antigének jelenlétében zajlik. Az enteralis antigének a bursa nyálkahártyájának hámsejtjein keresztül jutnak a folliculusokba, ott dendritikus sejtek felszínén lokalizálódnak. A bursavezeték lekötése meggátolja az enteralis antigének bursába kerülését; ennek következtében a bursa B-sejt-száma csökken, és a hibás Ig-szekvenciájú B-sejtek gyakorisága jelentősen nő. Az enteralis antigének immunkomplexek formájában vannak jelen a bursában a dendritikus sejteken. A madarakban a szik (tojássárgája) tartalmazza az anyai IgG-t, amely a kikelt állat immunológiai védelmét biztosítja. Ez az anyai IgG a szikereken keresztül jut az embrió - majd a kikelt állat - vérkeringésébe. A jelenlegi elképzelések szerint a bursában az immunkomplexek IgG-komponense a szérumból jut a folliculusokba.

A szikzacskó és a vékonybél között létezik egy járat, a szikvezeték. Ezen keresztül a sziktartalom, és így az anyai IgG közvetlenül a bélcsőbe juthat. Kidolgoztuk a szikvezeték embrionális korban (in ovo) végzett lekötésének technikáját, és a lekötött szikvezetékű állatok bursáit immunhisztokémiai, FACS és Nor-thern-blot eljárásokkal vizsgáltuk.

A szikvezeték-lekötést követően a bursában az első héten nem mutathatók ki IgG-tartalmú immunkomplexek. A folliculusok B-sejtjeinek száma a kontrollállatokénak 10-30%-ára mérséklődik. A follicularis B-sejteken az sCD15 jelentősen reexpresszálódik. A chB1 gén expressziója nem detektálható; a dendritikus sejtek felszínén a 74.3 differenciálódási marker nem mutatható ki.

Eredményeink azt mutatják, hogy az anyai eredetű IgG egy része - az emlősök kolosztrális immunitásához hasonlóan - a bél üregébe jut, ott enteralis antigénekkel immunkomplexeket képez. Ezek az immunkomplexek szükségesek a bursában lévő dendritikus sejtek teljes differenciálódásáért. Az immunkomplexek hiányában a B-sejtek fenotípusa egy korábbi, a génkonverzió előtti fenotípusra emlékeztet.

Changes in bursal microenvironment in chickens after in ovo yolk stalk ligation

The bursal duct connects the cloaca with the bursa of Fabricius where the B-cell development progresses in the presence of enteral antigens. Around hatching, yolk content reaches the intestine through the vitelline duct located in the yolk stalk. In ovo yolk stalk ligation was developed which hindered any communication between the yolk sac and the gut lumen, leaving the vitelline circulation intact.

The results of the ligation of the vitelline duct showed several aspects of bursal underdevelopment: 1. the IgG positivity of the bursal secretory dendritic cells were not detectable during the first week of life, in spite of normal serum IgG level and the presence of normal cloacal microflora; 2. the maturation of the dendritic cells was impaired based on the missing 74.3 expression; 3. the number of B-cells in the follicles was greatly reduced and they showed an altered phenotype: they reexpressed sCD15 and chB1 gene expression was not detectable. This shows that the normal bursal development in the first week of life requires the intestinal transport of maternally derived (yolk) immunoglobulins.



19. A komplementaktiválódás lektinútja (E3)
Gál Péter
MTA, Biológiai Kutató Központ, Enzimológiai Intézet, Budapest

A komplementrendszer szerin-proteázokból álló kaszkádrendszer; a természetes immunitás részeként létfontosságú funkciókat lát el a fertőzések elleni védekezés során. A komplementrendszerről alkotott képünk az utóbbi években jelentősen megváltozott, elsősorban a komplementaktiválódás újabb útjának, a lektinútnak a felfedezése következtében. Csoportunk az elmúlt időszakban jellemezte a lektinút két legnagyobb menynyiségben jelen lévő szerin-proteázát, a MASP-1 és MASP-2 enzimeket. Megállapítottuk, hogy a MASP-2 képes autoaktiválódni, hasítja a C2 és C4 komponenseket, így egymagában be tudja indítani a komplementkaszkádot. A MASP-1 viszont nem hasít komplementkomponenseket, ezért szubsztrátjait a komplementrendszeren kívül kellett keresni. Kimutattuk, hogy a MASP-1 sok szempontból a trombinhoz hasonló enzim, és hasítja a trombin két szubsztrátját: a fibrinogént és a XIII-as faktort. Ez az aktivitás a természetes immunitás olyan ősi formáját képviseli, amelyet eddig még nem tanulmányoztak a gerincesekben. Elmondhatjuk tehát, hogy a lektinút nem egységes aktiválódási útvonal, hanem két, evolúciósan és funkcionálisan jól elkülönülő részből áll.

The lectin pathway of complement activation

The complement system is a cascade of serine proteases, and mediates essential functions during infection as a part of the innate immunity. Our view about the complement system has changed considerably in the recent years, due to the discovery of a new activation pathway of complement: the lectin pathway. We have recombinantly expressed and characterized the MASP-1 and MASP-2 serine proteases, which are the major enzymatic components of the initiation complex of the lectin pathway. We showed that MASP-2 is capable of autoactivation and it can cleave C2 and C4 subcomponents. MASP-2, therefore, can initiate the complement cascade without the contribution of any other protease. Since MASP-1 cannot cleave any complement component, its substrates must be found outside the complement system. We demonstarted that MASP-1 resembles in many respects to thrombin, and cleaves the two major substrates of thrombin: fibrinogen and factor XIII. This activity represents an ancient form of innate immunity that has not been studied in vertebrates yet. We concluded that the lectin pathway is not a uniform activation pathway, but it can be divided into two evolutionary and functionally distinct pathways.



20. Az APC-membrán (preszinaptikus oldal) kompartmentációja és szerepe a T-sejt-aktivációs küszöb és a T-sejt-szinapszis képződésének szabályozásában (P7)
Gombos Imre1, Detre Cynthia1, Vámosi György2, Szentesi Gergely3, Matkó János1
1Eötvös Loránd Tudományegyetem, Immunológiai Tanszék;
2MTA Sejtbiofizikai Kutatócsoport, Budapest;
3Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum,  Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

A gliko/szfingolipidben és koleszterinben gazdag membránmikrodomének - lipidtutajok/raftok - sokoldalú szerepet játszanak a T-lymphocyta-aktiváció szabályozásában és az úgynevezett T-sejtes immunológiai szinapszisok működésében. Jóval kevésbé ismert e szinapszisok "preszinaptikus oldala", az APC plazmamembránja (PM). Munkánk során azt vizsgáltuk, hogy az APC plazmamembránjában milyen szerepet játszanak a raftok a szinapszis működése szempontjából fontos felszíni molekulák (például: MHC/p antigén, kostimulátorok, adhéziós molekulák) kompartmentalizációjában, átrendeződéseiben. Vizsgálatainkban élő, nem fixált egér-, illetve humán APC-sejtvonalakat (2PK3 egér-B-lymphoblast, JY humán B-lymphoblast), valamint rájuk nézve specifikus T-sejteket (egér IP12-7 Th-hibridóma, illetve PBMC-ből szelektált humán CD8+ T-lymphocyták) használtunk. Az APC-k plazmamembránjában a mikrodomén struktúrák modulálására (destabilizálásra) alkalmazott módszereink: koleszterindepletio metil-b-cyclodextrinnel (MBCD-vel), szfingomielin-szintézis-gátlás Fumonisin B1-gyel, illetve többszörösen telítetlen zsírsavak (PUFA) beépítése; mikroszkópiás módszerekkel demonstráltuk e metódusok membránraftokat destabilizáló hatását.

A 2PK3 APC felszínén az MHC II- (I-Ed-) molekulák erősen foltos (patchy) eloszlást és jelentős kolokalizációt mutattak a raftok lipidmarkereivel (GM1 gangliozid). Ezt alátámasztották a jelentős molekuláris MHC II-homoasszociációt mutató FRET adataink is. A koleszterin kivonása (raftdestabilizáció) jelentősen csökkentette az MHC II-homoasszociáció, illetve a kolokalizáció mértékét, jelezvén, hogy a lipidtutajok alapvetően fontosak az APC-ken megfigyelt antigénbemutató MHC-kompartmentek stabilizálásában. Konjugálatlan APC-ken az ICAM-1 és CD58 adhéziós molekulák nem asszociáltak a raftokkal, de részleges detergensrezisztenciát mutattak (hideg TritonX100 nemionos detergenssel szemben). Ez arra utal, hogy nyugvó APC-ken ezen adhéziós molekulákat raftoktól független mechanizmusok (például cytoskeletalis kapcsolatok) stabilizálják a plazmamembránban. Hasonló tulajdonságokat mutattak a CD80 (B7-1) és a CD86 (B7-2) kostimulátorfehérjék is.

A humán és egér-APC-k membránraftjainak destabilizálása egyaránt jelentősen csökkentette képességüket immunológiai szinapszisok képzésére a megfelelő T-sejtekkel, ezt fluoreszcens mikroszkópiás konjugációs esszé segítségével mutattuk ki. Hasonló hatást váltott ki az APC-aktin cytoskeletonjának destrukciója is, jelezvén, hogy a stabil APC-T-sejt konjugátumok (szinapszisok) kialakulásában mind az APC-raftdomének, mind a cytoskeleton fontos szerepet játszanak. Azonos egér-Th-sejten különböző APC-kel végzett összehasonlító vizsgálataink azt is mutatták, hogy az APC-k konjugációs kapacitása erősen függ az MHC II- és CD80-expressziótól, ugyanakkor nem korrelál a CD86- és ICAM-1-szintekkel.

A raftok destabilizálása a 2PK3 APC plazmamembránjában jelentősen csökkentette az antigénspecifikus aktiváció mértékét a Th-sejtekben (csökkent Ca2+-szignál, CD69-expresszió, TcR-internalizáció) a kontroll APC-vel aktivált Th-sejtekhez képest. Ez a hatás, érdekes módon, különösen kisebb (szuboptimális) peptidantigén-dózis esetén volt jelentősebb. Eredményeink szerint az APC-plazmamembránban az MHC/p antigénraftok általi kompartmentalizációja igen fontos mechanizmus; befolyásolja a Th-sejtek aktivációs küszöbét és in vivo kisfokú (például perifériás) antigéndenzitás esetén is lehetővé teszi a T-sejtek aktiválódását. Ugyanakkor a stabil T-sejt-szinapszisok kialakulása szempontjából a raftok strukturális integritása mellett az aktin cytoskeletonjának épsége is kritikus. E mikrostruktúrák stabilitását érintő betegségek (például koleszterin-, szfingolipid-anyagcserezavarok vagy WAS) esetén a T-sejt-aktiváció (celluláris immunválasz) feltehetően e mechanizmusokon keresztül gyengül.

Támogatás: OTKA T 034393 (Matkó J.).

Compartmentation in the presynaptic (APC) membrane: implications in setting the threshold of T-cell activation/synapse formation

Glyco/sphingolipid- and cholesterol-rich membrane microdomains (rafts) play a multiple role in initiating and regulating T-cell activation in immunological synapses. The "presynaptic side" of these synapses, however, is much less characterized so far, therefore our aim was to investigate the role of lipid rafts in compartmentation and reorganisation of APC surface molecules (MHC/p antigens, costimulatory and adhesion molecules) that are presumably all critical in formation of functioning T-cell synapses. We used live, unfixed murine B lymphoblast (2PK3)-TH hybridoma (IP12-7) and human B lymphoblast (JY)-allospecific Tc lymphocyte (from PBL) cell pairs, as APCs and T-cells, to study these questions by means of flow cytometry and fluorescence/confocal microscopic imaging techniques. Plasma membrane (PM) of APCs was modified by cholesterol depletion with methyl-b-cyclodextrin (MBCD), by sphingolipid synthesis-inhibition with fumonisin B1 or by addition of polyunstaurated fatty acids (PUFA), all demonstrated to destabilize lipid rafts in our cells. 2PK3 APCs displayed a highly patchy, clustered distribution of MHC-II (I-Ed) molecules at their surface, showing in addition, a significant overlap with patches of GM1, a lipid marker of rafts at a submicron level. FRET data indicated a significant degree of MHC-II homoassociation at molecular (nanometer) level, as well. Cholesterol-depletion by MBCD largely decreased both the co-localization with rafts and the efficiency of FRET. In unconjugated APCs the adhesion molecules ICAM-1, CD58 did not colocalize with GM-1 patches, but proved to be partially resistant to cold TritonX-100 detergent (as detected by flow cytometric differential detergent resistance assay, FCDRA), even in cells with depleted membrane cholesterol. These data suggest that the organization of adhesion molecules in resting APCs is likely independent of rafts. Costimulatory molecules CD80 (B7-1) and CD86 (B7-2) both were detergent-resistant on a number of murine APCs and this property proved to be cholesterol-insensitive, suggesting that their detergent-resistance is due mainly to their cytoskeletal connections.

Fluorescence microscopy revealed a remarkable decrease in the capacity of both human and murine APCs to form conjugates with the corresponding T-cells upon disrupting raft in their PM, similarly to destruction of their cytoskeleton integrity. In addition, a comparison of two murine APCs (the strongly presenting 2PK3 and the weaker APC, A20) has shown that the conjugation capacity of APCs is strongly dependent on the MHC-II and CD80 expression, as well, but did not correlate with the ICAM-1 levels. Disruption of rafts in the PM of 2PK3 cells resulted also in a much weaker TH-cell activation signals (calcium rise, CD69 expression, TcR downregulation) than those observed with untreated APCs. This effect was more pronounced at lower antigen dose, and possibly brought about via reduction of antigen clustering. Our data suggest that the structural integrity of certain APC lipid rafts and the APC cytoskeleton are critical in setting up the T-cell activation threshold and formation of T-cell synapses.

Supported by research grant OTKA T 034393 (to Matkó J.).



21. Expression of activation antigens, costimulatory molecules and apoptosis markers on T and B lymphocyte subsets in cytopenic and non-cytopenic systemic autoimmune disorders (P8)
Gopcsa László1, Bányai Anikó1, Kilián Katalin1, Sandil Anita1, Németh Julianna1, Miklós Kata1, Pálóczi Katalin1
1Hematológiai és Immunológiai Intézet;
2Semmelweis Egyetem, Immunológiai-Hematológiai-Transzfuziológiai Klinika, Budapest

Intrinsic abnormalities both in T and B cell activation results in dysregulation of antibody production and may lead to abnormal T and B cell collaboration in systemic autoimmune disorders. However, a rapidly growing body of work investigated the role of programmed cell death (apoptosis) in the initiation of systemic autoimmunity. The aim of the study was to determine the expression of interactive ligand pairs CD40-CD40L necessary for mutual T cell and B cell costimulation and the expression of CD95 and granzyme-B molecules. Peripheral blood mononuclear cells of seven patients with systemic autoimmune disease were examined including three patients with autoimmune cytopenias. The diagnosis of the autoimmune disease was based on international criteria using large panel of autoantibody tests. CD3, CD4, CD5, CD8, TCRalpha/beta, TCRgamma/delta molecules were used for detection of T cells, CD19, CD23, CD5 antigens for detection of B cells and CD34, CD133 antigens for detection of stem and progenitor cells. CD38, CD40, HLA-DR, CD57, CD95 CD154, and ic. granzyme B molecules were detected as activation, costimulatory and apoptosis molecules. Three colour flow cytometry was performed and was evaluated by Becton-Dickinson FACS-Calibur. The results showed significantly high expression of CD19/CD23/CD5 triple positive B-cells in the cytopenic cases compared with the non-cytopenic autoimmune patients (10.38% versus 2.38%) suggesting high rate of autoreactive B cell population. Similarly, the proportion of CD3/HLA-DR/CD38 triple positive activated T cells was higher in the cytopenic patients (46.89% versus 5.95%). The expression of CD3/CD154++, CD3/CD95++, CD3/CD57++, CD3/gransyme B++ antigens was significantly higher in the cytopenic patients suggesting active effector function including apoptosis and cytotoxicity. There was no significant differences in the number of stem and progenitor cells of the unstimulated peripheral blood, however, the detailed evaluation of the bone marrow stem and progenitor pool seems to be important. In conclusion, the results show some differences in T cell activation and B cell hyperproliferation between the cytopenic and non-cytopenic systemic autoimmune patients, however, the role of apoptosis and CD40-CD40L interaction in regulatory mechanism of cytopenia need further elucidation.

Supported by grant 1/024/2001 Hungarian NKFP.



22. A humán patogén enterobaktériumok fertőzési mechanizmusa és a célsejtek membránszerkezete közötti összefüggések vizsgálata (E4)
Győrfy Zsuzsanna, Éder Katalin, Vizler Csaba, Balogh Gábor, Glavinas Hristos, Duda Ernő
MTA Szegedi Biológiai Központ, Biokémia Intézet, Szeged

A patogén enterobaktériumok (Escherichia coli, Salmonella- és Shigella-törzsek) szájon keresztül kerülnek az ember bélrendszerébe, ott megtámadják a bélhámot. Főleg endothel- és epithelsejtekben szaporodnak, de monocytákban és macrophagokban is túlélnek. A baktériumok szaporodása szempontjából kritikus esemény bejutásuk a célsejtbe; ez a baktérium által irányított (III-as típusú szekréciós rendszer) többlépéses, öszszetett folyamat eredménye: intim kapcsolat létesítése a baktérium és a célsejt membránja között, bakteriális effektorfehérjék bejuttatása az eukaryotasejtbe, aminek hatására megváltoznak a gazdasejt jelátviteli folyamatai, átrendeződik a cytoskeleton, és végbemegy a fagocitózis. Az ebben a folyamatban részt vevő bakteriális és gazdasejtfehérjék (együtt)működését befolyásolhatja az eukaryotasejt citoplazmamembránjának állapota, szerkezete.

A membránokban olyan, saját funkciójú, szerkezetileg elkülönülő, rendezett mikrodomének (raftok) találhatók, amelyek fontos szerepet játszanak például a jelátviteli folyamatokban, a receptormediált endocitózisban, a cytoskeleton szervezésében, a sejtadhézióban. Ha felszaporítjuk a célsejt membránjában a telítetlen zsírsavakat, vagy metil-béta-ciklodextrinnel (MbétaCD) kioldjuk a membránokból a koleszterint (aminek hatására a membránmikrodomének szétesnek), befolyásolni tudjuk a baktériumok által indukált fagocitózis folyamatát is. Szeretnénk tudni, csökkenthető-e a patogének bejutásának hatékonysága, ha megváltoztatjuk a célsejtek membránszerkezetét. Ezért összehasonlítjuk a kontroll és a módosított membránú célsejteken a baktériumfertőzés által indukált sejtpusztulás mértékét, a nitrogén-oxid, a termelődő citokinek, a transzkripciós faktorok mennyiségét, a cytoskeletonban végbemenő változásokat.

Relationship between the phagocytotic mechanisms of enterobacteria and the membrane structure of mammalian target cells

We use different genetic and biochemical methods to alter the physical state of mammalian cell membranes, which are either targets of enteropathogenic E. coli strains or actively phagocytose these bacteria. Our purpose is to study the importance of intact membrane microdomains in the interaction of eukaryotic and bacterial cells.

In our experiments we use the highly patogenic enterohaemorrhagic E. coli strain O157:H7 harboring on its chromosome a pathogenicity island LEE coding for the type III secretion system, and its attenuated derivative (O157:H7 DLEE) lacking this pathogenicity island as a negative control. We label the pathogens with fluorescent dyes (eg. Mitotracker Green FM) and follow the invasion of epithelial cells or phagocytosis by macrophages using flow cytometry. We follow the activation of transcription factors (NF-kappaB, AP-1), induction of cytokines (IL-1beta, TNF-alpha, IL-6), NO-production in macrophages and epithelial cells after bacterial cell entry.

To alter the membranes of mammalian cells and destabilize microdomains we use methyl-beta-cyclodextrin (Mbeta-CD) or filipin. We developed another approach to alter the physical state of cellular membranes by genetic transformation of the cells. The mild overexpression of the D9-desaturase enzyme increases the ratio of unsaturated fatty acids in membrane phospholipids decreasing the microviscosity of membranes.



23. Diszfunkcionális CD4+CD25+ szabályozó T-sejtek aktivitása psoriasisban (E37)
Gyulai Roland1, 2, Sugiyama Hideaki2, 3, Shimada Shinji3, Stevens R. Seth2, 4, McCormick S. Thomas2, Cooper D. Kevin2, 4
1Szegedi Tudományegyetem, Szent-Györgyi Albert Orvos- és Gyógyszerésztudományi Centrum, Bőrgyógyászati és Allergológiai Klinika;
2University Hospitals of Cleveland and Case Western Reserve University, Bőrgyógyászati Klinika, Cleveland, OH, USA;
3University of Yamanashi, Bőrgyógyászati Klinika, Yamanashi, Japan;
4VA Medical Center, Bőrgyógyászati Klinika, Cleveland, OH, USA

Autoimmun állatmodellekben a CD4+CD25+ szabályozó T-sejtek (Treg) központi szerepet töltenek be a szervezet saját fehérjéivel szembeni perifériás tolerancia biztosításában. Psoriasisban a bőrantigének hatására aktiválódó autoreaktív T-sejtek patogenetikai szerepe felveti a szabályozó T-sejtek esetlegesen elégtelen funkciójának lehetőségét.

Vizsgálatainkkal kimutattuk, hogy a normális és a psoriasisos PBMC azonos arányban tartalmaz CD4+CD25+ szabályozó T-sejteket. Ugyanakkor a psoriasisos szabályozó T-sejtek autológ CD4+CD25- sejtekre (responder sejt, Tresp) kifejtett gátlóhatása jelentősen csökkent a normális sejtekhez képest. Keresztezéses kísérletekkel igazoltuk továbbá, hogy a normális Treg-sejt képes a psoriasisos Tresp-sejt megfelelő szuppressziójára, ugyanakkor a psoriasisos Treg-sejtek nem gátolják hatékonyan a normális CD4+CD25- Tresp-sejtek proliferációját sem. Ezt követően megvizsgáltuk a psoriasisos bőrben lévő CD4+CD25+CTLA-4+ szabályozó T-sejtek funkcionális tulajdonságait. Áramlási citometriás vizsgálatokkal a Treg:Tresp arány 1:6-nak, illetve 1:3-nak bizonyult a pikkelysömörös dermisben és epidermisben. Psoriasisos dermisből izolált szabályozó T-sejtekkel - a perifériás vérben lévő Treg-hez hasonlóan - az 1:6 Treg:Tresp aránynál csak 20%-nál kisebb szuppressziót tudtunk elérni (a normális Treg 1:8-nál 50%-nál nagyobb gátlást biztosít). Vizsgálatainkkal először igazoltuk szabályozó T-sejtek jelenlétét és funkcionális defektusát egy gyulladásos humán betegség célszervében, a bőrben.

Dysfunctional CD4+CD25+ regulatory T cell activity in psoriasis

In murine models of autoimmunity, CD4+CD25+ regulatory T cells (Treg) are key elements in the maintenance of peripheral tolerance toward self-proteins. Because psoriasis is sustained by the ongoing activation of T cells responding to antigens in the skin, we asked if psoriatic T cell reactivity could be due to insufficient regulation by Treg. We found that CD4+CD25high Treg are present in equal proportions in normal and psoriatic PBMC. However, psoriatic Treg showed a markedly decreased capacity to suppress autologous CD4+CD25- responder T cell (Tresp) proliferation following antigen specific stimulation. To determine if this is due to Treg-resistant hyper-proliferative Tresp, we performed "criss-cross" experiments. Whereas normal Treg were fully capable of suppressing the proliferation of hyper-reactive psoriatic Tresp, psoriatic Treg could only insufficiently suppress normal Tresp. We next performed analytic and functional analyses of CD4+CD25+CTLA-4+ Treg in psoriatic skin. By flow cytometry, the ratio of Treg:Tresp in psoriatic dermis and epidermis was calculated as 1:6 and 1:3, respectively. Using purified psoriatic dermal Treg, we found that, as in blood, the 1:6 ratio provided <20% Tresp suppression, (whereas normal Treg suppression >50% at 1:8). These data demonstrate for the first time that Treg are present in an inflamed target organ, and are functionally impaired in a human disease.



24. Kísérletes bullosus pemphigoid modell (P9)
Husz Sándor1, Kiss Mária1, Jánossy Tamás2, Molnár János3, Marczinovits Ilona3, Korom Irma1, Dobozy Attila1
Szegedi Tudományegyetem,
1Bőrgyógyászati Klinika,
2Sebészeti Műtéttani Intézet,
3Élettani Intézet

A subepidermalis hólyagképződéssel járó bullosus pemphigoid (BP) kialakulásában fontos szerepet játszanak a hemidesmosomák BP180 és BP230 fehérjéi ellen irányuló autoantitestek. Immundomináns és patogenetikai jelentőségű epitópokat már azonosítottak a transzmembrán BP180 fehérje extracelluláris részén, az intracelluláris elhelyezkedésű BP230 fehérje ellen irányuló autoantitestek patogenetikai szerepe azonban még nem tisztázott. Ezért tűztük ki célul egy olyan egérmodell kidolgozását, amelyen tanulmányozható a hólyagképződés mechanizmusa.

Nyulakat immunizáltunk a BP230 fehérje egy olyan antigenikus szegmentjét tartalmazó konstrukciójával, amely 74%-os homológiát mutat az egér- és a humán BP230 fehérje megfelelő szakaszán. Az immunizálás közben és után ellenőriztük az antitesttiterek alakulását hámszerveken (normális humán- és egérbőr, salt-split skin) indirekt immunfluoreszcenciás módszerrel és immunoblot eljárással, valamint ELISA technikával. Az immunizálás befejezése után jó titerű (1/2840, illetve 1/5680) és jó specificitású immunsavót nyertünk. Az ebből az immunsavóból nyert tisztított IgG-t használtuk fel a további vizsgálatokhoz. Kontrollált körülmények között CBA törzshöz tartozó újszülött egerek (n=7) hátbőrét oltottuk subcutan 5 mg IgG/testsúlygramm dózisú nyúl-IgG-vel. Hat óra elteltével az oltott állatok hátbőre kifejezett erythemát mutatott, míg a foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldattal vagy normálnyúl-IgG-vel oltott állatok hátbőrén az oltás helye feltisztult. 24 óra múlva fizikális vizsgálattal egy állatnál észleltünk hólyagképződést, de valamennyinél kifejezett maradt az erythema és pozitívnak bizonyult az úgynevezett sodrási tünet, ami az epidermis és a dermis elválására utalt. Az elvégzett immunhisztológiai vizsgálatok minden egérnél igazolták a nyúl-IgG-depozíció kialakulását lineárisan, a bazális membrán mentén; öt állatnál subepidermalis hólyagképződés jeleit észleltük. Hematoxilin-eozin festéssel szintén láthatóvá vált az epidermis elválása a dermistől, a subepidermalis hólyagképződés. A hólyag alatti dermisben enyhe gyulladásos folyamatra utaló jeleket figyeltünk meg.

Megállapítottuk, hogy a bullosus pemphigoid klinikai és immunhisztológiai jelei provokálhatók a BP230-ellenes antitestek segítségével.

Experimental mouse model of bullous pemphigoid

Bullous pemphigoid (BP) is an IgG-mediated autoimmune blistering disease targeting the hemidesmosomal plaque protein BP230 and the transmembrane protein BP180. Immunodominant and pathogenic epitopes associated with BP have been mapped to the extracellular domain of BP180, but the pathogenetic role of anti-BP230 antibodies remains unclear. To investigate this phenomenon, rabbit polyclonal antibodies were generated against the antigenic segment of the human BP230 antigen (BPAG 1, 1914-1934), a sequence which shows 74% homology in human and mouse BP230 protein. The rabbit polyclonal immune serum was tested on human and mouse skin by indirect immunofluorescence and immunoblotting, and also by the ELISA technique, using antigenic epitope-coated wells. The specificity and titres of the rabbit immune serum (1:2840) were suitable for passive transfer experiments. The purified rabbit IgG from immunized rabbit serum was transferred subcutaneously into the dorsal skin of neonatal CBA mice (n=7) in a dose of 5 mg IgG/50 microl. After 6 hours, the dorsal skin areas of the injected animals were markedly erythematous, whereas in the control animals injected with PBS or control rabbit IgG, the sites of injection cleared up. After 24 hours, one animal exhibited a small blister clinically, but the dorsal skin areas of all the injected animals were constantly erythematous and upon gentle friction produced fine persistent wrinkling of the epidermis. Mice were then sacrificed and immunohistological examinations revealed linear rabbit IgG deposition along the basement membrane zone of the perilesional mouse skin, and in five animals subepidermal blister formation was also demonstrated. The rabbit IgG deposition labelled the epidermal roofs of the vesicles. Haematoxylin-eosin stained sections showed the separation of the epidermis from the dermis, producing a subepidermal vesicle. A slight intradermal inflammatory reaction was also detected.

These findings demonstrate that antibodies against an antigenic epitope of BP230 protein can cause subepidermal blister formation in neonatal mice.



25. Gyengült humorális immunválasz mycobacterialis 65 kD-os hősokkprotein (Hsp65) ellen, gyulladásos bélbetegségben szenvedőknél (P10)
Huszti Zoltán, Prohászka Zoltán, Bene László, Fekete Béla, Füst György
Semmelweis Egyetem, III. Sz. Belgyógyászati Klinika, Budapest

A Crohn-betegség (CD) és a colitis ulcerosa (CU) krónikus lefolyású, relapsusokkal tarkított bélbántalom; a bélrendszer egyes szakaszainak gyulladásával és a nyálkahártya károsodásával járnak. A gyulladásos bélbetegségek (IBD) eredete ismeretlen, hátterében genetikai, környezeti és immunológiai hatások állnak. A hősokkfehérjék (Hsp) vagy stresszfehérjék filogenetikailag, funkcionálisan és immunológiailag erősen konzervatív szerkezetűek. Fontos szerepet játszanak a sejt életciklusában és a sejtben keletkező károsodások megelőzésében. Molekulatömegük alapján különböző családokba soroljuk őket (például: 60 kD, 70 kD, 90 kD). A 60 kD-os fehérjék csoportjába tartozó Hsp65 a gyomor-bél rendszerben jelen lévő baktérium, például a Helicobacter pylori és az E. coli immundomináns fehérjéje.

Előző eredményeink alapján - csökkent anti-Hsp65 IgG-szintet mértünk betegeink szérumában - azt feltételeztük, hogy ez a csökkent, lokális anti-Hsp immunválasz állhat a betegség hátterében.

Feltételezésünk bizonyításához egy második mérést is készítettünk: 125 gyulladásos bélbetegségben szenvedőt vizsgáltunk meg [74 Crohn-beteg (28 férfi, 46 nő, átlagéletkor 33±13,45 év), 51 colitis ulcerosás beteg (20 férfi, 31 nő, átlagéletkor 38±14,25 év) és 232 egészséges kontroll (89 férfi, 143 nő, átlagéletkor 46±11,31 év)].

A gyulladásos bélbetegségben szenvedőknél ismét csökkent Hsp65-ellenes antitestszintet mértünk, az egészséges kontrollokéhoz viszonyítva. A Crohn-betegeknél az IgG antitestek szintjének szignifikáns csökkenését találtuk az egészséges kontrollcsoportéhoz viszonyítva (p<0,05). A Hsp60-ellenes IgG-szintekben nem találtunk különbséget a betegek és az egészséges kontrollok között. Ezenkívül megmértük egy másik típusú bakteriális Hsp60 (E. coli GroEL fehérje) elleni IgG-szintet: csökkent IgG-anti-GroEL-szintet (p=0,0024) regisztráltunk.

Következtetésünk az, hogy a korlátozott antibakteriális Hsp60-antitest-válasz gyulladásos bélbetegségben szenvedő betegeknél nem csak a M. bovis Hsp65-re korlátozódik.

Impaired humoral immun response against mycobacterial 65 kd heat shock protein (Hsp65) in patient with inflammatory bowel disease

Crohn disease (CD) and ulcerative colitis (UC) are chronic disorders characterized by intestinal inflammation and mucosal tissue damage. The exact cause remains unclear, although genetic, environmental and immunological influences may also contribute to disease pathogenesis. The heat shock proteins (Hsp) or stress proteins are phylogenetically, functionally and immunologically highly conserved molecular chaperons. They play essential roles in life cycle and survival of the cells. Different families (e.g. 60 kD, 70 kD, 90 kD) of Hsp can be distinguished on the basis of their molecular weight. Hsp belonging to the 60 kD family of Hsp (Hsp65) are immune dominant proteins in some bacteria of the gastrointestinal flora such as H. pylori and E. coli.

We have reported earlier on the decreased levels of anti-Hsp65 IgG antibody levels in IBD patients and hypothesized that the impairement of the local anti-Hsp immune response may contribute to the chronic infection.

To prove our hypothesis a second study was organized including 125 patients with inflammatory disease [74 patients with CD (28 males, 46 females, mean age 33±13.45 years) and in 51 patients with CU (20 males, 31 females, mean age 38±14.25 years) and 232 healthy controls (89 males, 143 females, mean age 46±11.31 years)].

The levels of IgG antibodies against Hsp65 were lower in patients with IBD, as compared to healthy controls. Levels of IgG antibodies in patients with Crohn disease were significantly lower than in healthy controls (p<0.05). We have not found differences in the serum concentration of IgG anti-hsp60 antibodies of patients and healthy controls. Furthermore, a second type of bacterial Hsp60 preparation (E. coli GroEL protein) was also applied in the tests. We observed decreased levels of IgG antibodies against GroEL (p=0.0024) indicating that the impairment of anti-bacterial Hsp60 antibody levels is not restricted to one genus only.

In conclusion, our study indicates that the anti-bacterial Hsp60 antibody response is impaired in patients with IBD and this is not restricted to M. bovis Hsp65 only.



26. Humán M-sejtek in vitro megkülönböztetése (P26)
Igyártó Botond-Zoltán, Oláh Imre, Magyar Attila
Semmelweis Egyetem, Humánmorfológiai és Fejlődésbiológiai Intézet, Budapest

A nyálkahártyák védelmét szolgáló MALT (mucosal associated lymphoid tissue) speciális sejtjei az M-sejtek. E sejtek feladata a lumen felőli makromolekulák és kórokozó partikulumok transzportja a kiöblösödésükben ülő B- és T-sejtek, valamint a makrofágok felé. Molekuláris jellegzetességeik: az aktinstabilizáló fehérje (villin) citoplazmatikus megjelenése és a poli-Ig-receptor hiánya; emellett nyúlban vimentin- és UEA-1 lektin-pozitivitás, sertésben a citokeratin-18, patkányban a citokeratin-8 erősebb expressziója. Univerzális, minden fajban működő marker nem ismert. A humán M-sejtek azonosítását specifikus markerek hiányában félvékony és ultravékony metszeteken végezzük.

Laboratóriumunkban a humán M-sejtek in vitro differenciálását vizsgáljuk. Porózus membránra növesztett humán Caco-2 bélhámsejtvonal bazális felszínéhez B-lymphocytákat juttattunk. A humán eredetű B-lymphocyta-sejtvonalak közül egyesek nagyon hatékonyaknak bizonyultak a hámsejtek M-sejtekké transzformálásában (például Raji és BL-41/95-ös sejtvonalak), míg más lymphoid sejtvonalak esetében a lymphocyták hámsejtek közé vándorlása és az M-sejtes transzformáció kis hatásfokú volt (Daudi, ST-486, BL-41-es sejtvonalak). Az M-sejtes transzformációt mind morfológiai, mind pedig funkcionális vizsgálattal igazoltuk. A morfológiai vizsgálatok során különböző molekulák expressziós mintázatát követtük nyomon immunhisztokémiai módszerekkel: a hámsejtek közé vándorolt lymphocyták hatására az apicalis villin és az ICAM-1 expressziójának csökkenését, valamint a glikozilációs mintázat megváltozását figyeltük meg a transzformált hámsejtek apicalis felszínén. E sejtek elektronmikroszkópos vizsgálatakor a kefeszegély dezorganizációját, valamint a bevándorolt lymphocytákat körülfogó basolateralis zsebek kialakulását észleltük. Az így előállított M-sejtek partikulumszállító képességét - amely az M-sejtek tulajdonsága - bakteriális transzporttal igazoltuk.

A későbbiekben a transzformált hámsejtek felhasználásával monoklonális ellenanyagokat kívánunk előállítani a humán M-sejtek jellemzésére.

In vitro differentation of human m-cells

The mucosal surfaces of the body are protected by the mucosal associated lymphoid tissue (MALT). In the intestines, Peyer's patches are the major sites of the antigen and microorganism sampling. Here, the lymphoid tissue underlies a specialized epithelium that contains M-cells. These are modified epithelial cells that take up foreign (food-derived) materials and microorganisms and deliver them to lymphocytes and accessory cells of the MALT. They possess large intraepithelial pockets filled with B and T lymphocytes and macrophages.

To study the phenotype and functions of the rare M cells we used an in vitro differentiation model. The monolayers of Caco-2 (human adenocarcinoma) cells grown on porous filter were co-cultured with different human lymphoma cell lines. We investigated the efficiency of Raji, Daudi, BL 41 and BL 41/95 cell lines to transform the Caco-2 cells into M-cells. The transformation was detected by morphological (immunoflourescent staining and transmission electron microscopy) and functional tests. We found that Raji and BL-41/95 cell lines were capable to migrate trough the pores of the filter and settle into the epithelial monolayer with high efficiency. The epithelial cells above the immigrated lymphoma cells lost their brush border and the villin relocalized in the whole cell. Using the cell lines Daudi and BL-41, the migration of the lymphoid cell into the epithelial monolayer and the morpholocical transformation of the epithelial cells in to the M-cells was less efficient.

In the following experiments we analyzed the capacity of these transformed Caco-2 cells to transport of particles. FITC-conjugated E. coli particles were added to the apical surface of epithelial cells. At particular intervals bacterial numbers in the basolateral compartment was measured.

The results of transportation experiments were in good correlation with the morphological ones: in the Raji and BL 41/95 co-cultures the bacterial transport was high, while in Daudi and BL 41 co-cultures 2-3 magnitude less. Our results show that this in vitro model is a suitable tool in studying the differentiation and function of human intestinal M cells.



27. A galektin-1 mitochondrialis úton indukál apoptózist a Jurkat-T-sejtekben (E26)
Ion Gabriela, Fajka-Boja Roberta, Légrádi Ádám, Monostori Éva
MTA Szegedi Biológiai Központ, Szeged

Az emberi galektin-1 (gal-1) erőteljes immunmoduláló hatású lektin. Hatását azáltal fejti ki, hogy az éretlen corticalis thymocyták, az aktivált perifériális T-lymphocyták és a T-leukaemia-sejtvonalak apoptózisát okozza; ezzel értékes potenciális segítséget nyújthat az autoimmun és a gyulladásos betegségek kezelésében. Annak ellenére, hogy immunhomeosztázist szabályozó funkciójával az utóbbi években az érdeklődés fókuszába került, az apoptózis molekuláris mechanizmusát nem sikerült megfejteni.

Az itt bemutatott vizsgálatainkban elemeztük a humán rekombináns galektin-1 által okozott sejthalál biokémiai mechanizmusát.

Kísérleteinkkel a következőket állapítottuk meg:

1. A gal-1 kaszpázfüggő apoptotikus útvonalat stimulál; ezt azzal bizonyítottuk, hogy a széles spektrumú kaszpázinhibitor, a z-VAD.fmk gátolta a sejtek elhalását.

2. Az iniciátor kaszpáz-8 szerepét két módon is kizártuk: az apoptózist sem a specifikus inhibitor, az Ac-IETD, sem a kaszpáz-8 hiánya (J-C8mut a Jurkat-sejtekben) nem gátolta.

3. A mitochondrialis út szerepét igazolta a mitochondrialis membránpotenciál gal-1-kezelés hatására bekövetkező csökkenése. Ezt a folyamatot nem gátolta a kaszpázinhibitor z-VAD.fmk jelenléte, bizonyítva, hogy a kaszpázok aktiválódása a mitochondrialis változások után következik be.

4. Kísérleteink arra engednek következtetni, hogy a gal-1 az apoptotikus másodlagos messenger szfingolipid, a ceramid intracelluláris felszabadulásán keresztül fejti ki hatását. Ezt a feltételezést támogatja, hogy a ceramidútvonal ismert regulátorai, a p56lck tirozin-kináz (pozitív regulátor), a proteinkináz C aktiválódása (negatív szabályozó) és a ceramidmetabolit, a szfingozin-1-foszfát (negatív szabályozó) hasonló hatást fejt ki a gal-1-indukálta apoptózisra, mint azt a ceramid esetében leírták. A ceramid közvetlen szerepét a gal-1 citotoxikus hatásában a lektinkezelés után bekövetkező intracelluláris ceramidkoncentráció növekedésével bizonyíthatjuk.

Eredményeink azt bizonyítják, hogy a galektin-1 által indukált apoptózis elsődleges célpontja a mitochondrium, feltételezésünk szerint a folyamatot a gal-1 hatására bekövetkező intracelluláris ceramidszint-növekedés okozza.

Galectin-1 induces apoptosis in Jurkat T cells via activation of mitochondrial pathway

The human lectin, galectin-1 (gal-1) has strong immunomodulatory properties. It induces apoptosis of immature cortical thymocytes, activated peripheral T lymphocytes and T leukaemia cell lines. In according to this function, gal-1 has been implicated as a potential valuable therapeutic agent in autoimmune and inflammatory diseases. In spite of the increasing interest, the molecular mechanism of the apoptotic process is not well understood yet.

The present study characterizes the biochemical mechanism for human recombinant galectin-1 mediated programmed cell death of Jurkat T lymphocytes. We found that:

1. Gal-1 induced the apoptosis of Jurkat cells via a caspase-dependent mechanism since the broad-spectrum caspase inhibitor z-VAD.fmk inhibited galectin-1 mediated cell death.

2. The initiator caspase-8 (C8) did not contribute to the lectin triggered cell death because the C8 inhibitor Ac-IETD did not affect the apoptotic process. In order to clearly determine that C8 was not required for initiation of apoptosis we compared the sensitivity of the wild type and the caspase-8 deficient (J-C8mut) Jurkat cells toward gal-1 effect. Both cell lines were sensitive to gal-1 but the J-C8mut cells were resistant to TNF initiated apoptosis that was known to act through C-8 activation.

3. The role of the mitochondrion was proved by measuring the decrease of the mitochondrial membrane potential (Dym). The mitochondria had to act upstream to the caspase since z-VAD.fmk failed to inhibit the Dym in galectin-1 treated cells.

4. Our further results strongly indicated that Dym was regulated by the release of the intracellular apoptotic messenger, ceramide. The known inhibitors of the ceramide pathway - e.g. absence of p56, activation of protein kinase C and a metabolite of ceramide, sphingosine-1 phosphate greatly diminished the galectin-1 mediated apoptosis. Nevertheless the direct involvement of ceramide must be confirmed with determining the elevation of the intracellular ceramide level.

Taken our results together, it has been shown that the galectin-1 induced apoptosis is initiated through a mitochondrial entry site and it is indicated that the intracellular ceramide level could mediate the process.



28. A multidrog-rezisztencia és az immunfenotípus vizsgálata malignus hematológiai betegségekben (P35)
Jakab Katalin1, Gopcsa László1, Ádám Emma1, Domján Gyula2, Sarkadi Balázs1, Pálóczi Katalin1
1Országos Gyógyintézeti Központ;
2Szent Rókus Kórház és Intézményei, Budapest

Bevezetés: A különböző hematológiai betegségekben a kemoterápiával szembeni ellenállóképességért felelőssé tehető számos folyamatok egyike a multidrog-rezisztencia (MDR). Vizsgálatunkban az immunfenotípus és a multidrog-rezisztencia kapcsolatát kerestük B-sejtes akut lymphoid leukaemia (B-ALL) és myeloma multiplex (MM) miatt kezelt betegcsoportban.

Módszer: Tizenegy B-sejtes akut lymphoid leukaemiában és 14 myeloma multiplexben szenvedő beteg adatait elemeztük a prognosztikai faktorok alapján. Az ALL-es betegeknél a standard monoklonális antitestpanelt alkalmaztuk, míg a myeloma multiplexben szenvedőknél a CD38/CD56/CD19 hármas jelölés mellett az intracelluláris könnyűlánc-meghatározást is elvégeztük. A multidrog-rezisztenciában szerepet játszó fehérjék funkcionális vizsgálatára áramlási citometriai módszert alkalmaztunk. A kalcein-acetoxi-metilészter (AM) nem fluoreszkáló hidrofób molekula, ezt a rezisztens sejt - az MDR1 és az MRP nevű fehérjék segítségével - kipumpálja. A fluoreszkáló szabad kalcein sejten belüli mennyiségének csökkenése a drogtranszport aktivitásának mértékét jelzi. A transzport aktivitását (MAF) az alábbiak szerint állapítottuk meg: a kalcein akkumulációjának változását a festék kipumpálását gátló szer (például verapamil) jelenlétében, illetve a gátlószer hozzáadása nélkül értékeltük. Vizsgáltuk az összefüggést a MAF-értékek, a kemoterápiára adott válasz és a különböző prognosztikai faktorok (például életkor, fehérvérsejtszám, LDH, CD34, kromoszóma stb.) között.

Eredmények: Az ALL-es blasztok nagy arányban expreszszáltak CD34 progenitor-sejtmarkert. A kóros plazmasejtarány és a monoklonalitás-meghatározás korrelációt mutatott az immunfenotípus-vizsgálati eredményekkel. A multidrog-rezisztencia aktivitási faktor (MAF) értékei nem mutattak szignifikáns különbséget az ALL-es és az MM-es csoport összehasonlításakor. Ugyanakkor a myelomás betegek között az MRP-1 fehérje transzportaktivitása szignifikánsan kisebb volt, mint az MDR1-MAF érték (1,85±3,8, 5,92±7,45, p=0,05), egyéb transzportfolyamatok szerepét felvetve a rezisztencia mechanizmusában.

Következtetés: Az immunfenotípus segítségével meghatározott abnormális plazmasejtek klonalitása nem mutatott összefüggést a MAF-értékkel. Korábbi vizsgálataink alapján feltételeztük, hogy a funkcionális módszerrel meghatározott MAF-érték - az AML-es esetekhez hasonlóan - prediktív tényező lehet akut lymphoid leukaemiában és myeloma multiplexben. Azonban nem találtunk nagy mértékű MDR-aktivitást a kemoterápia-rezisztens esetekben. A kalcein-esszévizsgálat gyors, érzékeny és kvantitatív módszer az MDR-fehérjék transzportaktivitásának mérésére.

Evaluation of multidrug resistance with immunophenotype and karyotype in haematological malignancies

Background and objective: Multidrug resistance (MDR) is one of the mechanisms to explain unsuccessful chemotherapy of the patients with different haematological malignancies. In this study we aimed to evaluate and compare the drug resistance in B-cell acute lymphoid leukaemia (B-ALL) and multiple myeloma (MM) in association their immunophenotypes and karyotypes.

Methods: Eleven patients with B-ALL and 14 patients with MM were classified according to prognostic factors. Standard MoAt panel for ALL and triple labelled antibodies (CD38/CD56/CD19) and detection of intracellular light chains for MM were used. Here we describe the application of a functional flow cytometry based detection of multidrug resistance in cells. The hydrophobic acetoxymethyl ester (AM) derivative of calcein is actively extruded from multidrug resistant cells by both MDR1 and multidrug resistance associated protein (MRP), and the consequent reduction in cellular accumulation of the fluorescent free calcein provides a measure of drug transport activity. The measure of transport activity, the MDR activity factor (MAF) is expressed in a dimensionless value: calculated from the rate of calcein accumulation in the presence and absence of an inhibitor of dye extrusion, i.e. verapamil. We have studied the correlation between the MAF values and clinical response and other prognostic factors (for example: age, WBC, LDH level, CD34, karyotype, etc).

Results: CD34 progenitor cell antigen was presented by high proportion of ALL blasts. Both the abnormal plasmacell populations and their monoclonality in MM were confirmed by immunophenotyping, too. The mean MDR activity factor (MAF) values were not different in patients with MM and B-ALL. However, the mean MRP-1 values in MM were significantly lower than MAF-MDR-1 (1.85±3.8 versus 5.92±7.45, p=0.05) indicating the involvement of different transport in the resistance mechanism.

Conclusions: The immunophenotyping was helpful in detection of abnormal populations showing no correlation with the MAF. It has been suggested - on the bases of the earlier our study - that the MAF value obtained by this functional assay is a predictive factor in ALL and MM similarly in AML patients. However, we could not confirm high MDR activity despite of the failure of chemotherapy. Our results show the usefulness of flow cytometric calcein assay for fast, quantitative and sensitive measurement of the MDR proteins. Evaluation of multidrug resistance with immunophenotype and karyotype in haematological malignancies



29. A H-faktor kötődése a sejtfelszínen, szerepe haemolyticus uraemiás szindrómában (E5)
Józsi Mihály, Heinen Stefan, Manuelian Tamara, Zipfel F. Peter
Hans Knöll Institute for Natural Products Research, Jéna, Németország

A H-faktor a komplementrendszer alternatív útjának egyik fő szolúbilis szabályozófehérjéje. Haemolyticus uraemiás szindrómában (HUS) szenvedő betegek egy csoportjánál nemrég a H-faktor génjében mutációkat azonosítottak, ezek nagy része a fehérje C-terminális részén okoz aminosavcserét. A haemolyticus uraemiás szindróma tünetei: haemolyticus anaemia, thrombocytopenia és akut veseelégtelenség. Az érsérülés és az endothel károsodásának okai nem teljesen tisztázottak. Azonban a mutáns H-faktor-fehérjék a normális proteinhez képest kevésbé tudnak az endothelsejtekhez kötődni, ezért érdemes alaposabban tanulmányozni a H-faktor-mutációk szerepét a betegség kialakulásában.

A H-faktor a komplementet aktiváló és nem aktiváló (saját) felszíneket a polianionokat megkötő képessége révén különbözteti meg egymástól. Kísérleti adatok azt mutatják, hogy a fő felismerő domén a H-faktor C-terminális részén (SCR20) található, így a fehérje sejtfelszínre kötődve is megőrzi komplementszabályozó aktivitását, ami az N-terminális molekularészre lokalizálható (SCR1-4).

A H-faktornak a komplementtámadás elleni védekezésben, illetve a mutáns fehérjéknek a haemolyticus uraemiás szindróma kialakulásában játszott valószínű szerepe megértéséhez a H-faktor-endothelsejt kölcsönhatást részletesebben jellemeztük. Ehhez a H-faktor HUVEC-sejtekhez kötődését (HUVEC: humán köldökvéna eredetű endothelsejtvonal) vizsgáltuk, áramlási citometria segítségével. A H-faktor kötődése függ az ionerőtől, és heparinnal gátolható. A sejtfelszíni sziálsav-molekulák eltávolítása neuraminidázkezeléssel ugyancsak kisebb kötődést eredményez. A H-faktor felismerő doménjével (SCR20) reagáló monoklonális ellenanyagok a fehérje sejtekhez való kötődését gátolják. A H-faktorral rokon FHL-1-molekula - ez azonos a H-faktor első hét N-terminális doménjével és tartalmaz egy heparinkötő domént - a kötődést szintén gátolja.

Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a sejtek felszínéhez a H-faktor a polianionokat kötő doménjével kötődik. Mivel a haemolyticus uraemiás szindrómában szenvedő betegek plazmájából izolálható, SCR20-mutációt hordozó H-faktor-molekulák sejtekhez kötődése kisebb mértékű, feltételezzük, hogy az endothelfelszín komplementtel szembeni csökkent védelme hozzájárul a károsodáshoz és a haemolyticus uraemiás szindróma kialakulásához.

Binding of factor H to cell surfaces - relevance for hemolytic uremic syndrome

Factor H is the major fluid phase regulator of the alternative complement activation pathway. Recently, factor H gene mutations that cluster in the C-terminus of the protein have been identified in a group of patients with hemolytic uremic syndrome (HUS). Hemolytic uremic syndrome is a disease characterized by hemolytic anemia, thrombocytopenia and acute renal failure. The reasons for the endothelial damage and vascular injury are not well understood, however, binding of mutant factor H proteins to endothelial cells is weaker compared to the normal protein. Therefore it is of interest to identify the role of factor H mutations for the disease mechanism in more detail.

Factor H discriminates between complement activator and non-activator surfaces via its ability to bind polyanions, including sialic acids on non-activator (self) cells. Recent data indicate that the major recognition domain is at the C-terminus of factor H (SCR20), thus cell bound factor H maintains complement regulatory activity, which is localized to the N-terminus (SCRs 1-4). To understand the possible role of factor H in protection and mutated factor H in developing HUS, we characterized the interaction between factor H and endothelial cells in detail.

To this end, we studied binding of factor H to human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) by means of flow cytometry. Factor H binding is dependent on the ionic strength and is inhibited by heparin. In addition, removal of sialic acids from the cells by neuraminidase treatment reduces binding of factor H. Monoclonal antibodies recognizing SCR20, i.e. the recognition domain of factor H, inhibit the interaction. The binding of the complement protein is inhibited by the related FHL-1, which is identical with the N-terminal seven domains of factor H and has a heparin binding site.

These results show that factor H binds to endothelial cells via the polyanion binding recognition domain. As factor H derived from plasma of HUS patients with mutation in this domain has lower binding activity, we propose that reduced protection of the endothelial surface against complement attack contributes to the vascular damage and the development of HUS.



30. Activation of the TNF promoter by c-Jun and a c-Jun binding protein (P11)
Juhász Kata, Duda Ernő
MTA Biológiai Kutató Intézet, Szeged

We study the biological role of a novel protein found by yeast two hybride technique. The protein interacts with known molecules participating in cell signaling and regulatory processes, like c-Jun. Described as a c-Jun binding protein (CJBP), the protein has a PH-domain and a DNA binding domain indicating membrane association and participation in gene-regulatory mechanisms. In transient transformation experiments the protein was found to transactivate the human TNF a promoter. Clones of 293 cells transformed with the TNF promoter-luciferase (pGL3-TNF) reporter construct were transiently transfected with expression vectors coding for CJBP. The cells exhibited a significant transactivation, which seemed to be dependent on the dose of the protein. In experiments where CJBP and c-Jun expressing plasmids were used for transient transfection both CJBP and c-Jun activated the reporter gene in dose-dependent manner. When expressed simultaneously the two proteins acted like cooperating partners in inducing the transcription of the TNF promoter, and optimal activities were measured at approximately equimolar ratios. Both c-Jun and CJBP were able to act alone and showed highest activities at moderate expression levels. CJBP is expressed in most cell types investigated and could be a regular partner of c-Jun.

Experiments are under way to study DNA-binding and sequence specificity of the protein and its effect on the expression of other cytokine promoters.



31. Újabb adatok az akutfázis-fehérjék koncentrációjának változásáról krónikus C-hepatitises betegek szérumában, interferon-alfa-2b-kezelés során (P32)
Kalabay László1, Nemesánszky Elemér2, Csepregi Antal2, Pusztay Mária2, Dávid Károly3, Horváth Gábor3, Ibrányi Ervin4, Telegdy László4, Pár Alajos5, Bíró Adrienn1, Fekete Béla1, Gervain Judit6, Horányi Margit7, Ribiczey Pál8, Csöndes Mihály9, Prohászka Zoltán1, Füst György1
1Semmelweis Egyetem, ÁOK, III. sz. Belgyógyászati Klinika;
2Budai Irgalmasrendi Kórház, II. sz. Belgyógyászati Osztály;
3BM Központi Kórház;
4Szt. László Kórház, III. sz. Belgyógyászati Osztály, Budapest;
5Pécsi Tudományegyetem, ÁOK, I. sz. Belgyógyászati Klinika;
6Szt. György Kórház, Székesfehérvár;
7Országos Gyógyintézeti Központ, Molekuláris Diagnosztikai Részleg, Budapest;
8Zalaegerszegi Városi Kórház;
9Petz Aladár Kórház, Győr

Bevezetés és célkitűzések: Korábban két, akutfázis-fehérjeként viselkedő komplementkomponens (C9- és C1-inhibitor) koncentrációjának emelkedését észleltük interferon-alfa- (IFN-alfa-) kezelésre reagáló krónikus C-hepatitises betegek esetében, de nem észleltük a nem reszpondereknél.

Jelen munkánkban két pozitív (orozomukoid, OROSO; C-reaktív protein, CRP) és két negatív (transzferrin, TF; fetuin/alfa2HS-glikoprotein, AHSG) szérum koncentrációját tanulmányoztuk IFN-alfa-kezelés előtt és után.

Betegek: Ötvenkét egészséges egyén és 40 krónikus C-hepatitises beteg savóját vizsgáltuk, az utóbbiakat három hónapos ambuláns IFN-alfa-2b-kezelés (5 MIU/nap hat hétig, majd heti 2*5 MIU hat hétig) előtt és után. A betegeket a HCV-RNS-koncentráció legalább 1 log csökkenése esetén tekintettük reszpondernek.

Módszerek: Az OROSO-, TF- és AHSG-koncentrációt radiális immundiffúzióval, a CRP-szintet immunturbidimetriával mértük.

Eredmények: Az egészségesekhez viszonyítva a krónikus C-hepatitises betegek esetében szignifikánsan alacsonyabb OROSO- (p=0,0008) és CRP- (p=0,0273), valamint magasabb AHSG-szintet (p=0,0001) találtunk. A kezelés végére a reszponderek esetében az OROSO-szint emelkedett (p=0,0054), a TF-szint csökkent (p=0,0040), a nem reszpondereknél nem változott. Az AHSG szintje hasonlóképpen csökkent a reszpondereknél (p=0,0942) IFN-alfa-kezelés után.

Következtetések: Krónikus C-hepatitises betegek esetében az akutfázis-reakció paradox módon változik, ez összefüggésben állhat az IFN-alfa-kezelés sikerességével.

Támogatás: ETT 278/2003.

New data on acute phase protein levels in sera of patients with chronic hepatitis C during treatment with interferon-alpha-2b

Objective and design: Previously we observed elevation of serum concentrations of two acute phase protein complement components (C9 and C1-inhibitor) in patients with chronic hepatitis C, who responded to interferon-alpha (IFN-alpha) therapy but not in non-responders. In the present study we investigated the effect of IFN-alpha therapy on serum levels of two positive (orosomucoid - OROSO, C-reactive protein - CRP) and two negative (transferrin - TF, and fetuin/a2HS-glycoprotein - AHSG) acute phase proteins.

Subjects and treatment: We investigated blood samples of 40 patients with chronic hepatitis C at the onset and at the end of a three-month treatment with IFN-alpha-2b (5 MIU/day for six weeks, followed by 5 MIU t.i.w., outpatient setting) and of 52 healthy persons. Responders were defined by an at least one log drop in HCV RNA count.

Methods: Serum concentrations of OROSO, TF, and AHSG were measured by radial immunodiffusion, and CRP levels by immunotubridimetry, respectively.

Results: Compared to controls patients with chronic hepatitis C had significantly lower OROSO (p=0.0008), CRP (p=0.0273) and higher AHSG (p=0.0001) levels. By the end of treatment, OROSO concentration increased in responder (p=0.0054) but not in non-responder patients. By contrast, TF levels decreased in responder (p=0.0040) but did not change in non-responder patients. Similarly, in responders AHSG levels tended to decrease (p=0.0942) following IFN-alpha treatment.

Conclusions: The acute phase reaction is suppressed in patients with chronic hepatitis C that may be related to the responsiveness to IFN-alpha therapy.

Supported by the grant ETT 278/2003.



32. A HLA-DQ-tipizálás jelentősége a coeliakia diagnózisában (E16)
Kapitány Anikó1, Korponay-Szabó Ilma2, Sipka Sándor1
Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum,
1III. sz. Belgyógyászati Klinika,
2Gyermekklinika

Célkitűzés: A coeliakia (CD) vagy gluténszenzitív enteropathia (GSE) vékonybél-atrophiával járó malabszorpciós kórkép; alapja a gabonákban található gluténnel szembeni intolerancia. Szoros asszociáció áll fenn a betegség, valamint a HLA-DQ2- (DQA1*0501, DQB1*02 allélok kódolják) és a HLA-DQ8- (DQA1*03, DQB1*0302 allélok kódolják) molekulák előfordulása között. Irodalmi adatok szerint a betegek több mint 90%-a hordozza a HLA-DQ2 heterodimert, míg maradék 10%-uknál a HLA-DQ8-molekula van jelen. A debreceni klinikán kezelt betegek esetében is igazolni kívántuk a HLA-DQ2- és HLA-DQ8-molekulák kulcsszerepét a coeliakia kialakulásában.

Módszerek: A coeliakiás betegek, valamint az egészséges debreceni kontrollszemélyek HLA-DQ genotípusát szekvenciaspecifikus primerek alkalmazásával, PCR (SSP-PCR) vizsgálattal határoztuk meg.

Eredmények: A betegek 91%-a hordozza a HLA-DQ2-molekulát, 9%-uknál a HLA-DQ8-molekula jelenléte mutatható ki. A HLA-DQ2-molekulák előfordulása az egészséges kontrollpopuláció esetében is gyakori, 22%-uknál mutatható ki.

Következtetés: A HLA-DQ2- vagy HLA-DQ8-molekulák a coeliakia diagnosztikus markereként is szolgálhatnának. A HLA-DQ2- vagy HLA-DQ8-molekulák jelenléte megerősítheti, hiányuk megkérdőjelezheti a coeliakia diagnózisát.

HLA susceptibility genes in coeliac disease

Background: Coeliac disease (CD) or gluten-sensitive enteropathy is a common multifactorial disorder resulting from intolerance to cereal prolamins. CD susceptibility is strongly associated with HLA-DQ2 molecules (encoded by DQA1*0501 and DQB1*02 alleles) and HLA-DQ8 molecules (encoded by DQA1*03 and DQB1*0302 alleles). More than 90% of patients with CD in most populations that were tested carry the HLA-DQ2 heterodimer. HLA-DQ8 molecule has been shown to associate with CD in cases in which HLA-DQ2 is not present.

Aim: To estimate the freqency of HLA- DQ2 and HLA-DQ8 in patiens with CD treated at the University of Debrecen.

Methods: The HLA-DQ alleles were genotyped from patients with CD and healthy control persons by use of sequencespecific-primer PCR (SSP-PCR) method.

Results: 91% of the patients carry the HLA-DQ2 and the remaining 9% the HLA-DQ8 risk molecules. The HLA-DQ2 molecules are also rather common in the healthy control population, taking about 22%.

Conclusion: HLA- DQ2 or HLA-DQ8 alleles are necessary but not sufficient for the development of the disease. The presence or the absence of these HLA-DQ risk alleles can confirm or exclude the diagnosis of CD.



33. Foszfopeptidek és jelátvitel: molekuláris interakciók azonosítása és funkcionális vonatkozásaik (P12)
Kertész Ákos1, Tóth Gábor2, Arató Krisztina2, Medgyesi Dávid2, Sármay Gabriella2
1Semmelweis Egyetem, Klinikai Kutató Központ;
2Eötvös Loránd Tudományegyetem, Természettudományi Kar, Immunológiai Tanszék, Budapest

A sejtek növekedésének és differenciálódásának szabályozásában kiemelkedő szerep jut a fehérjék tirozinoldalláncokon végbemenő foszforilációjának és defoszforilációjának. A sejtaktiváció során az SH2-doméneket tartalmazó tirozin-foszfatáz SHP-2 a sejtmembránhoz jut; ott számos, tirozinon foszforilált molekulával léphet kapcsolatba, mint például receptor-tirozin-kinázok, adhéziós molekulák és adapterfehérjék. Az SHP-2-nek a jelátviteli kaszkádban betöltött, sejtnövekedést előidéző pozitív szabályozószerepe felhívja a figyelmet a tumoros folyamatokban játszott lehetséges részvételére, s ezáltal célmolekulává válhat egyes rákos megbetegedések terápiás kezelésénél.

Vizsgálataink során FcgammaRIIb és Gab1 eredetű, tirozinon foszforilált szintetikus peptidek SHP-2-foszfatáz-aktivitást befolyásoló hatását mértük foszfatáz ELISA rendszer segítségével, ennek során a szintetikus peptidek defoszforilációját detektáltuk. A korábbi vizsgálati eredmények szerint az Fcg-receptor foszforilált ITIM-motívuma és a Gab1-molekula (621-633) foszforilált peptidszekvenciája egyaránt erősen kötődik az SHP-2 fehérjéhez. Kimutattuk, hogy mindkét peptid az SHP-2 szubsztrátja, de csak a Gab1 peptid fokozza hatásosan az SHP-2 aktivitását.

Ugyanezen peptidekkel sejtaktivációt is végeztünk, L-a-lizofoszfatidil-kolinnal (LPC) permeabilizált, humán Burkitt-lymphoma-sejteken (BL41). A különböző foszfopeptidekkel végzett kezelés után a sejteket lizáltuk, majd - Western blot technika segítségével - a fehérjék tirozinfoszforilációjának mértékét mértük. Az eredmények azt mutatják, hogy a foszforilált ITIM peptid (P-ITIM) számos fehérje tirozinfoszforilációját indukálja, míg a Gab1 peptid kevésbé mutatkozott hatásosnak ebben a vonatkozásban.

Vizsgálataink célja a tirozinfoszforiláción alapuló molekuláris kapcsolatok feltérképezése a jelátviteli hálózatban; emellett olyan molekulákat kutatunk fel, amelyek a jövőben terápiás kezelések célpontjaivá válhatnak a jelátviteli folyamatok rendellenes működésének következtében kialakuló betegségeknél.

Phosphopeptides and cellular signaling: identification of binding partners and functional consequences

Tyrosine phosphorylation plays an important role in controlling cellular growth, and differentiation. Upon activation of cells with different stimuli, the SH2-domain containing protein tyrosine phosphatase SHP-2 is recruited to the plasma membrane where it can associate with a number of tyrosine phosphorylated molecules, including receptor tyrosine kinases, multisite adapter proteins and cell adhesion molecules. The positive regulatory role of SHP-2 in signal cascades leading to cell growth suggest involvement in tumorigenesis, raising the possibility that SHP-2 may be a target in the treatment of some forms of cancer.

We investigated the influence of synthetic tyrosine phosphorylated peptides corresponding to FcgammaRIIb and Gab1 sequences on the activity of recombinant SHP-2 by phosphatase-ELISA where the level of dephosphorylation of synthetic phospho-peptides was detected. Previous studies have shown that a phosphopeptides corresponding to the immunoreceptor tyrosine based inhibitory motif (P-ITIM) of Fcg receptor IIb and a phosphorylated motif of Gab1 (621-633) respectively, associate to SHP-2 with high affinity. Now we have shown that both peptide may serve as substrate for SHP-2, but only Gab 1 peptide activates SHP-2 phosphatase activity.

Moreover, we tested the effect of the same phosphopeptides on cell activation using permeabilizated human Burkitt lymphoma cell line (BL 41). The permeabilizing agent was L-a-lysophosphatidyl cholin (LPC). After the treatment with different phosphopeptide we analysed the level of tyrosyne phosphorylation in cell lysate samples by Western blotting. The results revealed that the P-ITIM peptide induced tyrosine phosphorylation of several proteins, while Gab1 peptide was less efficient.

Based on such studies we aim to understand phosphotyrosine-based molecular interactions within signaling networks and to find new therapeutic target molecules for possible future treatment of diseases associated with impaired signaling.



34. A lokálisan alkalmazott immunszuppresszív szerek hatása a keratinocyták immunfunkcióira (P30)
Kis Kornélia1, Bodai László2, Polyánka Hilda2, Pivarcsi Andor2, Soós Gyöngyvér1, Bata Zsuzsanna1, Kemény Lajos2
Szegedi Tudományegyetem,
1Gyógyszerésztudományi Kar, Klinikai Gyógyszerészeti Intézet,
2Általános Orvostudományi Kar, Bőrgyógyászati és Allergológiai Klinika

A lokális immunszuppresszív kezelés széles körben alkalmazott terápia a gyulladásos bőrbetegségek (például pikkelysömör, atópiás dermatitis) kezelésében. A gyulladásgátló szerek terápiás hatásuk mellett a keratinocyták immunválaszát elnyomva csökkenthetik az epidermis patogénekkel szembeni ellenállóképességét.

Kísérleteink során különböző immunszuppresszív szerek hatását vizsgáltuk lipopoliszachariddal (LPS) indukált, illetve indukálatlan humán keratinocyta-sejtvonalon (HaCaT) és epidermalis keratinocytákon. A szintetikus kortikoszteroid budesonid- és a makrolid tacrolimus- (FK506-) kezelés kontrolljául vivőanyaggal kezelt minták szolgáltak. A konzervált mikrobiális molekulaszerkezeteket felismerő TLR2- és TLR4-receptorok mRNS-expresszióját, illetve az IL-1-a-, IL-8- és TNF-a-expressziót kvantitatív RT-PCR segítségével, a citokinek fehérjeszintjét ELISA-val mértük.

A budesonid mindhárom vizsgált citokin transzkripciós alapaktivitását szuppresszálta; a tacrolimus csak az IL-8 mRNS-szintjét gátolta. Az IL-8 szintjének csökkenését fehérjeszinten is kimutattuk a budesonid esetében; a tacrolimus nem okozott szignifikáns változást. Epidermalis keratinocytákban a budesonid nagyobb mértékben csökkentette az LPS által indukált IL-8-mRNS-expressziót, mint a tacrolimus. A IL-1a és a TNF-a LPS által kiváltott transzkripciós aktivációját mindkét szer enyhén csökkentette. A vizsgált körülmények között egyik immunszuppresszáns sem változtatta meg szignifikánsan a TLR2- és TLR4-receptorok kifejeződését. Amellett, hogy mind a budesonid, mind a tacrolimus hatékony a gyulladásos bőrbetegségek kezelésében, vizsgálati eredményeink arra utalnak, hogy a tacrolimus kevésbé csökkenti a keratinocyták immunfunkcióit.

Effect of topical immunsuppressant drugs on immune functions of keratinocytes

Immunosuppressant therapy is widely used in the treatment of inflammatory skin diseases such as psoriasis and atopic dermatitis. Beside its therapeutic effects, application of topical anti-inflammatory drugs may render the epidermis more vulnerable to invading pathogens by suppressing innate immune responses in keratinocytes.

In order to evaluate and compare the immunosuppressive effects of different immunosuppressant drugs on keratinocytes we treated lipopolysaccharide (LPS) stimulated and unstimulated HaCaT and human epidermal keratinocytes with the synthetic corticosteroid budesonide and the macrolide lactone tacrolimus (FK506). To determine the effects of the drugs on gene expression levels, budesonide and tacrolimus treated samples were compared to vehicle treated controls.

The expressions of the pattern recognition receptors (PRRs) TLR2 and TLR4 were measured by quantitative RT-PCR and pro-inflammatory cytokines IL-1a, IL-8 and TNFa were monitored by quantitative RT-PCR and ELISA. We have found that budesonide suppressed the basal transcription levels of all three cytokines, while tacrolimus moderately inhibited only the expression of IL-8 mRNA. The inhibition of IL-8 production by budesonide could also be demonstrated by ELISA. On the other hand, tacrolimus did not change the IL-8 protein level significantly. In freshly separated keratinocytes, LPS induced
IL-8 production was markedly suppressed by both drugs, budesonide having the stonger effect. Both budesonide and tacrolimus had a mild suppressive effect on LPS induced TNFa and IL-1a expression. Neither drugs affected significantly the expression levels of PRRs under these conditions. Although tacrolimus and budesonide are both effective treatments in inflammatory skin diseases our data suggest that tacrolimus has a milder suppressive effect on keratinocyte immune functions than budesonide.



35. In vitro rendszerek létrehozása az FcRn-receptor által közvetített IgG-kötés és -transzport elemzésére (P29)
Kis Zsuzsanna1, Mayer Balázs1, Doleschall Márton1, Jancsik Veronika2, Frenyó V. László1, Kacskovics Imre1
Szent István Egyetem, Állatorvos-tudományi Kar,
1Élettani és Biokémiai Tanszék,
2Anatómiai és Szövettani Tanszék, Budapest

Munkacsoportunk kérődző állatokban tanulmányozza az IgG-molekulák FcRn-receptorhoz kapcsolódását és e receptor által megvalósuló transzportját. Tekintettel arra, hogy ezekben a fajokban igen szelektív immunglobulin-transzport valósul meg a tőgy epithelsejtjein keresztül a vérből a szekrétum irányába, kulcsfontosságú annak eldöntése, hogy a szarvasmarha-FcRn (bFcRn) a két domináns IgG-alosztály (IgG1, IgG2) közül melyikhez kapcsolódik nagyobb affinitással, s melyiket transzportálja hatékonyabban. E célok elérése érdekében két in vitro rendszert hoztunk létre, amelyek vélhetően alkalmasak e kérdések vizsgálatára.

A receptor-ligandum kötésvizsgálatok során jelentős nehézséget okoz, ha a sejtfelszíni receptor a ligandum megkötését követően internalizálódik egy gyors receptorközvetített endocitózis révén. Ez a jelenség az FcRn-mediált IgG-transzcitózis esetén is jellemző. Egy nemrégiben megjelent közlemény adatai arra utalnak, hogy a patkány-FcRn internalizációja jelentősen csökken a receptor citoplazmikus régiójának eltávolításával. Első lépésként két olyan GFP-kapcsolt (GFP: green fluorescent protein, zöld fluoreszcens fehérje) konstrukciót hoztunk létre, amelyek egyfelől a teljes cDNS-molekulát (wtFcRn-GFP), másfelől a citoplazmikus régió nélküli cDNS-molekulát képes expresszálni. Az ilyen módon előállított két kimérával MDBK-sejteket transzfektáltunk, majd az expresszálódó fehérjék lokalizációját fluoreszceinmikroszkóppal elemeztük. Míg a wtFcRn-GFP a citoplazma vesiculumaiban akkumulálódott, a csonkolt változat homogén eloszlást mutatott. Ez a megfigyelés eltérő szignálmechanizmusra utal, de a csonkolt változat rendszerünkben történő alkalmazhatóságának elbírálására további vizsgálatokat végzünk.

Epithelsejtek transzcitózisát leginkább az IgA-pIgR transzportján keresztül, MDCK sejtvonal (Madin-Darby canine kidney cells - a Madin-Darby-kutya vesesejtjei) alkalmazásával elemzik. Minthogy az IgG FcRn-közvetítette transzportját fajspecifikus rendszerben (szarvasmarha) kívánjuk elemezni, számos sejtvonalat vizsgáltunk meg ebből a szempontból. Ezek közül az MDBK sejtvonalat (Madin-Darby bovine kidney: Madin-Darby-szarvasmarha vesesejtje) találtuk alkalmasnak, mivel polarizált módon, egy sejtrétegben (monolayer) nő, a sejtek tight junction típusú kapcsolatot képeznek egymással és nagy elektromos ellenállást mutatnak Transwell rendszerben. Mindezek alapján arra számítunk, hogy az MDBK sejtvonalat fel tudjuk használni szarvasmarhánál az IgG FcRn-közvetített transzportjának elemzésére.

In vitro systems to study the bovine FcRn mediated IgG binding and transcytosis

Current studies in our laboratory involve FcRn mediated IgG binding and transport experiments in bovine epithelial cells. Since there is a high selectivity in the transport of immunoglobulins from the maternal plasma across the mammary epithelial cells into the secretion in ruminants, it would be of critical importance to analyze the binding affinities and transporting capabilities of IgG1 and IgG2 (the two dominant IgG isotypes in blood) for the bovine FcRn. To achieve these goals we have created two in vitro cell culture systems which presumably provide appropriate environ-
ments to investigate FcRn mediated binding and transcytosis.

There is a great difficulty in receptor binding studies in those cases when the associated receptor-ligand complex internalizes by a rapid receptor-mediated endocytosis as is the case of the FcRn mediated IgG transcytosis. A recent study has indicated that FcRn mediated internalization in a rat model could be greatly reduced by deleting the cytoplasmic-tail of the receptor. As a first step we have constructed two forms of bovine FcRn-green fluorescent protein (bFcRn-GFP) chimeras: a wild type (wt)-FcRn-GFP chimera and another cytoplasmic tail deleted (tailless) construct. We could observe difference after having them expressed in MDBK cells and analyzed their localization under fluorescence microscope. The wt-FcRn-GFP localized in vesicles within the cytoplasmic region, while the tailless-form showed homogeneous distribution. This observation suggests altered signaling mechanisms although the worth of this tailless construct in our receptor binding studies is under current investigation.

Up to now there is only one cell culture model that has been used extensively, the transport of IgA from the basolateral to the apical surface of Madin-Darby canine kidney cells by the polymeric immunoglobulin receptor (pIgR). Since we would like to study the FcRn mediated IgG transcytosis in species specific (bovine) background we have checked multiple bovine epithelial cell lines if they would fit to this requirement. We report here that Madin-Darby bovine kidney (MDBK) cells grow as polarized monolayer, form tight junction and develop high electrical resistance in Transwell system. We anticipate that the MDBK cell culture model will allow further elucidation of the mechanism of IgG transport by bovine FcRn.



36. Neuropeptid-receptorok kifejeződésének vizsgálata pikkelysömörben szenvedő betegek tünetmentes és tünetet mutató bőrében (P31)
Kiss Mária1, Husz Sándor1, Kemény Lajos1, Günter Michel2, Alireza Mirmohammadsadegh2, Thomas Ruzicka2, Dobozy Attila1
1Szegedi Tudományegyetem, Bőrgyógyászati és Allergológiai Klinika, Szeged;
2Heinrich-Heine-University, Department of Dermatology, Düsseldorf, Németország

Számos adat utal arra, hogy a bőr idegvégződéseiből felszabaduló neuropeptidek szerepet játszanak a gyulladásos bőrbetegségek kialakulásában. A gyulladással és keratinocyta-hiperproliferációval járó pikkelysömörben az innerváció sűrűbbé válásával nő a változatos immunmoduláló és növekedésifaktor-szerű hatású neuropeptidek mennyisége. A pikkelysömörös bőrben a növekedett neuropeptid-koncentrációra adott gyulladásos válaszreakció függ a hámsejtek specifikus neuropeptidreceptor-expressziójától.

Munkánkban öt egészséges személynél és 11 pikkelysömörben szenvedő betegnél, öt tünetmentes és 11 tünetet mutató bőrből vett biopsziában vizsgáltuk a substance P-receptor (NK-1R), a kalcitonin génnel összefüggő peptid receptor (CGRP-1R), a melanokortinreceptor (MC-1R) és a vazoaktív intestinalis peptid két receptortípusának (VIP-1R és VIP-2R) mRNS-kifejeződését.

Az egészséges bőrből vett biopsziákban a melanokortinreceptor kivételével nem tudtunk neuropeptidreceptor-expreszsziót detektálni. Ezzel szemben a tünetmentes pikkelysömörös bőrben megjelentek az NK-1R és a CGRP-1R mRNS-ei is. Szemikvantitatív becsléssel megállapítottuk, hogy a tünetet mutató bőrben a tünetmenteshez viszonyítva nagyobb arányban fejeződött ki az NK-1R és a CGRP-1R, valamint kimutathatóvá vált a VIP-1-receptor. A pikkelysömörös tünetmentes bőrben megfigyelhető SP- és CGRP-receptor-expresszió "készenléti állapotot" jelezhet a neuropeptidek gyulladáskeltő és proliferációt serkentő hatásaihoz. A tünetet mutató bőrben a fokozott neuropeptid-jelenlét fokozott neuropeptidreceptor-kifejeződéssel is együtt jár.

Investigations of mRNA expression patterns of different neuropeptide receptors on lesional and non-lesional skin of patients with psoriasis vulgaris

The biological responses in the skin to different neuropeptides depend on the expressions of special neuropeptide receptors on the cells. In this work, substance P receptor (NK-1R), calcitonin gene-related peptide receptor (CGRP-1R), melanocortin receptor (MC1-R) and two types of vasoactive intestinal polypeptide receptors (VIP-1R and VIP-2R) were investigated as concerns the mRNA level in skin biopsies from 11 patients with a hyperproliferative inflammatory skin disorder, psoriasis vulgaris, and five healthy persons undergoing plastic surgery.

The biopsies were taken from psoriatic lesional and non-lesional areas. In the healthy control skin biopsies, only MCR-1R was detected. In contrast, in the lesional and even the non-lesional psoriatic skin, mRNAs of the specific receptors for substance P, calcitonin gene-related peptide and vasoactive intestinal polypeptide appeared. It seems that the non-lesional psoriatic skin display a special sensitivity for the stimuli of neuropeptides, via which neuropeptides may play an important role in the initiation of psoriatic lesions.



37. Az MHC III régió összehasonlító vizsgálata stroke-os betegeknél és egészséges személyeknél (P14)
Kiszel Petra1, Madarasi Irén Anikó1, Kovács Margit1, Széplaki Gábor1, Széplaki Zoltán2, Harcos Péter3, Prohászka Zoltán1, Szalai Csaba4, Füst György1
Semmelweis Egyetem,
1III. Sz. Belklinika Kutató Laboratóriuma,
2Neurológiai Klinikai Csoport;
3Szent Imre Kórház, Neurológiai Osztály;
4Heim Pál Gyermekkórház, Genetikai Laboratórium, Budapest

A nem klasszikus MHC-fehérjéket kódoló MHC III régióban elhelyezkedő génekre is nagyfokú genetikai polimorfizmus jellemző. Az itt található TNFA, HSP70-2, HSP70-HOM, C4A és C4B komplementkomponens gének egyes alléljai bizonyos
betegségek előfordulását valószínűsíthetik. A C4A és -B komplementkomponens esetében a genetikai változatosságot nemcsak a nukleotidpolimorfizmusok jelentik, hanem a gének méretében és számában is nagy diverzitás mutatkozik. A C4 gén genetikai egységet alkot a szomszédos génekkel, [ezek: RP (szerin/treonin nukleáris proteinkináz), CYP21 (szteroid 21-hidroxiláz), TNX (tenascin)], s ezt RCCX modulnak nevezzük. Az RCCX modul feltérképezésével határozhatjuk meg a C4 teljes genetikai polimorfizmusát.

Célkitűzés: Az MHC III régióban a TNFA, HSP70-2, HSP70-HOM, C4A és C4B genetikai polimorfizmusainak vizsgálata egészséges személyek és stroke-os betegek között.

Metodika: A TNFA promóterrégiójának -308-as és -238-as pozíciójánál lévő különbségeket 213 stroke-os beteg és 139 egészséges személy esetében vizsgáltuk meg, SSP-PCR/RFLP segítségével. A HSP70-2, HSP70-HOM gén polimorfizmusainak megállapításához is PCR/RFLP technikát állítunk be. A C4 gén diverzitását Southern-blot technika segítségével, RCCX modulra specifikus DNS-próbákkal határozzuk meg.

Eredmények: A TNFA promóterrégiójának -238-as pozíciójánál nem kaptunk különbséget; a -308-as pozíciójánál a -308A (TNF2) allél szignifikánsan ritkábban fordult elő a stroke-os betegek, mint az egészséges emberek esetében. Még nagyobb különbséget kaptunk akkor, amikor az analízist csak az ischaemiás stroke-on átesett betegekre korlátoztuk. Az öszszefoglaló megírásakor a HSP70-2, HSP70-HOM, C4A és C4B gének polimorfizmusvizsgálatai még folynak.

Következtetések: Eddigi eredményeink alapján a -308A (TNF2) allélt hordozó egyének esélye a vad -308G allélt hordozókéhoz képest kisebb arra, hogy stroke-ot szenvedjenek el. Feltételezhetjük tehát, hogy a -308A allél védőfunkciót tölt be. A komplex vizsgálatok teljes beállítása után felderíthetjük az MHC III régióban található gének és a cerebrovascularis érbetegség közötti kapcsolatot.

Comparative examination of MHC III region in patients with stroke and in healthy persons

The genes in MHC III region, which encode non-classical MHC proteins, are the most polymorphic genomic region. Some alleles of TNFA, HSP70-2, HSP70-HOM, C4A and C4B complement component genes may be in association with certain disease. The variety of C4A and C4B is generated through genetic differences in gene size, gene number and nucleotid polymorphisms. The C4 genes form a genetic unit together with neighbouring genes [RP (serine/threonine nuclear protein kinase), CYP21 (steroid 21-hydroxylase) and TNX (tenascin)], also known as RCCX module. We can determine the whole genetic polymorphisms with mapping of RCCX module.

Purpose: The genetic polymorphisms of TNFA, HSP70-2, HSP70-HOM, C4A and C4B in MHC III region will be analyzed in healthy persons and in patients with stroke.

Methods: The differences at positions -308 and -238 of TNFA promoter region were examined by SSP-PCR/RFLP in 213 patients with stroke and in 139 healthy persons. The polymorphisms of HSP70-2, HSP70-HOM genes will be determined also by PCR/RFLP. The diversity of C4 genes is defined by Southern blot technology with special DNA probes for RCCX module.

Results: We did not find differences at position -238 of TNFA promoter region, but at position -308 the frequency of -308A (TNF2) allele occured significantly rarely in patients with stroke, than in healthy persons. The difference was even more pronounced when the analysis was restricted to patients with ischaemia stroke. The analysis of genetic polymorphisms of HSP70-2, HSP70-HOM, C4A and C4B genes are in progress during the preparation of this summary.

Conclusions: Our results indicate that persons with -308A (TNF2) allele seems to be protected against stroke compared to persons with -308G (wild) allele. We can suppose, that -308A allele has a protective function. We think that after the set-up of complex MHC III determinations we will be able to show strong relation to cerebrovascular disease.



38. A TNF-alfa, az IL-8 és a CD14 gén polimorfizmusának vizsgálata Helicobacter pylori által indukált fekélybetegségben (E17)
Klausz Gergely1, Gyulai Zsófia1, Tiszai Andrea2, Lonovics János2, Mándi Yvette1
Szegedi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar,
1Orvosi Mikrobiológiai és Immunbiológiai Intézet,
2I. sz. Belgyógyászati Klinika

A Helicobacter pylori által okozott fekélybetegség kialakulásában bizonyított a gyulladásos citokinek aktiválódása.

Korábbi vizsgálataink során a lokális tumornekrózisfaktor-alfa (TNF-alfa) és az interleukin-8 (Il-8) mennyiségének szignifikáns emelkedését tapasztaltuk Helicobacter pylori-pozitív ulcusos betegek gyomorbiopsziás mintáiban. Mivel a citokintermelést gyakran az egyes citokingéneket reguláló régiók polimorfizmusa determinálja, megvizsgáltuk, hogy van-e összefüggés a TNF-alfa-, az IL-8- és a CD14-polimorfizmus, valamint a fenti betegség kialakulása között.

Módszerek: 60 beteg DNS-mintáiból a TNF-alfa-promóter 308 G-A mutációját RFLP metodikával (restriction fragment lenght polymorphism), az IL-8 génpromóter 251 A-T polimorfizmusát ARMS technikával (amplification refractory mutation system), a CD14 -260 C-T polimorfizmusát az olvadáspont-analízis módszerével vizsgáltuk. Kontrollként egészséges véradók perifériás véréből származó DNS-mintákat használtunk.

Eredmények: A különböző TNF-alfa és CD14 genotípusok előfordulási gyakorisága nem különbözött szignifikánsan az egészséges kontrollcsoport és az ulcusos betegek között. Ugyanakkor az IL-8 -251 A allél (homo- vagy heterozigóta) igen nagy gyakorisággal (72%) fordult elő fekélybetegek esetében, s ez fokozott IL-8-termeléssel járt együtt.

Következtetés: Az eredmények rávilágítanak arra, hogy a H. pylori által indukált fekélybetegség patomechanizmusában a genetikai különbségeknek jelentős szerep juthat. A korábban lokálisan megfigyelt, emelkedett TNF-alfa- és IL-8-termelésre vonatkozó genetikai prediszpozícióval kapcsolatban csak az IL-8-polimorfizmust tudtuk bizonyítani.

Polymorphic genes of TNF-alpha, IL-8 and CD14 in patients with Helicobacter pylori-induced peptic ulcer

Background: Activation of inflammatory cytokines plays an important role in the pathogensis of peptic ulcer. In earlier studies significantly higher tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) and interleukin-8 (IL-8) levels could be detected in gastric biopsy samples of ulcer patients. Since cytokine production is often determined by the nucleotide polymorphisms of cytokine genes, we investigated the relationship of the TNF-alpha, IL-8 and CD14 polymorphisms and the development H. pylori induced duodenal ulcer (DU).

Methods: DNA from 60 H. pylori positive DU patients were used for genetical experiments. The -308 polymorphism of TNF-alpha gene was determined by NcoI RFLP (restriction fragment lenght polymorphism), the polymorphism for IL-8 -251 by ARMS (amplification refractory mutation system) methods and the CD14 -260 polymorphism by melting point analysis. DNA isolated from healthy blood donors (n=50) served as controls.

Results: A significant difference could not be observed in TNF-alpha -308 and CD14 -260 polymorphisms between ulcer patients and the healthy controls. In contrast, allelic frequencies proved to be higher (72%) for the IL-8 -251 A allele, resulting in a significant overproduction of IL-8.

Conclusion: Host factors play an important role in H. pylori induced ulcer. Earlier data show TNF-alpha and IL-8 production are increased after H. pylori infection. Analysis of genetic predisposition for enhanced cytokine production resulted in a significant association only for the IL-8 polymorphism.



39. A 70 kD-os hősokkfehérjék elleni antitestek titere lényegesen magasabb a HIV-fertőzöttek, mint a HIV-szeronegatívok szérumában (E38)
Kocsis Judit1, Prohászka Zoltán1, 2, Bíró Adrienn1, Bánhegyi Dénes3, Füst György1, 2
1Semmelweis Egyetem, III. Sz. Belgyógyászati Klinika;
2MTA és Semmelweis Egyetem, Anyagcsere és Atherosclerosis Kutatócsoport, 3Szt. László Kórház, Immunológiai Osztály, Budapest

A hősokkfehérjék, közülük is elsősorban a 70 kD tömegű családjuk (Hsp70) fontos szerepet játszanak a HIV intracelluláris replikációjában. A Hsp70 sejtfelszíni expressziója fokozódik a HIV-fertőzött sejtekben, a HIV-virionokhoz asszociált hősokkfehérjék legnagyobb részét a Hsp70 képezi. Jelen munkánkban azt vizsgáltuk, hogy ezek a folyamatok befolyásolják-e a Hsp70-ellenes humorális immunválaszt is?

Negyvenhét HIV-fertőzött betegnél és 65 egészséges HIV-szeronegatív kontrollnál mértük meg ELISA módszerrel (antigénként rekombináns Hsp70-et használva) a Hsp70-ellenes IgG-antitestek szérumkoncentrációját. Tizenkilenc hatékony aktív antiretrovirális terápiával (HAART) kezelt beteg esetében longitudinális vizsgálat keretében 24 hónapig mértük az anti-Hsp70-titereket.

Az anti-Hsp70-antitest-titerek szignifikánsan (p<0,0001) magasabbak voltak a HIV-fertőzött betegek esetében [medián: 1409 (25-75, percentilis: 1031-2214 AU/ml)], mint az egészséges kontrolloknál [626 (429-970) AU/ml]. A 19 HIV-beteg esetében az antitestek titere szignifikánsan (p<0,001) csökkent a 24 (11-41) hónapig tartó HAART kezelés alatt: a kezelés előtt 1309 (887-2213) AU/ml, a 24 hónapos kezelés után pedig 640 (386-959) AU/ml értékeket mértünk, párhuzamosan a vírusmennyiség csökkenésével és a CD4+ sejtek számának növekedésével. Eredményeink arra utalnak, hogy a HIV-fertőzés kifejezetten növeli a Hsp70 elleni antitestek szérumszintjét. Ez valószínűleg összefüggésben áll a HIV-fertőzött sejtek fokozott sejtfelszíni Hsp70-expressziójával és a Hsp70 jelenlétével a HIV-virionok burkában.

Elevated levels of antibodies against 70 kd heat shock proteins in the sera of patients with HIV infection

Heat shock proteins, especially 70 kD heat shock protein play an important role in the life cycle of HIV-1 virus. 70kD heat shock protein is overexpressed in HIV infected cells and this is the most abundant heat shock protein associated with HIV virions. The aim of our study was to investigate whether HIV infection increases the extent of specific humoral immune response against 70 kD heat shock protein.

The serum concentration of anti-Hsp70 IgG antibodies was measured in 47 HIV-infected patients, and 65 healthy, HIV-seronegative persons. Nineteen patients on HAART were followed for 24 month in a longitudinal study. Anti-Hsp70 antibodies were measured by ELISA, using recombinant human 70 kD heat shock protein.

Levels of anti-Hsp70 antibodies were significantly (p<0.0001) higher in the HIV-infected patients [median: 1409 (25th-75th percentile: 1031-2214) AU/ml] than in healthy control subjects [626 (429-970) AU/ml]. In 19 HIV patients serum levels of anti-Hsp70 antibodies significantly (p<0.001) decreased during 24 (11-41) months long HAART [1309 (887-2213) AU/ml before and 640 (386-959) AU/ml during HAART], accompanied by viral load reduction and CD4+ count elevation. It is concluded that HIV-infection induces a marked increase in the anti-Hsp70 antibody levels, which is consistent with the enhanced expression of 70 kD heat shock protein on the surface of HIV infected cells and/or incorporation of the protein into the membrane of HIV virions.



40. Hereditaer angioneuroticus oedemás betegek csontanyagcseréjének vizsgálata (P3)
Kollár Tímea1, Fekete Béla2, Lakatos Péter3, Visy Beáta4, Németh Éva1, Farkas Henriette5
Semmelweis Egyetem,
1ÁOK, VI. és III. évfolyam;
2III. Sz. Belgyógyászati Klinika;
3I. Sz. Belgyógyászati Klinika;
4Fővárosi Önkormányzat Madarász utcai Gyermekkórház-Rendelőintézet;
5Semmelweis Egyetem, Kútvölgyi Klinikai Tömb, Budapest

A magyarországi HANO Központban (HANO: hereditaer angioneuroticus oedema) gondozott 86 beteget abból a szempontból vizsgáltuk, hogy az attenuált anabolikusszteroid- (danazol-) terápia milyen hatást fejt ki csontanyagcseréjükre. Ilyen irányú vizsgálattal kapcsolatos adatot nem találtunk az irodalomban.

Betegeink vérszérumából alkalikusfoszfatáz-, kalcium-, foszfát-, dehidroepiandroszteron-szulfát-, kollagénkeresztkötés-, valamint oszteokalcinszintet határoztunk meg. Húszévesnél idősebb betegeink esetében oszteodenzitometriás (ODM-) vizsgálatot végeztünk, kettős energiájú röntgenabszorpciometriás módszerrel. Harmincnyolc betegünk (20 férfi, 18 nő) részesült danazolkezelésben. Közülük 30 betegnél - 20 évnél idősebb lévén - ODM-vizsgálatot is végeztünk. A kezelt és a danazolt nem szedő betegcsoport ODM-értékei egyaránt normálisak voltak. Többszörös logisztikus regressziós analízis során a vizsgált paraméterek közül a kollagén-keresztkötés és az oszteokalcin szintjével, valamint a femurnyak magasságában
detektált Z-score értékével találtunk szignifikáns összefüggést. A danazolkezelésben részesültek között a kollagén-keresztkötés szintje szignifikánsan ritkábban esett a normálérték feletti tartományba [p=0,005, esélyhányados: 0,263 (0,103-0,672)].

Eredményeink alapján megállapíthatjuk, hogy a HANO-s betegek csontanyagcserére vonatkozó laboratóriumi és ODM-paraméterei nem különböztek az átlagpopulációra jellemző értékektől; a danazol csökkentette az oszteoklasztaktivitást.

Investigation of bone turnover in patients with hereditary angioedema (HAE)

The effect of an attenuated anabolic steroid (danazol) on bone turnover as investigated in 38 (20 male, 18 female) patiens treated with danazol at the Hungarian HAE Centre. Such studies have not been reported yet.

Alkaline phosphatase-, calciun-, phosphate-, parathormone-, dehydroepiandrosteron-sulphate (DHEA-S)-, b-cross laps-, and osteocalcin levels were measured in blood serum. Dual energy X-ray absorptiometry (DXA) was performed only in 30 patients over 20 years of age. Osteodensitometry (ODM) values were normal both in danazol-treated and controlled groups. Significant correlations have been found - used the multiple logistic regression analisis - between the variables of beta-cross laps, octeocalcin levels, Z-score values detected by the femoral neck and danazol treatment. The correlation of b-cross laps and osteocalcin concentration with danazol treatment proved to be negative, whereas Z-score values showed positive correlation with danazol treatment. b-cross laps and osteocalcin levels have been significantly lower in danazol treated group. Z-score values of danazol treated group tended to higher than those of controll group.

Our study shows that laboratory and ODM parameters of bone turnover of patients with HAE do not differ from those measured in standard population and that the danazol treatment appeard to decrease osteoclast activity.



41. A progeszteron indukálta blokkolófaktor (pibf) hatása a jelátviteli mechanizmusokra (E21)
Kozma Noémi1, Pár Gabriella1, Kiss Katalin2, Szeberényi József2, Szekeres-Barthó Júlia1
Pécsi Tudományegyetem, ÁOK,
1Orvosi Mikrobiológiai és Immunitástani Intézet,
2Orvosi Biológiai Intézet

Célkitűzések: A terhesség során a progeszteronfüggő immunológiai szabályozás egy 34 kDa molekulatömegű mediátorfehérje, az úgynevezett PIBF (progeszteron indukálta blokkoló faktor) közreműködésével valósul meg. A PIBF egyik legfontosabb hatása, hogy - a citokintermelés befolyásolása révén - gátolja a magzat számára káros NK-aktivitást. Korábbi kutatási eredményeink szerint a PIBF a receptorához kötődése után a citoplazmában erőteljes STAT6- és PKC-foszforilációt eredményez, gátolja a STAT4-aktivációt és alacsony szinten tartja az intracelluláris Ca++-koncentrációt, szerepet játszva a szelektív Th2-es típusú génexpresszió szabályozásában. A PIBF gén által kódolt fehérje 90 kDa molekulatömegű. Munkánkban azt vizsgáltuk, hogy a PIBF mely funkcionális egysége tehető felelőssé a korábban megismert jelátviteli utak aktivációjáért.

Módszerek: A PIBF-ből különböző funkcionális elemeket tartalmazó egységeket hoztunk létre, majd ezen konstruktokkal, illetve rekombináns PIBF-fel kezelt és kezeletlen sejtekben vizsgáltuk a STAT-fehérjék foszforilációját immunprecipitációval, sejtmagba történő transzlokációját gél-EMSA technikával (EMSA: electrophoretic mobility shift assay).

Eredmények: A PIBF-fel végzett kezelés, összehasonlítva a kezeletlen sejtekkel, a korábbi adatokhoz vártaknak megfelelően, a STAT6 fehérjék sejtmagba vándorlását eredményezte. A konstruktok közül a nukleáris lokalizációs szekvenciát is tartalmazó PN5-ös darab hozott létre hasonló hatást. A STAT4 transzkripciós faktor DNS-hez kötődését a sejtmagban nem tudtuk detektálni sem PIBF-fel, sem egyéb darabbal végzett inkubáció hatására, összehasonlítva a stimulálatlan lymphocytákban tapasztalt pozitivitással szemben.

Következtetés: Kapott eredményeink alapján mondhatjuk, hogy a PIBF receptorkötődése után a citoplazmában fokozott STAT6-, gátolt IL-12-indukált STAT4-foszforilációt eredményez. Ezt követően a dimerizálódott STAT6 fehérjék a sejtmagba transzlokálódva a DNS-molekulához kapcsolódnak, elősegítve a szelektív Th2-es típusú génexpresszió szabályozását. E funkció kialakításáért feltehetően a 13-as, a 14-es, a 15-ös, a 16-os exonokat tartalmazó PIBF-szakasz tehető felelőssé.

Signal transduction pathways mediating the effects of progesterone induced blocking factor (PIBF)

Objective: Immunologic effects of progesterone during pregnancy are mediated by a 34 kDa protein named the progesterone induced blocking factor (PIBF). PIBF induces production of increased Th2 cytokines, resulting a sharp reduction in NK activity, and this in turn contributes to the maintenance of pregnancy. Earlier data from our laboratory show that progesterone binding of the lymphocytes is followed by the release of PIBF that induces STAT6, PKC and inhibits STAT4 phosphorylation and had no effect on intracellular Ca++ levels. The cDNA of PIBF encodes a 90-kDa protein. This study was aimed at investigating which functional site of the PIBF had the same effects on the above mentioned signal transduction pathways.

Study design: For further localization of the region responsible for the biological activity in PIBF, we amplified sequences containing exons (constructs). Tyrosine phosphorylated STATs were immunoprecipitated, the nuclear translocation of the factors was detected by electrophoretic mobility shift assay (EMSA) in with PIBF or with constructs treated or untreated lymphocytes.

Results: PIBF induced nuclear translocation of the STAT6 in lymphocytes. From the constructs, the nuclear localization sequence (NLS) containing construct (PN5) had the same effect. The DNA binding of STAT4 was not detected in with PIBF or with constructs treated lymphocytes compared with the positivity in untreated cells.

Conclusion: Based on the above findings we suggest the following mechanism: Progesterone binding of the lymphocytes is followed by the release of PIBF that induces STAT6 and inhibits IL-12 induced STAT4 phosphorylation. The STAT6 dimers enter the nucleus and bind to the DNA resulting in a Th2 biased immune response. The construct containing exons 13, 14, 15, 16 is probably accountable for this kind of response.



42. Az SXWS tetrapeptidek kemotaktikus hatása és annak fizikokémiai háttere Tetrahymena pyriformisban - az SXWS és az identikus aminosavak átfedő kemotaktikus hatásai (E11)
Kőhidai László1, Láng Orsolya1, Illyés Eszter2, Sebestyén Ferenc2, Hudecz Ferenc3
1Semmelweis Egyetem, Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet, Budapest;
2Eötvös Loránd Tudományegyetem, Szerveskémiai Tanszék, Budapest;
3MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoport, Budapest

Jelen munkánkban az SXWS alpeptidtár kemotaktikus tulajdonságait vizsgáltuk egysejtű Tetrahymena pyriformis modellen. Az egyes citokinreceptorok extracelluláris doménjében is megtalálható SXWS motívumot az "X" pozícióban lévő aminosav kémiai karaktere alapján jellemeztük.

Adataink jelzik a peptid kemotaktikus aktivitásában az "X" hely meghatározó szerepét: a Glu- és a Thr-szubsztitúció (SEWS és STWS) kimagasló kemotaktikus aktivitású ligandokat eredményeznek, míg egyéb - például aromás - aminosavak pedig  kemorepellens peptidet (SWWS, SYWS, SFWS). A szerkezeti rokonságot mutató molekulák kemotaktikus potenciáljának eltérései (SNWS-SDWS, SRWS-SKWS, SIWS-SLWS) az alkalmazott modellsejt nagyfokú kemotaktikus diszkriminációs képességére utalnak. Feltételezhető, hogy az "X" helyen alkalmazott aminosavak eltérő fizikokémiai jellege (méret, hidrofóbicitás, solvent exposed area-SEA) szintén hatást fejt ki az eltérő kemotaktikus képességekre. A peptid változó aminosavának (X) mérete, valamint az SEA/tömeg aránya emelkedett volt a kemorepellens csoportban. A "kemotaktikus-range-fitting" jelenségében is eltérések mutathatók ki: az attraktáns SXWS peptidekre széles, a repellensekre szűk hatásspektrum jellemző. Az SXWS peptidek és az identikus aminosavak kemotaktikus hatása között megfigyelhető nagyfokú átfedés felveti annak lehetőségét, hogy az SXWS peptid második, "X" helyén elhelyezkedő aminosav speciális szerepet tölt be a kemotaxisreceptorokkal való interakciókban.

Az SXWS peptidekkel végzett kemotaktikus szelekció eredményei jelzik, hogy míg a poláros töltés nélküli oldalláncot tartalmazó aminosavak (például: Gln, Asn, Ser, Thr) jelenléte az "X" helyen az úgynevezett long-term kemotaktikus szignalizációban preferált (Chsel <1,25), addig a nem poláros vagy negatívan töltött oldalláncú aminosavak (például: Pro, Glu, Ile) az úgynevezett short-term kemotaktikus receptorokon keresztül hatnak (Chsel >1,25).

Chemotaxis induced by SXWS tetrapeptides in Tetrahymena - Overlapping chemotactic effects of SXWS sequences and their identical amino acids

Chemotactic potential of SXWS sequences - expressed in the extracellular domain of several cytokine receptors -, was investigated in Tetrahymena as a functional index of substitution with different amino acids in the X position of the tetrapeptide. Data obtained call attention that position X plays a special, determining role in the ligand, substitution with Glu or Thr (SEWS and STWS) cause extremely strong chemoattractant substances, while presence of other types (e.g. aromatic) amino acids results chemorepellent ligands. Diversities of chemotactic responses in structurally relative molecules (SNWS-SDWS, SRWS-SKWS, SIWS-SLWS) demonstrate also the capability for a sensible discrimination in the applied model cell. Presumably diversities of physicochemical characters (hydropathy, residual size, solvent exposed area-SEA) of the amino acids used to substitue ligands are responsible for the diverse chemotactic ability. In chemorepellent SXWS ligands the varied amino acids are featured with increased residual size and SEA/mass ratio. Phenomenon "chemotactic-range-fitting" shows also diversities, as wide range of effectiveness belongs to chemoattractant and narrow to chemorepellent SXWS molecules. The incredibly high overlapping chemotactic effects of the investigated SXWS peptides and the identical amino acids used in X position propose that the second member of the SXWS sequence perform a special role in interactions with the chemotaxis receptors in the membrane.

Data of chemotactic selection with the chemoattractant SXWS peptides shows that polar, uncharged amino acids (e.g. Gln, Asn, Ser, The) are preferred in the X position for the long-term chemotactic signalling (Chsel<1.25), while peptides susbstitued with non-polar or negatively charged amino acids (Pro, Glu, Ile) are working via short-term chemotactic receptors (Chsel>1.25).



43. A B-sejt-receptorokon keresztül kiváltott jelátviteli folyamatok vizsgálata éretlen B-sejtekben (E13)
Kövesdi Dorottya1, Pászty Katalin2, Enyedi Ágnes2, Kiss Endre1, Matkó János1, Sármay Gabriella1
1Eötvös Loránd Tudományegyetem, Természettudományi Kar, Immunológia Tanszék;
2Országos Haematológiai és Immunológiai Intézet, Budapest

A B-sejt-receptorok (BCR) keresztkötése éretlen B-sejtekben apoptózist, míg érett B-sejtekben aktivációt és proliferációt indukálhat. Kevéssé ismertek még azok a jelátviteli útvonalak, amelyek teljesen eltérő funkcionális válaszokat eredményeznek. Korábban kimutattuk, hogy a BCR-keresztkötés éretlen B-sejtekben - szemben az érett sejtekkel - nem váltja ki a Gab2 adaptormolekula tirozinfoszforilációját. Feltételeztük, hogy a Gab2 által összetartott jelsokszorozó komplex nem jön létre, és hiányában a túlélést elősegítő jelek nem alakulhatnak ki, ami végül a B-sejtek apoptózisához vezet.

Részletesen kívántuk jellemezni a BCR-keresztkötést követően a Gab2 által szervezett molekulakomplex összetételét, a MAPK-k és transzkripciós faktorok aktiválódását és az apoptózishoz vezető jelpályákat. Kísérleteinkben kezeletlen és besugárzott egerek lépéből anti-Thy-1 és nyúlkomplement segítségével végzett T-sejt-depletiót követően tisztított, érett és éretlen B-sejteket vizsgáltunk.

Megállapítottuk, hogy a Gab2-molekulakomplexek összetétele nem különbözött jelentősen e két B-sejt-fejlődési stádiumban, ugyanakkor a jelátvitelben kulcsszerepet játszó Erk1/2, p38 MAPK-k és a c-Fos transzkripciós faktor expreszsziója, valamint az Akt/PKB szerin-/treonin-kináz szubsztrátjainak foszforilációja érett sejtekben hosszan kitartott, míg éretlen B-sejtekben csupán átmeneti jellegű volt. Feltételezzük, hogy ez a jellegzetes különbség eredményezi az éretlen B-sejtekben a BCR által kiváltott antiapoptotikus jelek hiányát. Eredményeink szerint az éretlen B-sejtek a BCR keresztkötésére a mitochondrium membránpotenciáljának változásával válaszolnak, ez kaszpáz-3-aktiválódáshoz és végül sejthalálhoz vezet.

Signaling pathways mediated by the B cell antigen receptor in immature mouse B cells

Ligation of B cell antigen receptors on immature B cells may induce apoptosis, while on mature B cells it stimulates proliferation. The signaling pathway regulating the different functional response, death or survival of the B cell, is not fully characterized.

Our aim was to examine the composition of the Gab2 organised molecular complex, the activation of MAPKs and transcription factors, furthermore, to characterise the pathway leading to apoptosis of immature B cells.

We used B cells isolated from the spleen of irradiated and auto-reconstituted (transitional immature B cells) and untreated (mature B cells) mice, respectively. B cells were  purified after depleting T cells with anti-Thy-1.2 antibody plus rabbit complement and resting B cells were collected after the centrifugation over 50/75% Percoll gradient. Cell lysate samples were analysed after SDS-PAGE with Western blotting using specific antibodies.

The results showed that phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-K) constitutively associated to Gab2 both in mature and immature B cells and the association of SHP-2 was slightly inducible in both cases, so the composition of Gab2 organised molecular complex was not significantly different in the two maturation stages. In contrast, phosphorylation of ERK1/2 and p38 MAPKs and induction of c-Fos expression as well as the phosphorylation of Akt/PKB serine/threonine kinase substrates showed a prolonged kinetics in mature B cells, while in immature B cells only transient phosphorylation was detected. We suppose that the transient activation of c-Fos and Akt cannot induce anti-apoptotic signals to rescue the BCR ligated immature cells. Finally, from the results of experiments comparing apoptosis pathways we concluded that the BCR induced apoptotic process in immature B cells is a result of the loss of mitochondrial membrane potential and the consequent activation of caspase-3 and independent of caspase-8.



44. Az első plasmatocytaspecifikus transzmembránreceptor azonosítása Drosophilában és szerkezeti homológjainak jellemzése (E20)
Kurucz Éva1, Medzihradszky Katalin2, Zsámboki János1, Vilmos Péter1, Hultmark Dan3, Andó István1
MTA-Szegedi Biológiai Központ,
1Genetikai Intézet,
2Tömegspektrometriai Laboratóriuma, Szeged;
3Umea University, Umea Center for Molecular Pathogenesis, Svédország

A plasmatocyták a Drosophila sejtes immunválaszában a mikroorganizmusok bekebelezésével és antimikrobiális peptidek termelésével vesznek részt; molekuláris markerekkel végzett azonosításukról az elmúlt évben számoltunk be. Most az első, a plasmatocytákra jellemző transzmembránfehérje molekuláris jellemzését mutatjuk be. A fehérjét kódoló gént az ellenanyagaink segítségével izolált antigén tömegspektrográfiás analízisét követően a 2. kromoszóma bal karján azonosítottuk. Az átírt fehérje a transzmembránfehérjék jellegzetes szerkezetét mutatja, szignálpeptidet, extracelluláris régiót, transzmembránrégiót és citoplazmás régiót hordoz. A molekula extracelluláris régiója tíz EGF-ismétlődést, valamint potenciális O-glikozilációs helyeket tartalmaz; citoplazmás régiója potenciális Ser/Thr foszforilációs helyeket hordoz. A gén egy nagyobb - eddigi vizsgálataink szerint 11 szerkezeti homológot tartalmazó - géncsoportban helyezkedik el, amelynek tagjai közül öt, transzmembránfehérjét kódol. A homológiakeresések alapján valamennyi gén egy nagyobb géncsaládba tartozik, ennek Bombyx-, Sarcophaga-, Coenorhabditis-, Anopheles-, egér- és emberi homológjait azonosítottuk. Az azonosított Anopheles-homológok, a Drosophiláéhoz hasonlóan, egymás tőszomszédságában elhelyezkedő géncsoportot képeznek. A szövetspecifikus expresszió vizsgálatának előzetes eredményei azt sejtetik, hogy a gének többsége kizárólag vérsejtekben nyilvánul meg. A szerkezet-funkció kapcsolat tisztázásához szükséges funkcióvesztéses mutánsok izolálása még folyik.

Molecular definition of the first plasmatocyte-specific transmembrane receptor in Drosophila and its structural homologues

The plasmatocytes, cellular elements of innate immunity in Drosophila, are involved in phagocytosis and production of antimicrobial peptides. Last year we presented the definition of these cells by molecular markers. Now we present the molecular definition of the first plasmatocyte-specific marker, a transmembrane receptor. The gene for the receptor was mapped to the left arm of the second chromosome following a MALDI analysis of the isolated antigen. The transcribed protein shows charactristic features of the transmembrane proteins: signal peptide, extracellular region, transmembrane region and cytoplasmic tail. The extracellular region contains ten, six-cystein EGF repeats and potential O-glycosilation sites. The cytoplasmic region carries potential Ser/Thr phosphorylation sites. The gene is located in a gene-cluster of 11 structural homogues; five of themencodes for transmembrane proteins. All genes of this cluster belong to a genefamily having structural homologues in Bombyx, Sarcophaga, Coenorhabditis, Anopheles, mouse and human. The identified Anopheles homologues also form a gene-cluster, similarly to that in Drosophila. Preliminary results on tissue-specific expression of the identified Drosophila genes suggest that most of them are expressed exclusively in hemocytes. The isolation of the loss-of-function mutations is in progress.



45. RAGE-gén-polimorfizmusok gyulladásos bélbetegség-ben (E18)
Laki Judit1, Cervenak László1, J. Bart A. Crusius3, Eef van Elk2, Füst György1, Roel Heijmans3, Gerard van Kamp2, Amado Salvador Pena3, 4, Prohászka Zoltán1, Jelle J. Visser2
1Semmelweis Egyetem, III. Sz. Belgyógyászati Klinika, Budapest;
2VU University Medical Center, Department of Clinical Chemistry,
3Laboratory of Immunogenetics,
4Department of Gastroenterology, Amszterdam, Hollandia

Bevezetés: A RAGE [receptor for AGEs (advanced glycation end-products)] membránfehérje egy multiligand receptor. Ligandjai: AGE, amiloidra jellemző béta-fibrillumok és az S100/kalgranulin családba tartozó proinflammatórikus citokinek. A RAGE gén a 6. kromoszómán (6p21.3), a gyulladásban és immunválaszban szerepet játszó géneket tartalmazó MHC III régióban található. Vizsgáltuk a RAGE promóterrégiójában a -374-es és a -429-es allél polimorfizmusát mint lehetséges hajlamosító tényezőt a gyulladásos bélbetegségek (IBD) - colitis ulcerosa (CU) és Crohn-betegség (CD) - kialakulásában. Colitis ulcerosa esetén igazolt a kapcsoltság és összefüggés a HLA II és III régiókkal.

Módszerek: 218 IBD-ben szenvedő beteg (95 CU, 123 CD) és 177 holland kaukázusi kontroll DNS-mintáiban vizsgáltuk a polimorfizmust a RAGE promóterrégiójában, -374 és -429 pozícióban.

Eredmények és megbeszélés: A kontrollok esetében a RAGE-polimorfizmus nem tér el a H-W szabálytól. A két polimorfizmust vizsgálva nem kaptunk szignifikáns eltérést Crohn-betegek esetében a kontrollokhoz viszonyítva. Colitis ulcerosás betegeknél a -429 allél esetén szignifikánsan csökkent a heterozigóták aránya a vad vagy variáns allélre a homozigótákkal szemben (p=0,0334); heterozigóta férfiaknak háromszor kisebb az esélyük, hogy colitis ulcerosa lép fel náluk (esélyhányados: 0,3, p=0,025). Bár a -374 allél esetén szignifikáns eltérést nem kaptunk a heterozigóták arányában a colitis ulcerosás betegeknél, az ezen allélra heterozigóta nőknek fele akkora az esélyük, hogy colitis ulcerosa alakul ki náluk, mint a homozigótáknak (esélyhányados: 0,5, p=0,053). A két RAGE-promóter-polimorfizmust tekintve a heterozigótaság védelmet jelenthet colitis ulcerosa kialakulásával szemben.

RAGE gene polymorphysms in inflammatory bowel disease

Introduction: RAGE [receptor for AGEs (advanced glycation end-products)] is a cell surface protein, a multiligand receptor. RAGE binds AGEs such as beta-sheet fibrils characteristic of amyloid, cytokine-like mediators of the S100/calgranulin family of proinflammatory cytokines. The RAGE gene is located in the MHC locus on chromosome 6p21.3 containing genes involved in inflammatory and immune responses. We studied RAGE polymorphisms at positions -374 and -429 in the predisposition to the development of IBD: ulcerative colitis (UC) and Crohn's disease (CD). Linkage and association to genes in the HLA-class II and class III region has been demonstrated predominantly to UC.

Materials and methods: 218 IBD patients (95 UC, 123 CD) and 177 unrelated individuals of Dutch Caucasian ancestry were analysed for polymorphisms at positions -429 and -374 in the RAGE promoter region.

Results and discussion: RAGE polymorphisms did not deviate from H-W equilibrium in controls. Analyzing the two polymorphisms no significant changes were found in CD compared to controls. Significant decrease was found in the frequency of heterozygosity (versus homozygosity for either the wildtype or variant alleles) at position -429 in UC patients (p=0.0334). Male heterozygotes at this polymorphism had three times lower risk (OR=0.3, p=0.025) to have UC than homozygotes. Although no significant changes were found in the frequency of heterozygosity at position -374 in UC patients, female heterozygotes at this position had twice lower risk (OR=0.5, p=0.053) to have UC than homozygotes. Heterozygosity in two RAGE promoter polymorphisms may protect carriers from development of ulcerative colitis.



46. Characterization of chemotactic and proliferative behaviour of LM2 and LM3 murine adenocarcinoma cell lines induced with SXWS tetrapeptides (E12)
Láng Orsolya1, Illyés Eszter2, L. Colombo3, Pállinger Éva4, Hudecz Ferenc5, Kőhidai László1
1Semmelweis Egyetem, Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet, Budapest;
2Eötvös Loránd Tudományegyetem, Szerveskémiai Intézet, Budapest;
3Institute of Oncology, University of Buenos Aires, Brazília;
4MTA-Semmelweis Egyetem, Molekuláris Biológiai Kutatócsoport,
5MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoport, Budapest

Chemotactic and proliferative moeities of seven members of the SXWS library were investigated in our present work. SXWS is a well conserved domain of the extracellular part of several cytokin receptors (e.g. IL-2, IL-4, IL-6) they are potentially expressed as surface associated, haptotactic or soluble chemotactic ligands. The tested SXWS ligands were substitued with diverse, characteristic amino acids in the X position, (non-polar, small residues SGWS, SAWS, SLWS, aromatic in SYWS, long, basic side chains in SRWS, SKWS, acidic side chain in SEWS). Models of our investigations were two cell-lines developed from BALB/c mouse, LM2 has no metastatic character, while invasiveness of LM3 is high, inceidence of lung metsatasis is 100%. Objectives of our work were: 1. Whether the physicochemical character of the amino acid used to substitue the SXWS peptides in the X position has any influence on the chemotactic character of the ligand? 2. Is there any correlation between the invasiveness of the cell-lines analysed and their chemotactic responsiveness to the SXWS ligands? 3. Whether SXWS peptides possess any significant effect on proliferation, the other essential cell-physiological response of the cells? The effect of SXWS ligands were tested in the range of 10-12-10-6 M range. The chemotactic responsiveness was measured by modified Boyden-chamber technique (NeuroProbe chambers). The number of chemotactically positive responder cells and number of cells in proliferation-assay were determined by MTT assay. The obtained results show that the chemotactic responsiveness of the invasive LM3 cell-line is less selective, it was enhanced towards the SXWS ligands containing non-polar (SAWS, SGWS) aromatic (SYWS) or acidic (SEWS) amino acid in the X position as well, while the basic, long residual character (SKWS, SRWS) is chemorepellent on the LM3 cell. In the non-invasive LM2 cells only SGWS - ligand substitued with the smallest, non-polar residue - proved to be chemoattractant, and the acidic SEWS worked as chemorepellent. It was determined in the time-course study on proliferation that the inhibitory effects of three hours incubation is significantly underlined by 24 hour in the case of the six SXWS peptides, in both cell lines however, analysis of SXWS on the apoptosis markers (mouse Fas and Fas ligand) show no effect. SLWS was the only peptide that had a significant positive effect on proliferation in LM2 cells, as in the LM3 this peptide was neutral. In conclusion, our observations on the two malignant cell-lines call attention that SXWS or peptides with the motive have potential physiological and clinical significance to modulate cell-physiological responses of adenocarcinoma cells.

Reference: 1. Galli S et al. Int J Oncol 2000;17:1259-65. 2. Ladeda V et al. Breast Cancer Res Treat 2001;69:39-51.



47. Az első lamellocytaspecifikus felszíni antigén molekuláris jellemzése Drosophila melanogasterben (E25)
Laurinyecz Barbara1, Kurucz Éva1, Medzihradszky Katalin2, Vilmos Péter1, Gausz János1, Hultmark Dan3, Andó István1
MTA Szegedi Biológiai Központ,
1Genetikai Intézet,
2Tömegspektrometriai Laboratóriuma, Szeged;
3Umea University, Umea Center for Molecular Pathogenesis, Umea, Svédország

Amióta a gerincesekben a Drosophilával homológ jelátviteli folyamatokat fedeztek fel, a Drosophila melanogaster (ecetmuslica) kitüntetett szerepet játszik a veleszületett immunitás vizsgálatában. Vérsejtjeit - a haemocytákat - több, morfológiailag jól elkülönülő csoportba sorolják, közülük a lamellocyta az élővilág egyik legérdekesebb vérsejttípusa. Ezek a sejtek nevüket lapos, szétterülő alakjukról kapták. Az immunválasz során az úgynevezett betokozódási reakcióban vesznek részt; ennek során a szervezetben az idegenként felismert, nagyobb, nem fagocitálható méretű testeket elhatárolják a környező szövetektől. Laboratóriumunkban azonosítottuk az első, lamellocytákat jellemző sejtfelszíni antigént (L1), ez valamennyi lamellocytán és azok közvetlen előalakjain megtalálható. Az antigén expresszióját követően a sejtek nem osztódnak, végső alakjukat és érettségüket osztódást nem igénylő, terminális differenciálódás során érik el. Az izolált, 16 kDa molekulatömegű fehérje emésztési peptidjei egyetlen, három exonból álló gént határoztak meg, amely a 2. kromoszóma bal karján található. A sejttípus-specifikus expresszió vizsgálata kimutatta, hogy a génről RNS csak lamellocytákban íródik át. Az L1 antigén fehérjeszekvenciájának komputeres analízise szignálszekvenciát, az extracelluláris térbe nyúló nagyobb felszíni régiót és C-terminális transzmembrándomént azonosított. A molekula citoplazmás farokkal nem rendelkezik. A további analízis a molekulában GPI-kapcsolódási helyet azonosított. A GPI-kapcsolt fehérjék - amelyeket lymphocyták tartalmaznak a legnagyobb mennyiségben -, a jelátvitelben glikolipidraftok kialakításával vesznek részt. A fehérje szerkezeti hasonlóságot mutat a Ly6/u-PAR családba tartozó receptormolekulákkal, köztük a CD59 humán komplementregulátor fehérjével, amely jelátviteli folyamatokban és sejtadhézióban is szerepet játszik. Az u-PAR ezen kívül a különböző típusú carcinomák metasztatizáló folyamatainak a központi molekulája. Feltételezésünk szerint az L1 antigén kitüntetett szerepet játszhat a sejtes immunválasz vagy a lamellocyták differenciálódása során, így a további funkcionális vizsgálatokat elsőrendű célunknak tartjuk. A gén 3' végének közelébe beépült P-elemeket funkcióvesztéses mutánsok létrehozása érdekében mobilizáltuk, és az L1 expressziójára nézve funkcióvesztéses mutáns törzseket hoztunk létre. A mutánsok immunfunkcióinak jellemzése még folyik.

Molecular definition of the first lamellocyte-specific surface antigen in Drosophila melanogaster

Since the discovery of the homologous vertebrate signalling pathways, Drosophila serves as a major model organism in studies of innate immunity. The cellular arm of this reaction includes the phagocytosis and the encapsulation reactions, the latter resembling the granuloma formation in vertebrates. The phagocytosis is mediated by small round cells, the plasmatocytes, while the effector cells in encapsulation reaction, the demarcation of large particles, are the lamellocytes. In normal, uninfected larva the plasmatocyte is the major cell population, ready to take up microorgansms upon infection, while lamellocytes differentiate following various stimuli, including abnormal development of tissues and infestation with parasites. The differentiation of lamellocytes involves activation of putative precursor cells via so far undefined receptors and the terminal differentiation - flattening - of the small round precursors to become large terminally differentiated effector cells. Definition of lamellocyte-specific cell surface antigens helps to understand the development and function of these cells in the cellular defence reactions. To get insight into this process we have defined cell surface antigens in lamellocytes, including a major protein, the L1 antigen. This antigen is present on all lamellocytes including terminally differentiated large cells and also their immediate precursors. Following L1 expression cells don't divide and undergo terminal differentiation, characterized morphologically by elongation and flattening. The L1 antigen is a 16 kDa protein with three major, immunologically defined epitopes. The gene for this protein has been identified following MALDI analysis of the isolated protein. The analysis revealed a single copy gene on the left arm of the secondchromosome, with three exons. The transcribed mRNA is expressed exclusively in lamellocytes and their immediate precursor. The protein is predicted to have a signal peptide, an extracellular region, and a transmembrane domain and lacks a cytoplasmic tail. Further analysis revealed the presence of a GPI anchor site and a cleavage site, characteristic to GPI anchored transmembrane proteins. The protein shows structural homology with receptors belonging to the Ly6/u-PAR family of molecules, among them the CD59, complement regulatory protein. These proteins are involved in signalling and cell adhesion. In addition u-PAR has a central role in tumor invasion and metastasis in diverse carcinoma types. We believe that this major lamellocyte-specific protein has an important role in lamellocyte differentiation and function therefore we generated loss-of-function type mutations by mobilizing P-elements inserted in the neighbourhood of the 3' end of the gene. The functional analysis of the mutants is in progress.



48. A galektin-1 fehérje - immunmoduláló humán lektin - struktúra-funkció vizsgálata (P18)
Légrádi Ádám, Demydenko Dmytro, Ion Gabriela, Frankó András, Monostori Éva
MTA Szegedi Biológiai Központ, Genetikai Intézet, Lymphocyta Szignáltranszdukciós Csoport, Szeged

A humán galektin-1 (gal-1) az S típusú lektinek csoportjába tartozik. Szénhidrátkötő doménjén (CRD) keresztül specifikusan kapcsolódik az N-acetil-laktózamin tartalmú szénhidrát-konjugátumokhoz. Az immunreakciók helyén az aktivált T-lymphocyták és macrophagok nagy mennyiségű gal-1-et szekretálnak; a lektin autokrin vagy parakrin módon az aktivált T-lymphocyták apoptózisát okozza. Számos erőfeszítés ellenére még nem sikerült feltárni sem a citotoxikus hatás molekuláris folyamatát, sem a molekula struktúrájának és apoptotikus funkciójának összefüggését.

Az itt bemutatott munka célja, hogy megértsük, hogy a gal-1 apoptotikus hatása milyen fehérjeszakasz(ok)hoz rendelhető. Ennek érdekében a CRD-doménben és a kénhíd kialakításáért felelős ciszteinben mutáns rekombináns gal-1 formák hatását vizsgáltuk Jurkat-sejteken. Mivel a CRD-doménben létrehozott mutáció nem teszi lehetővé a hagyományos cukorkötésen alapuló laktozil-agaróz mátrixon végzett affinitástisztítást, ezért ezeket a mutánsformákat his-tag-gel láttuk el és Ni2+-oszlopon izoláltuk. A ciszteinben mutáns formák megtartják cukorkötő képességüket, így ezeket a hagyományos cukoraffinitás-kromatográfiával tisztítottuk.

Munkánk során a következő, CRD-doménben mutáns formákat vizsgáltuk: R48H, E71Q és R73H (az első betű a vad, a második a mutáns aminosav egybetűs jele, a számmal jelzett pozícióban). A CRD-mutánsok egyike sem kötődött kimutatható mennyiségben a sejtfelszíni komplex glukokonjugátumokhoz. Azonban az E71Q és az R73H, szemben az R48H-val, megtartották laktózkötő tulajdonságukat; e két előbbi fehérje a Jurkat-sejtek apoptózisát okozta, bár ennek mértéke kisebb volt a vad típusú gal-1 által okozott apoptózisnál. Azonos kísérleti körülmények között az úgynevezett "nullmutáns" R48H nem mutatott citoxikus aktivitást. Eredményeink szerint a nullmutáns R48H forma nem, a csökkent cukorképességű E71Q és R73H formák apoptózist indukálnak Jurkat-T-sejteken. Ebből azt a következtetést vonhatjuk le, hogy minimális cukorkötőképesség és/vagy az ezzel járó "minimális" konformáció szükséges az apoptózisindukcióhoz.

Az eddigi kutatások kimutatták, hogy mely ciszteinek között alakulhat ki oxidáló környezetben diszulfidhíd. A diszulfidhidaknak az aktív apoptotikus konformációban betöltött szerepét azonban még nem vizsgálták. Annak eldöntésére, hogy melyik kénhíd kialakulása gátolhatja az apoptotikus funkciót, ciszteinmutánsokat használtunk (C2S, C16S, C42S, C66S, C88S, C130S). Ezek mindegyike apoptózist okozott akkor, amikor a ciszteinek redukált állapotban voltak. A következő kísérletekben azt fogjuk vizsgálni, hogy oxidáló környezetben mely mutánsok biológiai aktivitása marad meg, ebből következtethetünk arra, hogy pontosan mely cisztein aminosavak módosíthatják a gal-1 apoptotikus hatását.

Structure-function study of the immunomodulatory human lectin, galectin-1

The human galectin-1 (gal-1) belongs to the family of S-type lectins with affinity to glycoconjugates containing the N-acetyl lactose-amine. It is produced at the sites of immune response by the activated T cells and macrophages and induces the apoptosis of the activated T lymphocytes on an autocrine or paracrine manner. Efforts, so far, have been unsuccessful to reveal the molecular mechanism of the gal-1 induced apoptosis or the relation between the structure of the lectin and the apoptotic function.

During this work our aim was to understand the structure-function correlation of the gal-1. We studied the apoptotic effect of a panel of mutant gal-1 molecules. Mutations included three independent mutations in the carbohydrate recognition domain, characterized previously as "non-binding" mutants, since they did not show affinity to the gal-1 ligand, asialofetuin. Six other variants were mutated in the one of the six cysteins, which were implicated in regulation of the oxidized or reduced form of gal-1. Since the "non-binding" mutants could not be purified by the classical sugar-affinity chromatography, we produced their his-tagged forms and isolated the proteins on Ni2+-matrix. The cystein mutants retained the sugar- binding capacity; therefore these contracts were purified on lactosyl agarose matrix.

The following forms of the "non-binding" mutants were analyzed: R48H, E71Q and R73H (one letter code of the wild and mutated amino acid in the numbered position). None of these proteins bound to cell surface glycoconjugates. However the E71Q and R73H ("partial mutants") but not the R48H ("null mutant") bound to lactose-Sepharose beads. Moreover, the "partial mutants" but not the "null mutant" induced apoptosis of the Jurkat cells. The degree of the cell death was lower compared to that caused by the wild type gal-1. We conclude that the minimal sugar binding and/or the related conformation are required for the induction of apoptosis.

Conformational studies of gal-1 identified the possible intramolecular disulfide bonds between particular cysteins under oxidizing conditions but the biological consequence of oxidation of one or another cystein has not been analyzed. Therefore we investigated the apoptotic effect of the cystein mutant forms of gal-1, namely C2S, C16S, C42S, C66S, C88S, C130S point mutants. All of these mutants were apoptotically active when the isolation of the proteins occurred under reducing conditions. In the following experiments we will examine the citotoxicity of these forms after purifying them under oxidizing environment to get insight the role of the particular cystein amino acids in galectin-1.



49. A haemocytadifferenciálódás vizsgálata a lárva-báb-érett forma átmenet során az Ad1 marker segítségével, Drosophila melanogasterben (P4)
Márkus Róbert, Kurucz Éva, Andó István
MTA Szegedi Biológiai Központ, Genetikai Intézet, Szeged

A Drosophila immunrendszerének sejtes elemei, a haemocyták kulcsszerepet játszanak a kórokozók felismerésében és hatástalanításában. A haemocyták minden fejlődési stádiumban jelen vannak, azonban eredetüket tekintve és a különböző fejlődési stádiumok közötti átmenetre vonatkozóan - például embrió, lárva, báb és érett forma (adult) - hiányosak az ismereteink. Ennek az az elsődleges oka, hogy nem álltak rendelkezésre olyan stádiumspecifikus vérsejtmarkerek, amelyek segítségével ezt a folyamatot tanulmányozhatnánk.

Az adult haemocyták eredetének és differenciálódásának vizsgálatára adult haemocytára specifikus markereket azonosítottunk; közülük olyan markert használtunk a lárva-adult átmenet vizsgálatára, amely nagyon kis mennyiségben - a detektálás szintjének határán - van jelen a harmadik stádiumú lárvákban, a báb fejlődése során mennyisége fokozatosan emelkedik, az érett forma minden haemocytáján fokozott expressziót mutat. Bár az adult haemocytái morfológiai és funkcionális sajátságaik alapján több osztályba sorolhatók, mikroszkópos vizsgálatokkal és FACS analízissel kimutattuk, hogy az adult minden haemocytája hordozza ezt a sejtfelszíni antigént, amelynek molekulatömege az érett formában 5-7 kDa. Segítségével nyomon követtük a haemocyták differenciálódását a lárva-báb, báb-adult átmenetek során. Különböző lárva eredetű kompartmentekből GFP-vel jelölt haemocytákat injektáltunk vad típusú lárvákba, majd a kifejlett állatok haemocytáinak fenotípusát jellemeztük lárva eredetű markerekkel, az Ad1 markerrel és funkcionális tesztekben. A funkcionális és a fenotípus-vizsgálatok eredményeit mutatjuk be.

Ad1 as a marker to monitor hemocyte development during larva-pupa-adult transition in Drosophila melanogaster

Hemocytes are the cellular components of the Drosophila immune system. They play a key role in the recognition and destruction of pathogens. They are present in each developmental stage however their origin and possible transition from one developmental stage to the other (e.g. embryo, larva, pupa and the adult) has not been studied extensively yet. This was mainly due to the lack of molecular markers characteristic to hemocytes in one or another developmental stage regardless of the cell type. To study the origin and development of hemocytes in the adult fly we generated stage-specific markers for hemocytes in the adult. One marker has been selected on the basis of specific expression in hemocytes in the adult. It is expressed in minute amounts in third stage larvae increase gradually during pupal development and is present in high amounts in adult hemocytes. Microscopic studies and FACS analysis of live cells revealed that the antigen is expressed on the surface of all hemocytes in the adult regardless of their morphology. In the adult it is a 5-7 kDa molecule. This marker has been used to follow the development of hemocytes during transition from larva to pupa and to the adult. GFP labeled hemocytes, collected form different larval compartments have been injected into wild type larvae and the hemocytes from the adult have been typed for expression of larval markers and of Ad1. Functional studies have been carried out too to monitor the maturation of the injected cells. The results of the functional studies and the phenotypic analysis will be presented.



50. A neonatalis Fc-receptor (FcRn) expressziója szarvasmarhatüdőben (P28)
Mayer Balázs1, Kis Zsuzsanna1, Kaján Győző1, Frenyó V. László1, Lennart Hammarström2, Kacskovics Imre1
1Szent István Egyetem, Állatorvos-tudományi Kar, Élettani és Biokémiai Tanszék, Budapest;
2CBT Novum, Karolinska Institute, Huddinge, Svédország

A kérődző állatok nyálkahártya-szekrétumaiban (gyomor-bél rendszer, légzőszervrendszer, nemi utak, tőgy) található IgG1- és szekretoros IgA-molekulák együttesen vesznek részt a nyálkahártyák védelmében. E jelenséget az is alátámasztja, hogy az IgA-molekulákhoz hasonlóan a kérődző IgG1 (de nem az IgG2) viszonylag ellenálló a proteolyticus hatásokkal szemben. Az IgG1-molekulát a nyálkahártyák felületére juttató transepithelialis mechanizmus részletei jelenleg még ismeretlenek.

A kérődzők neonatalis Fc-receptorának (FcRn) szerepét ebből a szempontból tisztázandó, korábban klónoztuk a szarvasmarha- és juh-FcRn-molekulákat, kimutattuk ezek expresszióját a tőgyacinusok és -ductusok epithelsejtjeiben, valamint az újszülött bárányvékonybél cryptasejtjeiben, amelyek IgG1-molekulát szekretálnak a nyálkahártya felszínére.

Újszülött borjakban az anyai immunglobulin (Ig) bejut a légutak szekrétumába is, ott a kórokozók elleni védelemhez járul hozzá. Bár a légutak nyálkahártya-szekrétumában az IgG1-dominancia az egyed fejlődésével az IgA javára folyamatosan csökken, az alsó bronchoalveolaris rendszerben a szekretált IgG1 marad a meghatározó immunglobulin, még a kifejlett egyedekben is. Ezek a korábbi adatok - az FcRn feltételezett szerepe alapján - munkacsoportunk érdeklődését is felkeltették és elhatároztuk, hogy a szarvasmarha alsó és felső légutaiban elemezzük a receptor lokalizációját.

Az FcRn jelenlétét mRNS- (RT-PCR) és fehérjeszinten (Western-blot) is ki tudtuk mutatni a szarvasmarha-tüdőszövetben. Az in situ hibridizációs és az immunhisztokémiai elemzések pontozott festődést mutattak az alveolusokban; ez valószínűleg macrophagok FcRn-expresszióját jelzi. Erős festődést tapasztaltunk a bronchiolusokban és valamivel gyengébb jelet kaptunk a bronchus epithelsejtjeiben. A tracheaepithelben egyik módszerrel sem tudtuk detektálni az FcRn jelenlétét. A szarvasmarha-FcRn tehát valószínűleg szerepet játszik az IgG transepithelialis transzportjában mint szállító receptor, és biztosítja az IgG-dominanciát az alsó légutakban. Mivel a szarvasmarha-FcRn IgB-alosztály preferenciája és a sejten keresztüli IgG-transzport iránya is ismeretlen, e receptor pontos szerepének tisztázására további vizsgálatok szükségesek.

The neonatal Fc receptor (FcRn) is expressed in the bovine lung

Mucosal secretions of the ruminant gastrointestinal, respiratory, genital tracts and mammary gland contain IgG1 and secretory IgA that function together in host defense. The fact that both IgA and IgG1 (but not IgG2) are relatively resistant to proteolysis in ruminants, may explain this phenomenon. Exactly, how IgG1 crosses epithelial barriers to function in mucosal immunity in these animals is still unknown.

In order to understand the role of the ruminant neonatal Fc receptor (FcRn) in this process, we first cloned its bovine and ovine counterparts and localized their expression in the epithelial cells of mammary gland acini and ducts in ewes and cows, as well as in the crypt cells of the small intestine of neonatal lambs, which were demonstrated to secrete IgG1.

In neonatal calves, maternal immunoglobulin (Ig) is also transferred into the respiratory secretion where it contributes to immune protection. The early predominance of IgG1 in respiratory tract secretions is progressively reduced in favor of IgA by age but in the lower, bronchoalveolar system secreted IgG1 remains the dominant secreted Ig even in adulthood. These earlier facts have been gained recent interest in our laboratory in the light of the FcRn suggested function thus we decided to analyze the FcRn expression in the bovine respiratory system.

We found the presence of FcRn heavy chain at mRNA (RT-PCR) and also at protein (Western blot) levels in bovine lung. In situ hybridization and immunohistochemistry detected scattered staining in the alveolar tissue, which might represent FcRn positive macrophages. A strong signal was observed in bronchiolar epithelial cells of the lung sections, and somewhat weaker staining in those of the bronchi. We could not detect FcRn heavy chain expression in the epithelial cells of the trachea. The bovine FcRn may thus play a role in IgG transport across mucosal epithelial barriers as a trafficking receptor and ensure IgG predominance in the lower respiratory tract. Since the IgG subclass preference of the bovine FcRn, and the direction of the IgG transcytosis in which this receptor is involved are unknown in ruminants, the exact function of bovine FcRn in the lung needs further elucidation.



51. A szerinfoszforiláció szerepe a humán B-sejtek aktivációjának Fcgamma-receptor által közvetített gátlásában (E9)
Medgyesi Dávid, Sárközi Rita, Kertész Ákos, Koncz Gábor, Sármay Gabriella
Eötvös Loránd Tudományegyetem, Természettudományi Kar, Immunológiai Tanszék, Budapest

A II-es típusú Fcgamma-receptor (FcgammaRIIb) kulcsszerepet játszik a B-sejt-aktiváció szabályozásában. A B-sejt-receptorokkal (BCR) végbemenő, immunkomplexek általi keresztkötődése után tirozinon foszforilálódik; ezáltal olyan fehérje- és inozitol-foszfatázokat toboroz a sejtmembrán intracelluláris oldalára, amelyek gátolni képesek az aktiváló jelpályát. Az egér- és a humán B-sejtek Fcg-receptoron keresztüli jelátviteli folyamatai eltérőek. Humán B-lymphocyták esetében az SHP-2 tirozin-foszfatáz a foszforilálható tirozinmaradékokat tartalmazó ITIM-hez (immunoreceptor tirozin alapú inhibíciós motívum) kötődik, és defoszforilálja a Gab1 adaptorfehérjét; ez a folyamat csökkent PI3-K-aktivitást okoz, így a foszfatidil-inozitol-3,4-biszfoszfát sejtmembránon belüli szintje alacsony lesz. Az emberi és az egérreceptor eltérő jelátviteli működésében nagy szerepet játszik a két fajban expresszálódó receptorok eltérő intracelluláris szekvenciája. Szemben az egérreceptorral, a humán molekula membránközeli része egy szerint tartalmazó motívummal rendelkezik. Munkacsoportunk ennek a szerin-/treonin-foszfatázok számára potenciális foszforilációs helynek a jelátvitelben betöltött szerepét vizsgálta; az irodalomban erről még nincs adat.
A BCR-t és az FcgammaRIIb-t specifikus egérantitestekkel és anti-egér-IgG-vel aggregáltuk. A sejtek lizátumából az FcgammaRIIb precipitátumát SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel és Western-blottal vizsgáltuk. Továbbá elemeztük a szerint tartalmazó motívumok szekvenciájának megfelelő, szintetizált peptidekhez asszociálódni képes molekulákat.

Eredményeink azt mutatják, hogy a BCR-FcgammaRIIb keresztkötött mintákban az Erk (extracelluláris szignál által szabályozott kináz) kötődik az Fcgamma-receptorhoz. A szerint tartalmazó FcgammaRIIb-peptidekhez is asszociálódik a 85 kDa-os és a 42/44 kDa-os Erk, valamint az utóbbi foszforilált formája is. Az Erk-kötődés mintázata függ a keresztkötés mértékétől és az aktiváció időtartamától, és okadánsav (szerin/treonin-foszfatáz gátló) jelenlétében optimális. Annak érdekében, hogy a szerinnek a foszforilált ITIM motívumhoz kötődő fehérjékre kifejtett hatását vizsgáljuk, olyan peptideket alkalmaztunk, amelyek a teljes szakaszt, az ITIM-et és a szerint tartalmazó motívumot is magában foglalják. A kísérletek eredményei arra engednek következtetni, hogy a szerin módosíthatja a tirozinon foszforilált FcgammaRIIb-hez asszociálódni képes molekulák kötődését. Feltételezzük, hogy a BCR-FcgammaRIIb aggregáció során az Fc-receptor szerinen is foszforilálódhat, s ez fontos szabályozószerepet játszhat a receptor működésében.

The role of serine phosphorylation in the Fcgamma receptor mediated regulation of human B cell activation

Type IIb Fcgamma receptors (FcgammaRIIb) have a major role in regulating B cells. After its co-aggregation with the B cell receptors (BCR) via immunecomplexes FcgRIIb become phosphorylated on tyrosine and recruit protein and inositol phosphatases, inhibiting signal transduction. In contrast to the mouse, the immunoreceptor tyrosine based inhibitory motif (ITIM) of human FcgRIIb binds the tyrosine phosphatase SHP-2, which consequently dephosphorylates the adaptor, Gab1. This results in a decreased phosphatidylinositol 3-kinase activity, and a lower level of phosphatidylinositol 3.4 phosphate in the cell membrane. The intracellular domain of FcgammaRIIb in human and mouse differs, the human receptors having a serine containing membrane proximal motif, which is a potential phosphorylation site for Ser/Thr kinases. Our aim was to study the role of this motif on the FcgammaRIIb mediated function.

The receptors were co-aggregated by BCR- and FcgammaRIIb-specific mAbs and anti-mouse IgG. Detergent extracts of cells and affinity purified FcgammaRIIb were analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and Western blot. The molecules associated with the Ser containing motifs of FcgammaRIIb were pull down by biotinylated synthetic peptides bound to Strepavidine-Agarose beads.

The results have shown that extracellular signal regulated kinases (Erks) associate to FcgRIIb from the detergent extracts of BCR-FcgammaRIIb co-ligated B cells. Furthermore, the binding of 85 kDa Erk and that of phospo-Erk to the Ser containing FcgRIIb peptide was detected. The pattern of the associated Erks depended on the degree of crosslinking and on the time of activation, and was optimal in the presence of phosphatase inhibitor, okadaic acid. In order to study the effect of serine phosphorylation on the composition of p-ITIM-bound protein complexes, synthetic peptide corresponding to the motif containing both the Ser and the Tyr residues was used and proteins bound to the single or double phosphorylated peptides were compared. The results indicate that phosphorylation on Ser may modify the binding of proteins to the tyrosine phosphorylated FcgammaRIIb. We assume that FcgRIIb is phosphorylated by Erk and that may have a further impact on FcgammaRIIb dependent B cell regulation.



52. Kettősszálú DNS és/vagy nukleoszóma; diagnosztikai kérdőjelek szisztémás lupus erythematosusban (E32)
Miklós Kata, Németh Julianna, Gopcsa László, Kilián Katalin, Pálóczi Katalin
Országos Gyógyintézeti Központ, Budapest

A szisztémás lupus erythematosus (SLE) laboratóriumi diagnosztikájának egyik nélkülözhetetlen eleme a kettősszálú-DNS- (dsDNA-) specifikus autoantitestek megjelenése a szérumban; ez legtöbbször homogén mintázatú antinukleárisantitest- (ANA-) pozitivitáshoz társul. A homogén mintázatú ANA-pozitivitás hátterében azonban jó néhány esetben nem igazolható a dsDNA-specifikus ellenanyagok jelenléte, tehát a laboratórium az SLE feltételezett diagnózisát csak részben tudja megerősíteni. Ugyanakkor az anti-dsDNA antitest-pozitivitás mellett további kérdések is felmerülhetnek, az antitest mennyiségének és milyenségének klinikai interpretálásával kapcsolatban.

Munkánkban homogén mintázatú ANA-pozitivitás mellett natív DNS- (ELISA és IIF), valamint nukleoszóma- (ELISA) specifikus antitestek megjelenését vizsgáltuk különböző immunológiai kórképekben. Eredményeinket a beküldő diagnózisok, valamint az alapbetegséghez társuló ismert veseszövődmények tükrében értékeltük. A magas titerű homogén ANA- és anti-dsDNA-pozitív szérumminták mindegyike egyben nukleoszómapozitív is volt (20 beteg). Homogén ANA-pozitív, anti-dsDNA-negatív SLE-s betegeink 85%-a nukleoszómapozitívnak bizonyult (35/41). Egyéb, ANA-, illetve anti-dsDNA-pozitív autoimmun kórképekben nukleoszóma-antitestet kis számban tudtunk kimutatni (10/63), ezeket overlap szindrómáknak gondoljuk. Minden betegnél, ahol a veseszövődmény már ismert volt, nukleoszómaspecifikus antitest-pozitivitást találtunk (10 beteg).

Az SLE szerodiagnosztikájában a nukleoszóma-antitestek meghatározását nagy specificitásuk és szenzitivitásuk miatt jobb markernek tartjuk a dsDNA-antitesteknél. Segítségével kétszer annyi pozitív eredményű mintát találtunk, mint csak DNS-antitest szűrésével. Laboratóriumunk így további információt nyújt a klinikus felé a dsDNA-pozitív/negatív SLE/nem SLE leletek értékeléséhez.

Double-stranded DNA and/or nucleosomes; diagnostic question-marks in systemic lupus erythematosus

The presence of antibodies directed against double-stranded DNA (dsDNA) in serum is a serodiagnostic key marker of systemic lupus erythematosus (SLE) generally accompanied by homogeneous nuclear fluorescence of anti nuclear antibodies (ANA). However, in many cases dsDNA-specific autoantibodies can not be detected in the background of homogeneous ANA pattern. Consequently, the laboratory can only partly establish the supposed diagnosis of SLE. Moreover, several questions may arise in clincal interpretation of the quality and quantity of dsDNA antibodies.

In this study, ANA positivity (IIF) and the occurence of dsDNA (ELISA, IIF) and nucleosomes (ELISA) antibodies were investigated in sera from patients with different rheumatic diseases. The evaluation of the results were carried out by considering the preliminary diagnosis and known renal involvements. All the homogeneous ANA of high titre and anti dsDNA positive samples were also anti nucleosome positive (20 patients). 85% of patients (35/41) with homogeneous ANA positive and anti-dsDNA negative SLE proved to be anti nucleosome positive as well. Nucleosome antibodies could be detected only in a small fraction (10/63) of patients with other ANA and DNA positive diseases. In these cases an overlap syndrome is sugested. Nucleosome specific antibody positivity was detected in all cases with known kidney involvement.

As nuclesome antibodies have high specificity and sensitivity, we consider that the screening of nucleosome antibodies is a better marker in the serodiagnostics of SLE, than that of dsDNA antibodies. By the aid of this assay twice as much positive samples were found than by testing DNA antibodies alone. Using this test the laboratory can provide additional information for the clinician in resolving the dilemma of dsDNA positive/negative or SLE/nonSLE diagnoses.



53. A PIBF biológiailag aktív régióinak azonosítása II. (P22)
Mikó Éva1, Polgár Beáta1, Szereday László1, Berki Tímea2, Nagy Eszter3, Szekeres-Barthó Júlia1
Pécsi Tudományegyetem, ÁOK,
1Orvosi Mikrobiológiai és Immunitástani Intézet,
2Immunológiai és Biotechnológiai Intézet,
3INTERCELL AG, Bécs, Ausztria

Előzmények: A terhesség során a lymphocyták által termelt, progeszteron indukálta blokkolófaktor (PIBF) immunológiai hatásai közül kiemelendők az NK-sejtek aktivitásának gátlása és a citokintermelés eltolása Th2 irányba. Újabb adataink szerint a PIBF malignus tumorsejtekben is szintetizálódik - például az MCF-7 tumorsejtvonalban -, hozzájárulva a daganat növekedéséhez.

Célkitűzés: Jelen munka során arra kerestük a választ, hogy a molekula mely régiója felelős az immunmodulációs hatásokért. Funkcionális tesztekben megvizsgáltuk a PIBF rekombináns konstruktjaival kezelt lymphocyták "killer" aktivitását az MCF-7 tumorsejtekkel szemben, valamint az anti-PIBF antitesttel inkubált MCF-7 sejtekkel szembeni citotoxicitást mértük.

Módszerek: Nem terhes, egészséges egyénekből származó lymphocytákat rekombináns PIBF-konstruktokkal kezeltünk elő, majd MCF-7 tumorsejtekkel inkubáltuk. Áramlásos citométerrel vizsgáltuk az elölt tumorsejtek arányát. Az MCF-7 daganatsejteket - anti-PIBF poliklonális ellenanyaggal előkezelve - egészséges egyének lymphocytáival hoztuk össze, a citotoxicitás mértékét szintén áramlásos citométerrel határoztuk meg.

Eredmények: A 48 kDa-os N-terminális darab és a PN1-konstrukt szignifikánsan csökkentette az egészséges egyének lymphocytáinak az MCF-7 tumorsejtekkel szemben kifejtett citotoxikus aktivitását; ugyanakkor az anti-48 kDa-os ellenanyaggal kezelt MCF-7 sejtek érzékenyebbé váltak a lymphocyták mediálta lízissel szemben.

Következtetés: A PIBF-molekulán belül a PN1 és a 48 kDa-os N-terminális régó segíti elő a daganatok lokális immunológiai tumorellenes hatásokkal szembeni túlélését.

Identification of the biologically active regions of PIBF II.

Background: The major effects of the progesterone induced blocking factor (PIBF), produced by lymphocytes during pergnancy are inhibition of NK activity and inducing a Th2 biased cytokine production. PIBF was found to be expressed in malignant tumors, e.g. in the MCF-7 tumor cell line, and by inhibiting anti-tumor immune response it might promote tumor growth.

Aims of this study were to identify teh regoins of the molecule responsible for the immunmodulatory effect. In functional test we examined the "killer activity" of lymphocytes treated with constructs representing different regions of PIBF against MCF-7 tumor cells. We also measured NK activity to MCF-7 cells pretreated with anti-PIBF antibody.

Methods: Lymphocytes from healthy, non-pregnant individuals were pretreated with constructs of PIBF and incubated with MCF-7 cells. The ratio of "killed" tumor cells was determined by flow cytometry. MCF-7 cells were treated with polyclonal anti-PIBF antibody and than incubated with lymphocytes from healthy, non-pregnant individuals. Cytotoxicity was measured by flow cytometry.

Results: The 48-kDa N terminal part and the PN1 construct significantly decreased the cytotoxic activity of lymphocytes from healthy individuals against MCF-7 tumor cells whereas MCF-7 cells, treated with anti-PIBF antibody became more sensitive to NK cell mediated lysis.

Conclusion: These data suggest that within the PIBF molecule the 48-kDa N terminal part and the PN1 construct might be responsible for the anti-NK effect.



54. A C3-kötő-receptorok (CD21/CD35) hatása az egér-B-lymphocyták túlélésére és proliferációjára (P15)
Molnár Eszter, Prechl József, Papp Krisztián, Kövesdi Dorottya, Erdei Anna
Eötvös Loránd Tudományegyetem, Természettudományi Kar, Immunológiai Tanszék, Budapest

Egér-B-sejtek felszínén a CR1/2 komplementreceptor a CD19- és CD81-molekulákkal komplexet alkotva pozitívan szabályozza a B-sejt-receptoron keresztüli jelátvitelt.

Munkánk során a CR1/2-receptornak a B-sejtek túlélésére és proliferációjára kifejtett hatását vizsgáltuk, három komplementreceptort felismerő ellenanyag (7G6, 8C12, 7E9) segítségével. Az Fc-receptorok hatásának kizárása érdekében a 7G6-os és a 8C12-es ellenanyagokat egyláncú ellenanyag-fragmentum formában is használtuk. A 7G6scFv - jól modellezve a ligandumkötődést - a CR1/2-receptor C3d-kötőhelyét ismeri fel; a 8C12scFv a CR1-receptor C3b-kötőhelyéhez kapcsolódik, segítségével a CR1-receptor hatása önmagában vizsgálható.

A 7G6scFv indukálta az izolált lépsejtek és a tisztított B-sejtek proliferációját. Egy domináns influenzavírus-peptidet hordozó konstrukció háromszor hatékonyabbnak bizonyult az eredeti egyláncú ellenanyagnál, a 8C12scFv nem váltott ki proliferációt. Az osztódó sejtek - BrdU jelöléssel vizsgálva - B-sejteknek bizonyultak. A 7E9 és - kisebb hatékonysággal - a 7G6 teljes ellenanyagok szintén proproliferatív hatásúnak bizonyultak.

Vizsgáltuk a lépsejtek, az érett és éretlen B-sejtek fogékonyságát a spontán és az indukált apoptózisra, a 7G6scFv és a 8C12scFv hatását a sejtek túlélésére. A 7G6scFv csökkentette a B-sejtek spontán és indukált apoptózisát, az érett és besugárzott állatok lépéből izolált éretlen B-sejtek esetében is. A tranzicionális B-sejtek apoptózisának mértéke csökkent a BCR és a CR1/2 7E9 teljes ellenanyaggal és pLA-val való keresztkötésének hatására.

Eredményeinkből arra következtetünk, hogy a CR1/2 keresztkötése a B-sejt-receptorral elősegíti a B-sejtek proliferációját, valamint a CR1/2-receptor ligandumkötése túlélési jeleket biztosít mind az érett, mind az éretlen B-sejtek számára.

The role of C3-binding receptors (CD21/CD35) in the survival and proliferation of murine B lymphocytes

Complement receptors CR1/2 complexed with CD19 and CD81 positively regulate the signaling of the B cell antigen receptor on the surface of murine B cells.

In this study the influence of CR1/2 on the survival and proliferation of B cells was examined, using three CR1/2-recognizing antibodies: 7G6, 8C12, 7E9. To exclude the involvement of Fc-receptors, two single chain antibody fragments were used; 7G6scFv, which recognizes the C3d-binding site of CR1/2, modeling the ligand-receptor interaction, and 8C12scFv, which binds solely to the C3b binding site of CR1, studying the effect of CR1 itself.

7G6scFv proved to be effective inducing proliferation when added to cultures of isolated splenocytes or purified B cells. The efficacy of a construct bearing an influenza virus hemagglutinin-derived peptide was three fold higher in this respect than that of the original scFv, while 8C12scFv was ineffective. Proliferating cells identified by BrdU labeling proved to be B cells. Whole Igs of 7E9 and - with less efficiency - 7G6 also had pro-proliferative effects.

We then characterized susceptibility of splenocytes, purified mature and immature B cells to spontaneous and induced apoptosis and its modulation by 7G6scFv and 8C12scFv. We found that the presence of 7G6scFv reduces the rate of spontaneous and induced death of B cells, also in case of immature, transitional B cells, isolated from irradiated animals. Apoptosis of transitional B cells from irradiated mice was inhibited by cross-linking BCR with CR1/2 using 7E9 whole Ig and protein LA.

We conclude, that while coligation of CR1/2 and the BCR induces proliferation of B cells, ligand binding of CR1/2 provides survival signals both for mature and immature cells.



55. A mitogén által aktivált proteinkináz (MAPK) aktivitásának vizsgálata pajzsmirigybetegek lymphocytáiban (P16)
Molnár Ildikó1, Szentmiklósi József2
1Kenézy Kórház, III. Sz. Belgyógyászati Osztály, Debrecen;
2Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum, Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézet

A MAPK-aktiváció kulcsszerepet játszik a lymphocyták proliferációjához, differenciálódásához és apoptózisához vezető folyamatokban. Ismert (pajzsmirigy, szemizom) és feltételezett (2-es típusú dejodináz - DII) autoantigének hatását vizsgáltuk kontroll (n=5) és autoimmun (n=15) pajzsmirigybetegek lymphocytáinak MAPK-aktivitására, Western-blot módszerrel. Ficoll-grádiensen történt szétválasztás után 108/100 mikroliter lymphocytához adtunk 0,5 mikrogramm/100 mikroliter, illetve 5 mikrogramm/100 mikroliter antigént, illetve 1 mikrogramm/10 mikroliter antitestet tartalmazó szérumot. Az RPMI tápoldat proteázgátlót tartalmazott. A jelátviteli faktorok kimutatására aktív MAPK (p42/p44) elleni és ERK elleni antitesteket használtunk. Az autoimmun pajzsmirigybetegségben szenvedők lymphocytáiban az eredmények intenzív és gyors MAPK-aktivitást mutattak a szolúbilis humán pajzsmirigyantigén hozzáadásakor, összehasonlítva a kontroll-lymphocyták MAPK-aktivitásával. A szolúbilis humán szemizomantigén hatására - kétórás inkubálást követően - nemcsak a Graves-kóros betegek, hanem a kontrollegyének lymphocytáiban is jelentős MAPK-aktivitás mutatható ki. A DII enzim aminosav-szekvenciájának megfelelő (LVFR, 123-143) és ezzel nagyfokú homológiát adó (TCSS, 131-152) peptidek, illetve kontroll, scrambled peptid (FSLT) hozzáadása is előidézte a MAPK-aktivációt, de időbeli lefolyásuk különbözött a Graves-kóros és a Hashimoto-thyreoiditises betegek lymphocytáiban. Az LVFR-peptid elleni antitestek gátolták a MAPK-aktivitást a Graves-kóros betegek lymphocytáiban, az FSLT elleni antitestek viszont nem.

Összegzésként megállapítható, hogy a pajzsmirigy- és a szemizomantigének hatása a lymphocyták MAPK-aktivitásán keresztül érvényesül. A DII enzim pajzsmirigy-autoantigénként szerepelhet az autoimmun pajzsmirigybetegségekben. A DII elleni antitestek előfordulása gátolja a lymphocyták MAPK-aktivitását, ez a betegség lefolyása szempontjából prognosztikai fontosságú lehet.

The activation of mitogen-activated protein kinase (MAPK) in lymphocytes of patients with thyroid diseases

The activation of MAPK plays a role in the proliferation, differentiation and apoptosis of lymphocytes. The effects of autoantigens, such as thyroid and eye muscle and 2 type of 5' deiodinase were studied on the activation of MAPK in the lymphocytes of controls (n=5) and the patients with autoimmune thyroid diseases (n=15) using western blotting method. 0.5 or 5 microgramm/100 microliter of antigens and 10 microgram/10 microliter of serum containing antibodies against peptides were added to 108/100 microliter of lymphocytes separated in Ficoll gradient. The RPMI medium was supplemented with protease inhibitor. Antibodies against MAPKs (p42/44) and ERK 1/2 were used for the detection of signal transduction. The results demonstrated intensive and fast activation of MAPK in the lymphocytes of the patients with autoimmune thyroid diseases in comparison with those in controls using soluble human thyroid antigen fraction. The effect of human soluble eye muscle antigen fraction was relevant on the activation of MAPK not only in the lymphocytes of patients with Graves' disease but also in the controls after the incubation of 2 hours. The addition of peptides (LVFR, aa 123-143, TCSS, aa 131-152, scrambled control FSLT), corresponding to the aminoacid sequences of 2 type of 5' deiodinase caused an activation of MAPK in the lymphocytes of the patients with Graves' disease and Hashimoto's thyroiditis but the kinase activity was time-depended. The sera containing antibodies against LVFR inhibited the activation of MAPK in the lymphocytes of Graves' patients while it was not influenced by FSLT.

In conclusion, the thyroid and eye muscle antigens have an effect on the activation of MAPK in the lymphocytes, 2 type of 5' deiodinase could play a role as an autoantigen in the autoimmune diseases. The antibodies against 2 type of 5' deiodinase inhibit the activation of MAPK in the lymphocytes, which could have prognostic importance in the development of the thyroid diseases.



56. A Chlamydia pneumoniae-fertőzés és az allergia kapcsolata gyermekkori asthmában (E39)
Nagy Adrienne1, Kis Zoltán2, Budai Irén3, Falus András4, 5, Szalai Csaba5, 6
1Budai Gyermekkórház és Rendelőintézet;
2Jahn Ferenc Országos Epidemiológiai Központ; Semmelweis Egyetem,
3Orvosi Mikrobiológiai Intézet,
4Genetikai Sejt- és Immunbiológiai Intézet;
5MTA-Semmelweis Egyetem, Molekuláris Immunológiai Kutató Csoport;
6Heim Pál Gyermekkórház, Budapest

Számos közlemény foglalkozik a Chlamydia pneumoniae-fertőzés és az asthma bronchiale kapcsolatával; az eredmények ellentmondásosak. Tekintettel arra, hogy a gyermekkori asthma bronchiale nagy része allergiás típusú, munkánkban a gyermekkori allergia, az asthma és a Chlamydia pneumoniae-fertőzés kapcsolatát vizsgáltuk. A vizsgálatban 323 gyermek és fiatal vett részt (életkor: 3-23 év, átlag: 11 év, szórás: 4,4): 139 asthmás, köztük 110 allergiás asthmás és 29 nem allergiás asthmás, 61 csak allergiás, de nem asthmás és 123 kontrollgyermek. Az allergia és az asthma bronchiale diagnózisát a klinikai tünetek értékelésén kívül allergológus állította fel, Prick-bőrpróba, specifikus IgE-meghatározás, ételterhelés, alap- és bronchodilatációs légzésfunkciós vizsgálatok segítségével. A Chlamydia pneumoniae-specifikus IgM-, IgA-, IgG-meghatározás protein ELISA-val történt. A pozitivitást a cut off index >1,1 alapján számoltuk. A statisztikai elemzést SPSS 11.0 programmal, khi2-próbával, Fisher-féle egzakt teszttel végeztük.

A Chlamydia pneumoniae-fertőzöttségben nem találtunk szignifikáns különbséget az egyes betegcsoportok között, azonban az akut/perzisztáló Chlamydia pneumoniae-fertőzés prevalenciája szignifikánsan magasabbnak bizonyult az allergiás asthmások között, különösen az inhalatív allergénekre pozitivitást mutató allergiás asthmás gyermekek között, mint az egyéb allergénekre pozitív, illetve nem allergiás gyerekek között, korra és nemre vonatkozó korrekciót követően is.

Eredményeink szerint Chlamydia pneumoniae-fertőzöttség szempontjából nem az asthmások és a nem asthmások között volt mérhető különbség - mint azt több publikációban tanulmányozták -, hanem az inhalatív allergia jelenléte vagy annak hiánya volt felelős a csoportok közötti szignifikáns eltérésért. Az akut, valamint a perzisztáló Chlamydia pneumoniae-fertőzés szignifikánsan gyakoribb előfordulása az allergiás asthmás gyermekek körében felveti a Chlamydia pneumoniae-szűrés bevezetésének szükségességét az allergiás gyermekek között. A célzott makrolid antibiotikus terápiával remélhetőleg megelőzhetjük a krónikus gyulladás kialakulását. A Chlamydia pneumoniae-fertőzés és az allergiás asthma között feltételezett ok-okozati összefüggés irányának meghatározásához követéses vizsgálatok, epitópkutatások és genetikai vizsgálatok is szükségesek a jövőben.

Connection of allergy and Chlamydia pneumonia infection in childhood asthma

Several publications have studied the connection between asthma bronchiale and Chlamydia pneumoniae infection with controversial results. This study was designed to test the association of Chlamydia pneumoniae infection asthma and allergy in children. Three hundred twenty-three children and young adults were enrolled in the study (3.01-22.54 years, mean: 11.04 years, SD: 4.35). One hundred and thirty-nine patients with asthma bronchiale, 61 mixed allergy but without asthma, 123 healthy controls participated. Allergy was diagnosed by using skin Prick test, measuring specific IgE level from serum, food challenge and examining clinical signs. Chlamydia pneumoniae species specific IgM, IgA, IgG were measured by protein ELISA. Positivity was calculated according to cut off index>1.1.

In Chlamydia pneumoniae infection there were no significant differences between the groups, but the prevalence of acute/persistent Chlamydia pneumoniae infection was significantly higher in allergic asthma patients, especially in inhalative allergen positive allergic asthma patients than that of in patients without allergy (p=0.004, OR=3.72, 95% CI=1.53-9.05), also after adjusting for age and sex (p=0.028, OR=3.13, 95% CI=1.13-8.67).

According to these results the differences in Chlamydia pneumoniae infection status are not between the asthma and non-asthma groups as in several previous studies have been described. The presence of allergy is more important in childhood in the examined population. To determine the direction of the supposed cause-causative relation, follow-up studies, genetic investigations and epitope analyses are necessary among Chlamydia pneumoniae infected allergic children.



57. Ciklikus citrullin peptid elleni ellenanyag-meghatározás diagnosztikai értéke ízületi panaszokkal járó betegségekben (E33)
Németh Julianna, Miklós Kata, Kilián Katalin, Gopcsa László, Pálóczi Katalin
Országos Gyógyintézeti Központ, Budapest

A rheumatoid arthritis (RA) szerológiai diagnosztikájában általánosan alkalmazott teszt a reumafaktor (RF) meghatározása. Emellett napjainkban új lehetőség a szintetikus ciklikus citrullin peptid (CCP) elleni ellenanyag (anti-CCP) mérése.

Laboratóriumunkban 80 RF-pozitív és 40 RF-negatív szérummintából végeztünk anti-CCP-IgG-meghatározást Inova ELISA-val. A reumafaktort nephelometriával, a Waaler-Rose- tesztet passzív haemagglutináció-gátlás módszerével mértük. A kiértékelést és összehasonlítást négy betegségcsoportban végeztük: RA-szeropozitív (20 eset) és -szeronegatív (10 eset), poliszisztémás autoimmun kórkép (45 beteg), hematológiai rendellenesség (25 beteg), valamint egyéb ízületi panasszal járó betegség (20 beteg).

Az RA-csoportban a minták nagy százalékban anti-CCP-pozitívnak bizonyultak (75%), míg egyéb kötőszöveti betegségben a mintáknak csupán 10%-a bizonyult anti-CCP-pozitívnak. Reaktív arthritisben és egyéb ízületi panasszal járó kórképben anti-CCP-pozitivitás nem fordult elő. Juvenilis rheumatoid arthritisben mindkét szerológiai paramétert negatívnak találtuk.

Eredményeink alapján a CCP-specifikus autoantitest-meghatározást egyértelműen differenciáldiagnosztikai markerként értékeljük a rheumatoid arthritis és az egyéb, RF-pozitivitással járó betegségek elkülönítésében.

Diagnostic value of the measurement of antibodies against citrullinated peptide in diseases with joint involvements

The measurement of rheumatoid factor (RF) is a commonly used test in serological diagnostics of rheumatoid arthritis (RA). In addition to this method, the examination of antibodies against synthetic cyclic citrullinated peptide (anti-CCP) has recently been described as a new possibility in diagnostics.

The diagnostic value of anti-CCP measurements has been studied recently in our laboratory. The measurement of anti-CCP was carried out by Inova ELISA in sera of 80 RF-positive and 40 RF-negative patients. The RF was measured by nephelometry, the Waaler-Rose test was carried out by the method of HAI.

The results were evaluated in four groups of patients: 30 patients with seropositive (20 patients) or seronegative (10 patients) RA, 45 patients with polysystemic autoimmune disease, 25 patients with hematological disorders, and 20 patients with reactive arthritis or other diseases with joint involvements. The anti-CCP test proved to be positive in overhelming majority of the samples (75%) in RA group, while only 10% of the samples were positive in other connective tissue diseases. No anti-CCP positivity was found in reactive arthritis or in other diseases with joint involvements. Both serological markers were negative in patients with juvenile RA.

Our results show, that the measurement of anti-CCP is a reliable differential diagnostic tool for the separation RA from other RF-positive diseases.



58. Immungenetikai és immunregulációs faktorok a visszatérő spontán vetélés patológiai hátterében; a terápia lehetőségei (P23)
Padányi Ágnes, Kotlán Beatrix, Pénzes Mária, Rajczy Katalin, Fülöp Vilmos, Gyódi Éva, Petrányi Győző
Országos Gyógyintézeti Központ, Budapest

A fő és a minor hisztokompatibilitási antigének fontos szerepet játszanak a reprodukciós immunológiában, az alloimmun válasz indukciójában vagy a szuppresszív regulációban. A nem hisztokompatibilitási alloantigének szerepéről keveset tudunk. A HLA-A, -B, -C és a HLA-DR, valamint a HLA-G antigének vizsgálata nem mutatott összefüggést a spontán vetélés előfordulásával. Ugyanakkor kimutatható, hogy a szuppresszív reguláció beindításában a TLX/CD46/MCP polimorf alloantigén rendszer szerepet játszhat. Populációs vizsgálatokkal négy specificitást írtunk le; kimutatható, hogy az antitestek indirekt FcgRII-blokkoló hatásúak. Transzfúzió esetén a blokkolóantitest termelődése a donor és a recipiens között fennálló TLX-B-antigén-eltérés hatására indulhat meg. Normális terhességben magas blokkolóantitest-titer mutatható ki; a CTLp-aktivitás kicsi. A visszatérő spontán vetélők többségénél hiányzik a blokkolóantitest és nagy CTLp-aktivitás figyelhető meg a házaspárok közötti TLX-antigén-egyezés mellett. Ami a terápiát illeti, a blokkolóantitest hiányzó termelődése kiváltható a TLX antigénrendszerben eltérő thrombocyta vagy leukocyta adásával, ami vagy a férjtől, vagy egy idegen donortól származik; az esetek többségében normális terhesség jött létre. Másik terápiás lehetőség az intravénás immunglobulin adása, ez bizonyíthatóan magas titerben tartalmaz blokkoló ellenanyagot. Immunterápia alkalmazására már több mint 20 esetben került sor. Ebben a munkában két esetet mutatunk be, kiemelve a terápia előtti és az azt követő immunológiai paramétereket.

Immunogenetic and immunoregulatory factors involved in the pathological phenomena of recurrent spontaneous abortion; therapeutical consequences

Major and minor histocompatibility antigens play a functional role in the induction of protective regulation in pregnancy, however, less is known about the importance and the function of non histocompatibility alloantigens in this respect. Relating to the HLA classical phenotypes and to the HLA-G allotypes, no association was with the occurrence of recurrent spontaneous abortions. On the other hand, it was suggested that the TLX/CD46/MCP polymorph alloantigen system may participate in the induction of suppressive regulation. Population studies revealed four overlapping specificities of TLX-B antigens. It was showed that alloantibodies to TLX antigens have an indirect FcgRII-blocking feature. It was found that the induction of blocking antibody production depend on the mismatching in TLX/CD46/MCP phenotypes between donor and recipient in the case of transfusion. In normal pregnancies high level of blocking antibody could be detected and cytotoxic T-lymphocyte precursor frequency (CTLp) against the husband target cells represents relatively low level. In cases of recurrent spontaneous abortion (RSA) no blocking antibody production could be found and high CTLp frequency was characteristic parallel to matching in the TLX alloantigens between the couples. Relating to the therapeutical approaches, the missing blocking antibody production can be induced by the transfusion of TLX mismatching leukocytes or platelets from either the husband or from a third party donor resulting in most of the cases normal pregnancies. Based on these immunpathological immune parameters the recent report will summarize the first evaluation of the clinical study of more than 20 patients and show few representative cases in immunological respect.



59. A placentában expresszálódó új PIBF-izoforma (E22)
Palkovics Tamás1, Bellyei Szabolcs2, Kispál Gyula2, Szekeres-Barthó Júlia1
Pécsi Tudományegyetem, ÁOK,
1Orvosi Mikrobiológiai és Immunitástani Intézet,
2Biokémiai és Orvosi Kémiai Intézet

Előzmények: A progeszteron indukálta blokkolófaktornak (PIBF) eddig 11 izoformáját írták le. Különböző szövetekből - egészséges szövetek, számos tumorszövet - izoláltak már variánsokat, amelyek a teljes génből alternatív splicing eredményeként jönnek létre. Keveset tudunk azonban arról, hogy mi szabályozza a különböző formák termelődését, illetve azoknak mi a funkciója az egyes szövetekben. Saját korábbi adataink és mások megfigyelései alapján feltételezhető, hogy a különböző hosszúságú termékek eltérő hatásokat közvetítenek, illetve elképzelhető, hogy a molekula hatásainak kifejtésében - a receptorhoz való kapcsolódásban, a jelátviteli utak aktiválásában - bizonyos régiók kitüntetett jelentőségűek. Ezért fontosnak gondoljuk meghatározni, mely génszakaszok átírását preferálják a különböző szövetek.

Célkitűzések: A PIBF hatásmechanizmusának vizsgálatával kapcsolatban többek között a következő kérdésekre keresünk választ: milyen alternatív PIBF-variánsok termelődnek a szervezetben különféle körülmények között, és ezeknek mi a feltételezett szerepe egyes folyamatokban (terhesség, tumor kialakulása stb.). A placentával kapcsolatban eddig rendelkezésre álló adatok alapján nem tisztázott, hogy milyen hosszúságú az ott expresszálódó PIBF. Jelen vizsgálatban ezt határoztuk meg.

Módszerek: Az izolálást placenta cDNS-könyvtárból (Uni-ZAP XR) plakk-lift technikával végeztük. A nitrocellulóz membránok előhívásához rekombináns, 48 kDa-os, PIBF ellen nyúlban termelt poliklonális antitestet és nyúl-Ig-ellenes, ALP-vel jelölt szekunder antitestet használtunk. Három vizsgálati ciklus után három izolálható, pozitív klónt találtunk; ezek, mi-után az inzertet a bakteriofág vektorból plazmid formában kinyertük, szekvenálásra alkalmasnak bizonyultak.

Eredmények: Mind a három klón ugyanazt az inzertet tartalmazta: a szekvenálás eredménye szerint ez egy eddig még nem azonosított PIBF-variáns. A kódolórégió hossza 1905 bp; ez egy 635 aminosavból álló, mintegy 74 kDa tömegű fehérjét kódol. A szekvenciaadatok szerint ez a szakasz szinte 100%-ban homológiát mutat a teljes hosszúságú PIBF egy részével. Tekintettel arra, hogy mind a három izolált klón ugyanazt a variánst hordozta, valószínűnek látszik, hogy a placentában csak ez az egyfajta izoforma van jelen. Mivel azonban a placentában több különböző sejttípus található, nem tudjuk, hogy az általunk talált formát egyidejűleg több sejttípus is kifejezi-e, vagy az expresszió egyetlen sejttípushoz köthető; az is tisztázandó, hogy miért éppen ez a forma termelődik itt.

Szeretnénk fehérvérsejtekből készült cDNS-könyvtár vizsgálatát hasonló módon elvégezni, és így pontosabb képet kapni az immunrendszer elemeinek PIBF-expresszióját illetően.

A new isoform of PIBF expressed in placenta

Background: So far 11 isoforms of the progesterone induced blocking factor (PIBF) have been described. These variants were isolated from various tissues (healthy and several tumor tissues), and they are expressed as the result of alternative splicing from the whole gene. At present we do not know too much about the regulation of the expression of the different forms neither of their function. Based on our previous experiments and the findings of others it is plausible that some regions of the molecule might play a crucial part in its mechanism of action, like the receptorial binding or the activation of different signal transduction pathways. For this reason it is of importance which regions of the gene are preferred for transciption in different tissues, since it has an impact on the regulatory effect of the molecule.

Aim of the study: The questions we want to answer concerning the mechanism of action of PIBF are the following: the types of alternative variants that are produced throughout the body under different conditions and their possible role in physiologic and non-physiologic processes (eg. pregnancy, tumor genesis). Based on the data at our disposition regarding the placenta it is still unknown what form of PIBF is expressed by this tissue. The aim of the present study was to identify it.

Methods: A premade cDNA library from placenta (Uni-ZAP XR) was screened with plaque-lift technique. For the visualization of the nitrocellulose membranes a policlonal antibody, produced in rabbit to human recombinant 48-kDa PIBF and a secondary, ALP conjugated anti-rabbit Ig was used. After three screening cycles we obtained three independent, clearly visible clones, which were prepared to sequencing by cutting out a plasmid carrying the insert from the bacteriophage vector.

Results: All three clones contained the same insert, which is, according to the sequence data, a new variant of PIBF not described so far. The coding region spans 1905 bp, coding for a protein of 635 aminoacid residues, having a molecular weight of about 74 kDa. The similarity search of this nucleotid sequence detected an almost 100% identity with a portion of the full length PIBF. Regarding that all three clones carried the same insert it is very probable that it is the only isoform present in the placenta. Nevertheless, since it is tissue composed of various different types of cells, it is not clear whether the isoform we detected is expressed by several cell types or it is associated with a particular one. Beside this the biological reason and significance of the production of this given alternative variant in the placenta is also unknown.

For the near future we are planning to perform the same type of screening from a premade library prepared from white blood cells to obtain a more detailed insight into the PIBF expression of the elements of the immune system.



60. A TLR2- és TLR4-receptorok differenciációfüggő kifejeződése HaCaT keratinocytákon (P13)
Pivarcsi Andor1, Koreck Andrea2, Szeg Csilla2, Belső Nóra2, Bodai László2, Széll Márta1, Bata-Csörgő Zsuzsanna1, 2, Dobozy Attila1, 2, Kemény Lajos1, 2
1MTA-Szegedi Tudományegyetem, Dermatológiai Kutatócsoport;
2Szegedi Tudományegyetem, Bőrgyógyászati és Allergológiai Klinika

A Toll-szerű receptorok (TLR) közül a TLR2- és TLR4-receptorok kifejeződését a humán epidermisben nemrégiben írta le csoportunk, valamint más munkacsoportok. Kimutattuk, hogy e receptorok fontos szerepet játszanak a patogének felismerésében és a rájuk adott reakció kialakításában. Mivel az epidermis legfelső, differenciált keratinocytákból álló rétege biztosítja a szervezet legkülső védelmi vonalát a külvilággal szemben, azt vizsgáltuk, hogy a TLR2 és TLR4 gének kifejeződését befolyásolja-e a keratinocyták proliferációs-differenciációs állapota.

Kísérleteinkben egy HaCaT-differenciációs modellt használtunk, amelyben a sejteket passzálást követően konfluenciáig növesztettük. A TLR2 és TLR4 gének kifejeződését mRNS- és fehérjeszinteken követtük, valós idejű RT-PCR és FACS vizsgálatokkal. A sejtek differenciációs állapotának meghatározására az involukrin gén kifejeződését használtuk fel, ez a keratinocyták egyik késői differenciációs markere.

Eredményeink szerint a TLR2 és TLR4 gén kifejeződése a differenciált sejtkultúrában szignifikánsan nagyobb volt, mint a kis sűrűségű, gyorsan proliferálódó kultúrában. A TLR2 gén kifejeződése - 36 órás növesztést követően - kilencszeresére nőtt a 0 órás mintához viszonyítva. Hatvan, illetve 132 órával később a TLR2 gén kifejeződése 29-, illetve 70-szeresére emelkedett. A TLR4 gén kifejeződése 36, 60, illetve 132 órával később hét-, kilenc- és 14-szeresre nőtt. A fenti vizsgált időpontokban az involukrin gén kifejeződése a 0 órás érték 6-, 19-, illetve 18-szorosára emelkedett. A differenciáció során a sejtfelszíni TLR2 és TLR4 fehérjék mennyisége három-, illetve 3,3-szeres emelkedést mutatott a kezdeti értékekhez viszonyítva.

Eredményeink szerint keratinocytákban a differenciáció indukálja a TLR2 és TLR4 gének kifejeződését.

Differentiation-regulated expression of Toll-like receptor 2 and 4 in HaCaT keratinocytes

Recently, we and other groups have demonstrated that Toll-like receptors 2 and 4 (TLR2, TLR4) are expressed in the human epidermis and they are important components in the innate immune recognition of microbial products. As the uppermost, differentiated layer of the epidermis provides the first line of host defense against external pathogens, we examined the expressions of TLR2 and TLR4 in relation to the differentiation state of HaCaT keratinocytes. In our differentiation model system, HaCaT cells were grown to confluence. RealTime RT-PCR and FACS analyzes were used to follow the changes in TLR2 and TLR4 mRNA and protein levels during the differentiation of cell culture. Involucrin expression, a marker of keratinocyte terminal differentiation was used to determine the differentiation state of the cells.

TLR2 and TLR4 mRNA levels were low in the highly proliferating, low-density cell culture, but their expressions increased in parallel with differentiation. The expression of TLR2 gene was 9-fold at 36 hour compared to the 0h value. Sixty and 132 hours later, the expression of TLR2 gene increased to 29- and 70-fold, respectively. Expressions of TLR4 gene at 36, 60 and 132 hours were 7-, 9-, and 14-folds, compared to the 0-hour value. During this period the involucrin gene expression showed 6-, 19- and, 18-fold increases over the 0-hour value. During differentiation, the amount of TLR2 and TLR4 proteins present on the cell surface have increased up to 3- and 3.3-fold, respectively. These results show that the expressions of TLR2 and TLR4 genes are up-regulated in more differentiated keratinocytes.



61. A rekombináns PIBF epitópjainak vizsgálata, biológiailag aktív régióinak azonosítása I. (E23)
Polgár Beáta1, Mikó Éva1, Berki Tímea2, Nagy Eszter3, Szekeres-Barthó Júlia1
Pécsi Tudományegyetem, ÁOK,
1Orvosi Mikrobiológiai és Immunitástani Intézet,
2Immunológiai és Biotechnológiai Intézet;
3INTERCELL AG, Bécs, Ausztria

Terhes nők aktivált lymphocytái progeszteronreceptort expreszszálnak és progeszteron jelenlétében egy 34 kDa molekulatömegű mediátort - progeszteron indukálta blokkolófaktort (PIBF) - termelnek. Annak érdekében, hogy vizsgálni tudjuk a PIBF összes lehetséges hatását, klónoztuk a molekulát, majd meghatároztuk a fehérje molekuláris és strukturális sajátosságait. A PIBF multiplex immunológiai hatásai arra utalnak, hogy a különböző funkciók más-más doménekhez kötöttek, így lehetővé válhat a PIBF direkt NK-gátlásra és citokintermelésre kifejtett hatásának elválasztása. A rekombináns humán PIBF (rhuPIBF) alkalmazásával lehetőség nyílik a molekula pontos immunmoduláló hatásának vizsgálatára.

Célunk, hogy azonosítsuk és jellemezzük a PIBF azon funkcionálisan aktív darabjait/doménjeit, amelyek lehetővé teszik a biológiailag aktív részek előállítását kémiai úton, így potenciálisan kevesebb mellékhatású funkcionális agonisták és antagonisták létrehozatalát, immunológiai keresztreakcióik  kisebb kockázatával.

Módszerek: a 90 kDa-os tömegű, teljes láncú PIBF-ből molekuláris biológiai technikával 10-20-50 kDa-os rhuPIBF-fragmenteket (PN) hoztunk létre, a fehérje C-terminális, 6 kDa-os darabját szintetikus formában állítottuk elő. A fragmentek lehetséges epitópjait monoklonális antitestek segítségével azonosítottuk, az epitópok antigénkötési sajátosságait ELISA teszttel jellemeztük. A PIBF-fragmentek IL-10- és IL-12-termelésre kifejtett hatását immuncitokémiával és szemikvantitatív RT-PCR-rel vizsgáltuk.

Eredmények: Megállapítottuk, hogy az M2, M3, M6 és M9 monoklonális antitestek az exon 2-4 által kódolt PN1-en belüli szekvenciális epitópokat ismernek fel; az M4 és M8 antitestek az ugyanezen fragmenten belüli konformációs epitópra specifikusak. Az M7 antitest az exon 5-7 által kódolt PN2 konformációs epitópjával reagál, az M1 és M5 antitestek az exon 8-9 kódolta peptid (PN3) szekvenciális epitópjait ismerik fel. A C-terminális szintetikus peptidre (exon 17) specifikus antitestek a molekulán belüli szekvenciális epitóppal reagálnak. A szolúbilis PIBF-molekulát az M6, M7, M8 és M9, valamint az antiexon 17 monoklonális antitestek kötik a legkifejezettebben, így ezek az ellenanyagok potenciálisan felhasználhatók egy monoklonális antitest alapú diagnosztikus ELISA teszt kialakításában. Funkcionális tesztekben a 48 kDa-os (az exon 2-9 által kódolt) PIBF-fragment bizonyult a leghatékonyabbnak, koncentrációdependes módon fokozta a perifériás lymphocyták IL-10-termelését és csökkentette az IL-12-szintet, jelezve a biológiailag aktív hely(ek) lehetséges pozícióját. Tekintve, hogy a PIBF nemcsak a terhesség során, hanem különböző malignus tumorokban is termelődik, az "aktív-PIBF-fragment" a jövőben potenciális terápiás alternatívaként szerepelhet a spontán abortuszok egyes formáinak kezelésében, valamint a tumorterápiában.

Epitope characterization and determination of the biologically active sites of the recombinant PIBF molecule

Activated lymphocytes of pregnant women express progesterone-receptors and in the presence of progesteron produce a 34-kDa mediator protein named the progesterone induced blocking factor (PIBF). To explore all the possible activities of PIBF, the molecule was cloned, and determined its molecular and structural properties. The multiplex immunological effects of this protein suggest the possibility that the different activities are exerted by different domains, which would allow to disconnect the direct NK inhibiting capability from those affecting cytokine production. The rhuPIBF allows to test the exact immunomodulatory effect of the molecule.

Our aim: is to define and characterize the functionally active parts/domains of the PIBF, which might allow the production of chemically synthesised therapeutics (functionally agonists or antagonists) with lower risk of potential side effects and cross-reaction with other metabolic immunological pathways.

Methods: We cloned 10-20-50 kDa rhuPIBF constructs (PN fragments) from the full length 90-kDa PIBF using molecular biological technique. The C-terminal 6-kDa peptid was chemically synthetised. The potencial epitopes of the rhuPIBF were determined by monoclonal antibodies and the characteristics of the antigen-binding capacity were defined by ELISA test. The effect of PIBF fragments on IL-10 and IL-12 production were analysed with immunocytochemistry and semiquantative RT-PCR.

Results: Our data suggest, that the monoclonal antibodies (mAb) M2, M3, M6 and M9 recognized sequential epitopes on the PN1 peptide encoded by exons 2-4, whereas M4 and M8 recognize conformational epitopes in the same area. M7 recognizes a conformational epitope on the PN2 peptide coded for by exons 5-7, M1 and M5 mAbs recognize sequential epitopes encoded by exons 8-9 (PN3). Antibodies reacted with the C-terminal synthetic peptide (coding by exon-17) recognise sequential epitopes. The M6, M7, M8, M9 and anti-exon-17 mAbs strongly recongnize the soluble peptide forms, therefore these monoclonal anti-human PIBF antibodies might allow to develop a monoclonal-base diagnostic ELISA test. In fuctional tests the 48-kDa (exon 2-9 coded) PIBF fragment increased the percentage of IL-10 and decreased that of IL-12 positive lymphocytes in a concentration dependent fashion indicating the possible position of biologically active sites. Based on the findings, that PIBF is produced not only during pregnancy but it is produced by malignant or undifferentiated cells, the treatment with an "active-PIBF fragment" might serve as an alternative for specific treatment of certain forms of spontaneous abortion and malignancies.



62. Antigénirányítás a 2-es típusú egér-komplementreceptorhoz - kétélű fegyver (E14)
Prechl József, Molnár Eszter, Isaák Andrea, Papp Krisztián, Erdei Anna
Eötvös Loránd Tudomámyegyetem, Immunológiai Tanszék, Budapest

Annak ellenére, hogy a 2-es típusú komplementreceptort (CR2) a B-sejtek funkcióit pozitívan szabályozó receptornak tekintjük, ha célzottan a receptorhoz irányítunk antigéneket, a humorális imunválasz gátlását érhetjük el. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy egy CR2-ellenes antitest nem váltott ki ellenanyagválaszt, valamint tojásfehérje-lizozimhez (HEL) kapcsolt egy darab C3d-molekula (a CR2 természetes liganduma) gyengítette a HEL-ellenes immunválaszt. Ezzel szemben a két vagy három darab C3d-vel kapcsolt HEL kifejezetten immunogénnek bizonyult; egy ovalbuminhoz (OVA) kapcsolt CR2-t felismerő ellenanyag szintén javította az immunválaszt. A B-sejteket toleráns antigénprezentáló sejteknek tekintjük, mivel nem képesek naiv T-sejteket aktiválni. Ez a tulajdonságuk elnyomhatja a B-sejt-antigén-receptor és a CR2 keresztkötéséből eredő, hatékony B-sejt-aktiváció előnyét. Az, hogy a CR2-receptorhoz irányított antigének egyes formái immunogének, valószínűleg a professzionális antigénprezentáló sejteknek való antigén-továbbadás eredménye.

Kísérleteinkben egy CR2-t felismerő, egyláncú ellenanyag-fragmentumból és egy immunodomináns virális peptidből álló konstrukciót (hH2-7G6scFv) használtunk az egér-CR2-receptor immunválaszban játszott szerepének vizsgálatához. Intraperitonealis oltás hatására a szabad peptidnél magasabb titerű ellenanyagválaszt kaptunk, ez azonban az IgM osztályra korlátozódott, és emlékeztető oltás esetén sem változott. Peptidspecifikus T-sejtek adása sem változtatta meg az immunválasz minőségét. Ezután komplett Freund-adjuváns és szabad peptid keverékével immunizáltunk, majd a konstrukciónkkal, illetve csak peptiddel ismételtük meg az oltást. A hH2-7G6scFv hatására a peptidellenes IgM titere növekedett, az IgG-titer viszont csökkent.

Eredményeink arra utalnak, hogy szervezet szintjén a CR2-receptorhoz irányított antigének gyengíthetik a fajlagos immunválaszt, a CR2 által közvetített sejtközti kapcsolatok befolyásolása révén.

Antigen targeting to murine CR2 - a double edged sword

Although complement receptor type 2 (CR2) is regarded as a positive regulator of B-cell responses, antigen targeting to murine CR2 can actually inhibit humoral immune responses. In previous studies a rat anti-mouse CR1/2 antibody failed to induce immune responses and recombinant proteins comprising hen egg lyzosyme and one copy of C3dg impaired anti-HEL antibody production. On the other hand HEL joined to two or three copies of C3dg is highly immunogenic, and OVA conjugated anti-mouse CR1/2 was potent in inducing anti-OVA responses. B cells are generally thought to be tolerogenic because of their inability to activate naive T cells. This property may overrun the advantage of enhanced B-cell activation by CR1/2-BCR coligation and antigen capture by FDC. That some forms of CR1/2 targeted antigens are immunogenic might be attributable to antigen transfer to professional antigen presenting cells.

We used a recombinant single-chain antibody fused to an immunogenic viral peptide epitope to examine the role of murine CR1/2. Intraperitoneal administration of the construct resulted in marginally higher anti-peptide titers as compared to free peptide. The humoral response was restricted to IgM and could not be improved by secondary immunization. Moreover injection of peptide-specific T cells before the immunization could not qualitatively alter the response. In the next series of experiments we primed the animals with peptide-CFA mixture and challenged them with the construct. Compared to the free peptide, hH2-7G6scFv modulated anti-peptide antibody production resulting in higher IgM and decreased IgG levels.

We conclude that on the level of the organism CR1/2 targeted antibodies may suppress immune responses possibly by interfering with CR1/2 mediated cellular interactions.



63. A hősokkfehérjék és a komplementrendszer kölcsönhatásai (R5)
Prohászka Zoltán, Füst György
Semmelweis Egyetem, ÁOK, III. Sz. Belgyógyászati Klinika, Budapest

A szervezet és a sejtek stresszválasza ősi védekező mechanizmusok; a környezeti változásokhoz való alkalmazkodást és a túlélést szolgálják. Sokrétű, bonyolult szabályozás alatt álló, egymással kölcsönhatásban lévő folyamatok összessége eredményezi a szervezet túlélését. Munkacsoportunk érdeklődésének középpontjában a hősokkfehérjék (Hsp) és a komplementrendszer állnak. Mindkét rendszer kitüntetett szerepet játszik a természetes ("azonnali") védekezési reakciókban. Az utóbbi években a hősokkfehérjék és a komplementrendszer kölcsönhatásait vizsgáltuk. Megállapítottuk, hogy a felülethez kötött humán 60 és 70 kD-os hősokkfehérjék erősen aktiválják a komplementrendszert. Az aktiváció mindkét esetben a klaszszikus reakcióúton zajlik, de a mechanizmus eltérő. Míg a Hsp60-nál az anti-Hsp60 antitestek (immunkomplexek) a fő aktivátorok, addig a Hsp70 esetében a C1q direkt kötődését és aktivációját észleltük. Irodalmi adatok alapján nagyfokú hasonlóság mutatható ki a kalretikulin és a Hsp70 komplementaktiváló képessége között. Legújabb kísérleteinkben feltérképeztük a Hsp70 pontos C1q-kötő helyét.

Eredményeink és az irodalmi ismeretek összefoglalása arra utal, hogy az endoplazmás reticulum rezidens hősokkfehérjék egy konzervált jellegű C1q-kötőhelyet tartalmaznak. Ezzel szemben a mitochondriumban található (prokaryota eredetű) hősokkfehérje (Hsp60) más úton aktiválja a komplementet. A természetes immunitás és a stresszválasz közötti összefüggés két igen ősi rendszer között teremt kapcsolatot, amely feltehetően fontos biológiai szerepet játszik.

Interaction between heat shock proteins and the complement system

The stress response of the organism and it's cells are ancestral functions serving environmental adaptation and survival. The survival is based on complex, well-regulated processes that interact with each-other. The main research areas of our group are heat shock proteins (Hsp) and complement. Both systems play essential roles in the natural ("immediate") immune reactions. In the last years we focused our attention on the investigation of the interactions between heat shock proteins and complement. As a result of our efforts strong activation of complement by surface-adsorbed 60- and 70 kD heat shock proteins was demonstrated. The activation takes place in both cases via the classical pathway, the mechanism of activation, however, seems to be different. In case of human Hsp60 anti-Hsp60 antibodies (imunocomplex) are the main regulators of activation, whereas Hsp70 activates complement through the direct binding of C1q. Comparisons between calreticulin and Hsp70 demonstrated a striking similarity in complement activation between these proteins. The C1q binding site on Hsp70 was characterized in our recent experiments.

In summary, our results and literature data indicate that the endoplasmic reticulum-resident heat shock proteins Hsp70 and calreticulin contain a conserved binding site for C1q. In contrast, mitochondrial Hsp60 (originating from prokaryotes) activates complement in a different way. The interaction between heat shock proteins and complement, two ancestral systems of natural immunity, may play important roles in physiological and pathological processes.



64. A C-reaktív fehérje és a C1q kölcsönhatásának elemzése (E35)
Róvó Zita1, Cervenak László1, 2, Varga Lilian1, Füst György1, 2, Larry A. Potempa3, Mohamed R. Daha4, Anja Roos4, Prohászka Zoltán1, 2
1Semmelweis Egyetem, ÁOK, III. Sz. Belgyógyászati Klinika;
2Semmelweis Egyetem-MTA Anyagcsere és Atherosclerosis Kutatócsoport, Budapest;
3ImmTech, Vernon Hills, IL, USA;
4Department of Nephrology, Leiden University Medical Center, Leiden, Hollandia

A C-reaktív fehérje (CRP) klasszikus akutfázis-fehérje; alapvető biológiai feladata a gyulladás fékezése, a károsodott sejt- és szöveti alkotórészek eltüntetése, a gyógyuláshoz vezető folyamatok beindítása. Ezt a funkcióját opszonizáló, komplementaktiváló és fagocitózist serkentő tulajdonságai révén tölti be. A natív CRP képes ligandjaihoz kapcsolódni a károsodott célfelszínen (legismertebb ligandja a foszfatidil-kolin), és ligandkötés után aktiválja a komplementkaszkád klasszikus útvonalát. Kiemelendő, hogy a komplement aktivációjáért a C1q-komponens direkt kötése a felelős. Kevesebb vizsgálat célpontja volt eddig a CRP módosított formája (mCRP), amely in vitro denaturáló hatásokra keletkezhet: a CRP pentamer struktúrájának felbomlása és új epitópok megjelenése jellemzi. Az mCRP kimutatható sejteken és szöveti metszeteken is, azonban nem ismert, hogy milyen in vivo hatások felelősek a molekula keletkezéséért.

Munkacsoportunk a módosított CRP-molekula C1q-kötő és komplementaktiváló képességét vizsgálta. Vizsgálatainkhoz ELISA rendszert használtunk; antigénként tisztított, natív CRP-t és rekombináns úton vagy ureakezeléssel előállított, módosított CRP-t használtunk.

Eredményeink szerint a CRP módosított formája képessé válik ligandkötés nélkül is a C1q-komponens megkötésére. A CRP és a C1q-molekulák kölcsönhatása dózisfüggő és kompetitív úton gátolható. Gátlási kísérleteink során azt a megfigyelést tettük, hogy a tisztított "C1q-fejrégió" elégséges a CRP-C1q interakció gátlásához. A módosított CRP C1q-kötése és az azt követő komplementaktiváció összefüggésének tanulmányozása az összefoglaló írásának idején még folyik.

Eredményeinket összefoglalva megállapítható, hogy a CRP módosult formája ligandkötés nélkül is jelentős C1q-kötő képességgel jellemezhető. A CRP módosult formája szövettani metszeteken (például atheroscleroticus plakkok területén) kimutatható, C5b-9- és C3b-depozitumokkal együttes lokalizá-cióban. Eredményeink fontos szerepet játszhatnak a CRP komplementaktiváló képességének pontos jellemzésében és egyes kóros folyamatok alaposabb megismerésében.

Studies on the interactions between C-reactive protein and C1q

C-reactive protein is a classic acute phase reactant, its basic features are the control of inflammation, stimulation of clearance of damaged cell- and tissue components and initiation of repair functions. These functions are achieved by potent opsonizing-, complement activating- and phagocytosis promoting effects. The native CRP is able to bind to its ligands on the surface of damaged targets (the best known ligand of CRP is phosphatidil-cholin) and activates the classical pathway of complement thereafter. The initiation of complement activation by CRP is based on its ability to directly bind and activate C1q. The modified form of CRP (mCRP), arising in vitro in response to denaturating actions, is less widely studied. mCRP is characterized by the loss of pentameric structure and appearance of neo-epitope structures. mCRP is present in cells and tissues as well, but the in vivo effects resulting in its formation are not known today.

The aim of the present study was to study whether mCRP is able to bind C1q and initiate complement activation. ELISA system was applied for these experiments using purified native CRP, recombinant mCRP or urea-modified CRP as antigens, purified C1q and normal human serum as complement source.

According to our results the modified form of CRP is able to bind C1q without binding of any of its ligands. The interaction is dose-dependent and can be inhibited competitively by C1q. Furthermore, the globular head region of the C1q protein is able to block the interaction between C1q and mCRP. Experiments aiming to investigate the subsequent activation of the classical pathway after the binding of C1q to mCRP are in progress.

In summary: Our results indicate for a strong interaction between the modified forms of CRP and C1q. The interaction is independent of any ligands of CRP. The modified form of CRP, together with C5b-9 deposits, can be detected in atherosclerotic regions indicating that complement activation by native and/or modified forms of CRP may be in operation in vivo. Our results may provide further data to understand the precise mechanism of complement activation by CRP.



65. A filamin-240 expressziója a lamellocytadifferenciálódás során, Drosophila melanogasterben (E24)
Rus Florentina, Kurucz Éva, Gausz János, Hegedűs Zoltán, Udvardy Andor, Andó István
MTA Szegedi Biológiai Központ, Genetikai Intézet, Szeged

A Drosophila hatékony veleszületett immunitással rendelkezik, ez a gerincesek veleszületett immunitásával mutat nagyfokú hasonlóságot. A Drosophila veleszületett sejtes immunitásának elemei a vérsejtek, nevezetesen a plasmatocyták, a lamellocyták és a kristálysejtek. A lamellocyták mind morfológiai, mind funkcionális sajátságaikat tekintve egyedinek számítanak. Differenciálódásukat abnormálisan fejlődő szövetek és paraziták váltják ki. A terminálisan differenciálódott sejtek a testidegenként felismert szöveteket határolják el a környezetüktől. Kicsi (8-10 mikron), kerek őssejtekből differenciálódnak nagy (40-50 mikron) lapos sejtekké; ezek a nagy, idegen részecskékhez kapcsolódnak és befedik azokat. A lamellocytáknak az átalakulása őssejtekből effektor sejtekké - mint azt az előző konferencián ismertettük - két fő lépésből áll. Az első lépés az őssejtek differenciálódása közbülső sejtalakká, amely sejtosztódást igényel és az L1 antigén expressziójával fejeződik be. A második lépés a közbülső sejtek nagy, lapos sejtekké differenciálódása; ez nem igényel sejtosztódást, és az L4, L6 antigének expressziója, valamint jellegzetes morfológiai változások kísérik.

Ebben a munkában egy olyan lamellocytaspecifikus antigénnek a differenciálódásban betöltött szerepét vizsgáltuk, amelyről kiderült, hogy a lamellocyták sejtvázának egyedi, aktinkötő komponense. Egyik lamellocytaspecifikus ellenanyagunk segítségével a Drosophila-cDNS expressziós génkönyvtárból öt DNS-fragmentet izoláltunk. A szekvenciák analízise azt mutatta, hogy a cheerio gén nyolc exonjának felelnek meg. A gén a filamint - aktinkötő fehérje - kódolja, amely a sejtváz szervezésében az aktinhálózat létrehozásában és különböző transzmembránfehérjéknek a sejtvázhoz horgonyzásában vesz részt. A Drosophilában két, alternatív splicing révén kialakuló izoformája létezik. A hosszabbik - a filamin-240 - egy N-terminális aktinkötő domént tartalmaz, amelyet eddig a petefészek gyűrűcsatornáiban sikerült azonosítani. Kísérleteink kimutatták, hogy ez az izoforma a lamellocytákban is expresszálódik, és valószínűleg szerepet játszik a lamellocyták terminális differenciálódása során az aktinhálózat szervezésében. A filamin-240-nek a lamellocytadifferenciálódásban betöltött szerepét a cher1/cher1 funkcióvesztéses mutánsban vizsgáltuk. Az eredmények azt mutatják, hogy az izoforma hiánya abnormális vérsejtszámot és lamellocytaarányt eredményez, jelezve, hogy a filamin-240 - valószínűleg a sejtváz átrendeződésének szervezőjeként - részt vesz a lamellocytadifferenciálódás szabályozásában.

Expression and a novel function of filamin-240 in lamellocyte development in Drosophila melanogaster

Drosophila has a very effective innate immune system with striking similarities to innate immunity in vertebrates. Cellular immune defense in Drosophila is mediated by three different classes of hemocytes, the plasmatocytes, the lamellocytes and the crystal cells. Lamellocytes represent a unique population of hemocytes, both in terms of morphology and function. They are induced to differentiate upon induction by abnormally developing tissues or parasites and are involved in encapsulation of the tissues recognized as foreign. They develop from small (8-10 micron), round stem cells and become large (40-50 micron) flattened cells capable of binding and encapsulating large foreign particles. The development of lamellocytes from stem cells to effector cells involves two major steps, as presented in last year's Immunological meeting. First, the differentiation of small stem cells to the immediate precursors of the fully differentiated large cells. This step requires cell division and is terminated by the expression of the L1 antigen. Second, the terminal differentiation of the immediate precursors to the large flattened cells. This process does not require cell division but is characterized by expression of L4 and L6 antigen and the most characteristic morphological changes.

In this work we studied the role of a lamellocyte antigen in lamellocyte development, which turned out to be a unique, actin-binding component of the cytoskeleton in lamellocytes. By screening Drosophila cDNA expression libraries with an antibody reacting preferentially with lamellocytes were obtained positive clones and were isolated five DNA fragments. The analysis of the generated sequences showed that these correspond to eight exons of cheerio gene, which encodes filamin, a protein which organize filamentous actin in networks and stress fibers and also, anchor various transmembrane proteins to the active cytoskeleton. It exists in two isoforms in Drosophila, as a result of alternative splicing. The longest form, filamin-240, contains an N-terminal actin-binding domain and so far it has been known to be specific for the ring canals in the ovaries. Our studies revealed that this isoform is expressed in lamellocytes too and is possibly involved in the organisation in the actin-network during the terminal stage of lamellocyte development. To get further insight into the role of filamin-240 in lamellocyte development we studied the possible effect of the lack of this protein in the cher1/cher1 loss of function type mutant stock. The results show that the lack of the isoform results in abnormal number and proportion of developing lamellocytes suggesting that filamin-240 is involved in the regulation of lamellocyte differentiation, perhaps as an organiser of the rearrangement of the cytoskeleton.



66. DN-áz I-aktivitás szisztémás lupus erythematosusos betegek szérumában (P34)
Sallai Krisztina, Nagy Eszter, Gergely Péter
Semmelweis Egyetem, Központi Immunológiai Laboratórium, Budapest

Szisztémás lupus erythematosusban (SLE) meghatározó autoantigén a nukleoszóma, amelynek autoantitestekkel képzett immunkomplexei a betegségre jellemző szövetkárosodás fő okozói. A nukleoszómák lebontását in vivo a dezoxiribonukleáz I (DN-áz I) enzim végzi, az SLE-ben szenvedő betegek szérumában ennek aktivitását csökkentnek írták le. Feltételezhető, hogy a DN-áz I csökkent aktivitása közvetve nukleoszóma és natív DNS elleni antitestek képződését eredményezi. Munkánk során SLE-ben szenvedő betegek szérumában mértük a DN-áz I aktivitását, és vizsgáltuk annak kapcsolatát a betegség aktivitásával, valamint a szervi érintettséggel.

Betegek és módszerek: 190, SLE-ben szenvedő beteg és 50 nem SLE-s kontroll szérumának DN-áz I-aktivitását, antinukleoszóma- és anti-dsDNS-szintjét határoztuk meg, ELISA módszerrel. A betegségaktivitást az erre szolgáló SLEDAI segítségével jellemeztük (SLEDAI: SLE disease activity index, SLE-betegség-aktivitási index).

Eredmények: 1. A DN-áz I enzimaktivitás és veseérintettség kapcsolata: az SLE-s betegek szérumának DN-áz I-aktivitása szignifikánsan kisebb, mint a nem SLE-s kontrolloké. A betegek közt is alacsonyabb enzimaktivitást mértünk a vesebetegségben szenvedő SLE-sek mintáiban, mint a vesekárosodás nélküli betegek esetében. A legkisebb DN-áz I-aktivitást a proliferatív vesebetegséggel küzdő SLE-s csoportban tapasztaltunk. 2. Az antinukleoszóma- és az anti-dsDNS-antitestek szintjei közti korreláció: a két antitest szérumbeli szintje között szoros lineáris korreláció tapasztalható. 3. A DN-áz I enzim aktivitása és a betegségaktivitás kapcsolata: a legalacsonyabb DN-áz I-aktivitást a legmagasabb SLEDAI-értékkel rendelkező betegek mintáiban mértük, az inaktív betegségben szenvedők enzimaktivitásának átlaga nagyobb volt. A DN-áz I aktivitása és a SLEDAI-értékek között negatív korreláció tapasztalható.

A DN-áz I aktivitása tükrözi az SLE aktivitását és bizonyos mértékben a betegség súlyosságát.

DNase I activity in sera of systemic lupus erythematosus (SLE) patients

The dominant autoantigen in SLE is the nucleosome and immune complexes involving nucleosomes are the major cause of tissue damage. Nucleosomes can be broken down in vivo by deoxyribonuclease I (DNase I). DNase I activity was found to be low in patients with SLE. It has been suggested that this low activity may result in the production of antibodies to nucleosomes and native DNA. The aim of this study was to assess DNase I activity in the serum samples of patients with SLE and analyse the relation of it to disease activity and organ involvement.

Patients and methods: Sera of 190 SLE patients and 50 controls were studied. DNase I activity and autoantibodies to nucleosome and dsDNA were measured by enzyme immunoassay. Disease activity was assessed by the SLE disease activity index (SLEDAI).

Results: 1. Relation of DNase activity to renal involvement: in SLE the DNase I activity was significantly lower than that in controls. The activity was lower in patients with kidney involvement than those without renal disease. Patients with proliferative (progressive) renal disease displayed the lowest values of DNase I activity. 2. Correlation between antibodies against dsDNA and nucleodome: the values of titres of antibodies to native DNA run parallel with those of antibodies to nucleosome. 3. Relation of DNase I activity to disease activity: the lowest DNase levels were measured inthe sera of patients with the most active disease (with highest SLEDAI), inactive patients displayed higher activity. There was a negative correlation between DNase activity and SLEDAI score.

Conclusions: DNase I activity reflects SLE disease activity and, to some extent, severity of the disease.



67. A XIII-as faktor A alegységének lehetséges szerepe az Fcgamma- és a komplementreceptor okozta fagocitózisban (E34)
Kávai Mária1, Sárváry Attila2, Szűcs Sándor2, Balogh Imre2, Becsky Áron2, Bárdos Helga2, Seligson Uri3, Egbring Rudolf4, Lopaciuk Stanislaw5, Muszbek László6, Ádány Róza1
Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum,
1III. sz. Belgyógyászati Klinika;
2Megelőző Orvostani Intézet és Népegészségügyi Főiskola,
3Tel Aviv University, Medical Center and Sackler Faculty of Medicine Research Institute of Thrombosis and Hemostasis, Tel Aviv, Izrael;
4Phillips-University of Marburg, Department of Internal Medicine, Marburg, Németország;
5Institute of Hematology, Varsó, Lengyelország;
6Klinikai Biokémiai és Molekuláris Patológiai Intézet, Debrecen

A haemostasisban a XIII-as faktor A alegységének (FXIII-A) tradicionális szerepe mellett celluláris transzglutamináz funkciója is feltételezhető, amennyiben egyes celluláris folyamatokban, így a cytoskeleton átmodellezésében is részt vesz. Ennek a folyamatnak a vizsgálatára munkánkban követtük az FXIII-A változását a receptor okozta fagocitózissal összefüggésben, a monocyta/macrophag sejtekben. Korábban kimutattuk a monocytákban az FXIII-A jelenlétét (Thromb Haem 1988;59:231-5).

Egészséges egyének véréből szeparált monocytákat tenyésztettünk hat napig, követtük a monocyta/macrophag differenciálódást; ennek függvényében mértük az FXIII-A-expressziót, a szuperoxid-anion-termelést, az Fcgamma-receptor (R) kifejeződését és a rajta keresztüli ligand (szenzitizált erithrocyta, EA) kötődését és fagocitózisát, valamint a komplementreceptor (CR3) általi ligand (komplementtel borított élesztőpartikula, C-Y) kötését és fagocitózisát.

Eredményeink szerint az FXIII-A megjelenésével párhuzamosan nőtt az EA és a C-Y kötődése és fagocitózisa, ez a tenyésztés harmadik napján tetőzött. A szuperoxid-anion-termelés már a második napon tetőzött. Úgy az FcgammaR, mint a CR3 által okozott fagocitózist gátolni tudtuk monodansyl-cadaverinnel, ami a transzglutamináz által indukált fehérje-keresztkötést gátolja. FXIII-A-deficiens betegeket hazánkban, valamint Izraelben, Német- és Lengyelországban vizsgálva megállapítottuk, hogy monocytáik EA-, C-Y- és Y-fagocitózisa erősen csökkent.

Mindebből az a következtetés vonható le, hogy az FXIII-A szerepet játszik a monocyták/macrophagok fagocitózisában, így a cytoskeleton átmodellezésében.

Possible role of factor XIII subunit A in Fcgamma and complement receptor mediated phagocytosis

Besides its traditional role in haemostasis factor XIII subjunit A (FXIII-A) is supposed to function as a cellular transglutaminase and be involved in certain intracellular processes including cytosceletal remodeling. In order to investigate its intracellular role, the aim of the present study was to follow changes in FXIII-A production in combination with receptor mediated-phagocytic activities of monocytes/macrophages. Earlier we detected the presence of FXIII-A in human monocytes (Thromb Haem 1988;59:231-5.).

Human blood monocytes were cultured for six days and FXIII-A expression, superoxide anion production, Fcgamma receptor (R) expression, FcgammaR mediated binding and phagocytosis of sensitized erythrocytes (EA), as well as complement receptor 3 (CR3) mediated binding and phagocytosis of complement-coated yeast particles (C-Y) were studied during monocyte/macrophage differentiation.

The binding and phagocytosis of EA and C-Y showed a parallel increase with FXIII-A expression peaked on day 3 of culturing. The superoxide anion production reached the maximum value on day 2. Both the FcgammaR- and CR3-mediated phagocytosis were markedly inhibited in the presence of monodansylcadaverine, an inhibitor of transglutaminase-induced crosslinking of proteins. Monocytes of FXIII-A deficient patients were also examined in Hungary, Israel, Germany and Poland, the phagocytosis of EA, C-Y and Y were found to be strongly diminished.

Our results suggest that FXIII-A plays a role in phagocytic activities of monocytes/macrophages, so in cytoskeletal remodeling.



68. A noradrenalin-visszavétel szerepe a lipopoliszacharid által kiváltott TNF-alfa- és interleukin-10-válaszban (P17)
Selmeczy Zsolt, Szelényi Judit, Vizi E. Szilveszter
MTA, Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézet, Gyógyszerkutatási Osztály, Budapest

Számos érvvel hivatkoznak a gyulladásos mediátorok szerepére a pszichiátriai rendellenességek - például a depresszió - kialakulásában. Emellett alap- és klinikai kutatási adatok szolgáltattak bizonyítékot arra, hogy a monoaminok extracelluláris szintje - amelyet felszabadulásuk és visszavételük egyensúlya határoz meg - szintén szerepet játszik a depresszió patofiziológiájában és kezelésében.

Ebben a munkában a noradrenalin (NE) szerepét tanulmányoztuk a lipopoliszacharid (LPS) által kiváltott tumornekrózisfaktor-a (TNF-alfa) és interleukin-10 (IL-10) válaszban, a monoaminok felszabadulási és visszavételi oldalán genetikailag előállított noradrenalintranszporter-hiányos (NET-KO) egerek esetében és reserpinnel vagy desipraminnal kezelt állatoknál. A felszabadulási oldalon, a noradrenalin csökkent extracelluláris szintjét reserpinkezeléssel értük el, ami a TNF-alfa- és az IL-10-termelést egyaránt fokozta. A NET gén kiütése (NET-KO egerek) a noradrenalin extracelluláris szintjének növekedését eredményezte, s ez a TNF-alfa- és az IL-10-termelés csökkenéséhez vezetett. Modellrendszereinkben - CH-38083 (a-adrenoceptor-antagonista) és propranolol (béta-adrenoceptor-antagonista) alkalmazásával - az alfa- és béta-adrenoceptorok funkcionális épségét mutattuk ki. A vad típusú és a NET-KO egerek akut kezelése desipraminnal - monoamin-felvételt gátló antidepreszszánssal - szignifikánsan csökkentette a TNF-alfa-választ, míg jelentősen növelte az IL-10-termelést, jelezve az intakt NET szerepét az antiinflammatórikus válaszban. A legérdekesebb megfigyelésünk az volt, hogy a NET-KO egerek esetében a desipramin képes volt további csökkenést elérni a TNF-alfa-termelésben, habár ezekből az állatokból hiányzik a NET. Ez a megfigyelés azt sugallja, hogy más monoamin-transzporterek - részben - átvehetik a NET szerepét.

A monoamin- és a gyulladásos rendszer közötti ezen kölcsönhatások magyarázhatják az antidepresszánsok egyidejű terápiás hatékonyságát és immunmodulátoros tulajdonságát.

The role of norepinephrine-reuptake in lipopolysaccharide-evoked tumor necrosis factor-alpha and interleukin-10 response

Some arguments cite the role of inflammatory mediators in the etiology of psychiatric disorders, such as depression. Beside that basic and clinical studies have provided evidence that the biophase level of monoamines, determined by the balance of their release and uptake, is involved in the pathophysiology and treatment of depression.

In this work our aim was to study the role of norepinephrine (NE) in the lipopolysaccharide (LPS) -evoked tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) and interleukin (IL) -10 response both on the monoamine release- and uptake-side in genetically produced NE-transporter deficient (NET-KO) mice and in reserpine or desipramine treated animals. On the release-side, the decreasing biophase level of NE was achieved by reserpine treatment, which increased both TNF-alpha and
IL-10 production. The disruption of the NET gene (NET-KO mice) caused the increasing biophase level of NE, which led to decrease in both TNF-alpha and IL-10 production. Functional input of both alpha- and beta-adrenoceptors could be demonstrated in our model systems, using CH-38083 (alpha-adrenoceptor antagonist) and propranolol (beta-adrenoceptor antagonist). Acute treatment of both wild-type (WT) and NET-KO mice with desipramine, a monoamine uptake-blocker antidepressant, significantly decreased TNF-a response and significantly increased the IL-10 production, indicating the role of intact NET in the anti-inflammatory responses. Our most intriguing observation is that in the NET-KO mice desipramine is able to achieve a further decrease in TNF-alpha production, although the NET is missing in these animals. This observation suggests that other monoamine transporters might take over (partially) the role of NET.

These interactions between the monoamine- and inflammatory-systems might explain the concurrent therapeutical efficacy and immunomodulatory feature of antidepressants.



69. A hematológiai és immunológiai paraméterek változásai splenectomizált és lép-autotranszplantált egerek esetében (E29)
Sipka Sándor jr1, Aleksza Magdolna1, Kulcsár Andrea2, Brát Endre2, Tóth Ferenc1, Furka István1, Mikó Irén1
Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum,
1Kísérletes Sebészeti Intézet,
2III. Sz. Belgyógyászati Klinika, Immunológiai Laboratórium

Háttér és célkitűzés: A splenectomiát követően végzett lép-autotranszplantáció a lépfunkciók megmentésére újonnan bevezetett sebészi eljárás. A Furka-féle lépköténytechnikával a lépdarabkákat a csepleszbe ültetik be. Ezt a módszert már több betegnél alkalmazták traumás lépsérülést követően. A jelen munka célja: 1. a lépköténytechnika kipróbálása beltenyésztett egereken; 2. hematológiai és immunológiai vizsgálatok végzése a) lépirtott, b) autotranszplantált, c) "áloperált" és d) kontrollállatokban.

Módszerek: nőstény Balb/c egerek esetében a lépeltávolítás és az autotranszplantáció - az eredeti lép hatodának visszaültetése - mikrosebészeti technikával. A műtét után nyolc héttel az állatok vérében hematológiai és imunológiai vizsgálatok végzése.

Eredmények: A lép-autotranszplantáció csupán a T-lymphocyták arányának csökkenését tudta mérsékelni a splenectomiához képest, az ellenanyag- (IgM-) és a komplementfaktor- (C3- és C4-) szinteket nem emelte.

Következtetés: A lép-autotranszplantáció pozitív hatású az immunrendszerre, ez azonban inkább az adaptív és nem pedig a "veleszületett" immunválasz folyamatain jut érvényre.

Haematological and immunological changes in slenectomized and spleen-autotransplanted mice

Backround and aims: Spleen-autotransplantation is a new surgical method introduced for the partial restoration of the sleen functions after slenectomy. The slices of spleen are inserted into the omentum majus by the "spleen-nest" technique worked out by dr. I. Furka. This method has been used also in traumatic patients already. The aims of the present work: 1. testing of "spleen-nest" technique in mice, 2. haematological and immunological measurements on a) splenectomized, b) spleen-autotransplanted, c) shame operated and d) control mice.

Methods: splenectomy and spleen-autotransplantation (the insertion of 1/6 part of spleen) by the methods of microsurgery in female Balb/c mice. Haematological and immunological measurements in the peripheral blood of animals eight weeks after the operations.

Results: The spleen-autotransplatation reduced only the decrease in the T cell number compared to splenectomy. It was ineffective to increase the immunoglobulin (IgM) and complement factor (C3 and C4) levels.

Conclusions: Spleen-autotransplantation has some positive effects on the immune systeme. These influences are, however, are mostly related to the adaptive and not to the innate immunity.



70. A Chlamydia pneumoniae-fertőzött gyermekeknél a mannózkötő lektin allélvariációi befolyásolják az asthma kialakulását (E6)
Szalai Csaba1, 2, Nagy Adrienne3, Kozma Gergely Tibor4, Keszei Márton4, Treszl András5, Falus András1, 4
1Heim Pál Kórház;
2MTA-Semmelweis Egyetem, Molekuláris Immunológiai Kutatócsoport;
3Budai Gyermekkórház; Semmelweis Egyetem,
4Genetikai Sejt- és Immunbiológiai Intézet,
5I. Sz. Gyermekklinika, Budapest

Több kutatócsoport írt le kapcsolatot az asthma és a Chlamydia pneumoniae- (C. pneumoniae-) fertőzés között, bár főleg felnőttek esetében találtak összefüggést a tünetek súlyosbodása és a fertőzés között. A C. pneumoniae-fertőzés gyermekeknél játszott szerepéről ellentmondásos eredmények születtek.

Vizsgálatainkban 139 asthmás és 174 kontrollgyermek esetében hasonlítottuk össze a C. pneumoniae-fertőzés előfordulását. Tanulmányoztuk továbbá a C. pneumoniae-fertőzött gyermekek körében a mannózkötő lektin (MBL) különböző allélvariációinak szerepét az asthmára való hajlamban. A C. pneumoniae-antitesteket ELISA-val, az MBL-genotípusokat PCR-RFLP-vel határoztuk meg.

A betegek és az egészséges kontrollok között nem találtunk különbséget sem a C. pneumoniae-fertőzés gyakoriságában, sem az MBL-genotípusok eloszlásában. Azonban az MBL-variáns allélt hordozó asthmás betegek között szignifikánsan több C. pneumoniae-specifikus IgG-pozitív személyt találtunk, mint az MBL-variánst hordozó kontrollok között [63,7%, szemben a 40,7%-kal asthmások, illetve kontrollok esetében; nemre és korra igazított OR (esélyhányados): 2,21 (1,10-4,41); p=0,02]. A további vizsgálatokban megállapítottuk, hogy azoknak a fertőzött gyermekeknek, akik MBL-variáns allélt hordoznak, szignifikánsan nagyobb az esélyük arra, hogy asthmásak legyenek, mint a nem hordozó fertőzötteknek. A kockázat különösen nagynak bizonyult azoknál, akiknél krónikus vagy ismétlődő C. pneumoniae-fertőzés zajlott [pozitív C. pneumoniae-specifikus IgA-ra és IgG-re is; OR: 5,38 (1,75-14,36); p=0,01)], de nem tapasztaltunk kockázat-emelkedést az éppen C. pneumoniae-fertőzésben szenvedő gyermekek esetében (IgM-pozitív). Eredményeink alapján C. pneumoniae-fertőzött gyermekek esetében az MBL allélvariánsai fontos szerepet töltenek be az asthmára való hajlamban.

The development of asthma in children infected with Chlamydia pneumoniae is dependent on the modifying effect of mannose binding lectin

Although several studies found associations between infection with Chlamydia pneumoniae (C. pneumoniae) and asthma, these were mainly restricted to the exacerbation of the symptoms in adults with known asthma. Data about the role of C. pneumoniae in the initiation and development of asthma in children are controversial.

We investigated the role of C. pneumoniae infection in 139 children with asthma comparing them with 174 healthy controls. Furthermore, we studied the modifying effect of mannose-binding lectin (MBL) variant alleles on the susceptibility to asthma in children infected with C. pneumoniae. C. pneumoniae-specific antibodies were measured by ELISA, MBL genotypes were determined by PCR-RFLP.

There were no significant differences in the percentage of children positive for C. pneumoniae-specific antibodies between cases and controls. Among asthmatic children carrying variant MBL alleles there were significantly more patients positive for C. pneumoniae-specific IgG, than among control children with variant MBL genotypes [63.7% versus 40.7% of asthmatic versus control children, respectively; odds ratio (OR adjusted for age and gender): 2.21 (95% CI: 1.10-4.41); p=0.02]. Infected children with variant MBL alleles were found to have a higher risk of developing asthma than infected children with normal MBL genotype. This risk was especially high in children with chronic or recurrent infection [positive for both IgA and IgG; adjusted OR: 5.38 (95% CI: 1.75-14.36); p=0.01)], but no increased risk was seen in children with current C. pneumoniae infection (positive for IgM). This study indicates the important role of variant MBL alleles in the susceptibility to asthma in children infected with C. pneumoniae.



71. A magas C3-szint előrejelzi az atheroscleroticus szövődmények megjelenését coronariabypass-műtét után (E40)
Széplaki Gábor, Prohászka Zoltán, Rugonfalvi Kiss Szabolcs, Füst György, Romics László, Karádi István, Varga Lilian
Semmelweis Egyetem, III. Sz. Belgyógyászati Klinika, Budapest

A C3 szérumkomplement az akut myocardialis infarktus (AMI) rizikófaktora; egészségesek esetében korrelál a testtömegindexszel (BMI), a szérumlipidszintekkel és a vérnyomással. Arra kerestünk választ, hogy coronariabetegeknél is kimutatható-e hasonló összefüggés, s a magas C3-szint prediktív értékű-e.

Kétszázhatvanhat bypassműtéten átesett coronariabeteg (67 nő és 199 férfi) szérumában mértük a C3- (Mancini-módszer), az összkoleszterin-, az LDL-, a HDL-, a triglicerid- és a CRP- (C-reaktív protein) szintet. A betegek 65±5,8 hónapos követésével szereztünk információt az újabb események (halálozás, AMI, stroke- vagy carotisműtét, perifériás érbetegség) fellépéséről.

A szérum-C3-szint szoros korrelációt mutatott a CRP-szinttel (nők: r=0,490, p<0,001, férfiak: r=0,261, p=0,001); férfiaknál a C3-szint a BMI-vel is korrelált (r=0,189, p=0,008). A C3-szint szignifikánsan magasabb volt nők esetében a férfiakéhoz képest [1,48 (1,14-1,79) versus 1,26 (1,08-1,55) p=0,0043; medián (interkvartilis tartomány)]. Férfiaknál a magas C3-szintnél nem bizonyult prediktívnek, viszont a magas C3-szintű (C3ł1,8 g/l) nők körében 16 beteg közül nyolcnál, míg az ennél alacsonyabb C3-szintű 51 nőbetegnél csak 10 esetben jelentkeztek a követési periódus során újabb atheroscleroticus megnyilvánulások (p=0,0249, esélyhányados: 4,1, 95%-os megbízhatósági tartomány: 1,23-13,61). A C3 prediktív értéke korra és a BMI-re egyeztetve is szignifikáns maradt [B: 1,570, S.E.: 0,738, Sig.: 0,033, Exp (B): 4,806, 95%-os megbízhatósági tartomány: 1,132-20,403].

Coronariabypass-műtéten átesett betegek esetében először néztük meg a szérum-C3-szint és a későbbi klinikai események közötti összefüggést; eredményeink szerint a magas C3-szint előrejelzi az atheroscleroticus szövődmények megjelenését ebben a betegcsoportban.

Támogatás: ETT 522/2003; NKFP 1/044/2001/16, ATHERNET EU.

Elevated C3 levels are able to predict the occurance of atherosclerotic complications in patients who underwent coronary bypass surgery

Serum complement C3 is a remarkable risk factor for acute myocardial infarction (AMI), which correlates with body mass index (BMI), lipids and blood pressure in the healthy population. We studied whether the risk factors of patients with severe coronary artery disease (CAD) show the same correlations and does elevated C3 levels predict the later clinical events.

We measured the serum C3, total cholesterol, LDL, HDL, trigliceride and C-reactive protein (CRP) levels of 266 (67 female and 199 male) patients with severe CAD who underwent bypass surgery. Then we followed the patients for 65±5.8 months and recieved information of new events (death, AMI, stroke, carotis surgery or peripherial artery disease).

Serum C3 showed a strong correlation with CRP levels in women and men respectively (r=0.490, p<0.001 and r=0.261, p=0.001) and a significant correlation was found with BMI in men (r=0.189, p=0.008). The C3 levels in women were significantly higher than in men [1.48 (1.14-1.79) versus 1.26 (1.08-1.55) p=0.0043; median (interquartile range)]. In men C3 levels did not have significant predictive value, whereas out of the 16 women with elevated C3 levels (C3ł1.8 g/l) eight patients had atherosclerotic complications during the follow up period, compared to 10 out of 51 women without elevated C3 levels (p=0.0249, OR: 4.1 95% CI: 1.23-13.61). This relation remained significant after adjusting to age and BMI [B: 1.570, S.E.: 0.738, Sig.: 0.033, Exp (B): 4.806, 95% CI: 1.132-20.403].

We studied the relations between serum C3 levels and the clinical events in patients with severe CAD for the first time, and our results suggest that elevated C3 levels are able to predict the complications of atherosclerosis.

Supported by ETT 522/2003; NKFP 1/044/2001/16, ATHERNET EU.



72. Az azbeszt- és a bazaltgyapot-expozíció hatása az MCP-1, a MIP-1alfa képződésére és a redoxrendszer aktivitására, alveolaris macrophagok és 2-es típusú pneumocyták primer kultúrájában (P38)
Tátrai Erzsébet1, Brózik Márta2, Zuzana Kováciková3, Horváth Magdolna1
1Országos Munkahigiénés és Foglalkozás-egészségügyi Intézet;
2Országos Reuma- és Fizioterápiás Intézet, Budapest;
3Ustáv Preventivnej u Klinickej Medyciny, Pozsony, Szlovákia

Mivel az azbeszt humán karcinogén, ezért minden alkalmazási területén helyettesíteni kell az azbeszt hasznos tulajdonságait megőrző, azonban rákkeltő és egyéb káros hatásoktól mentes anyagokkal, mint például bazaltgyapottal, üveggyapottal és egyéb mesterséges rostokkal. Az említett rostok biológiai hatásai nem eléggé ismertek. Munkánkban bazaltgyapot- (japán standard) és UICC krocidolit- (kék azbeszt) expozícióban vizsgáltuk a tüdő alveolaris macrophagjainak és az alveolaris 2-es típusú hámsejtek MCP-1 és MIP-1alfa-képzését, továbbá redoxrendszerük aktivitását, mivel az anyagok hatására bekövetkező lipid-peroxidáció és a proinflammatorikus citokinek felszabadulása között szoros kapcsolatot tételeznek fel. Morfológiai, biokémiai és immunológiai módszereket alkalmaztunk.

Megállapítottuk, hogy az azbeszt 1. a vizsgált sejtekben már a legkisebb alkalmazott dózisnál súlyos membránkárosodást okoz (lektinhisztokémia), 2. csökkenti a redoxrendszer komponenseinek aktivitását [Cu, Zn-szuperoxid-diszmutáz (SOD), glutationperoxidáz, -reduktáz, g-glutamiltranszpeptidáz (GGT)], 3. fokozza mindkét sejtben az MCP-1 és MIP-1alfa képződését.

A bazaltgyapot a nagyobb dózistartományokban hasonló, de kisebb mértékű változásokat indukál. A vizsgált bazaltgyapot - az eredmények alapján - jóval kevésbé toxikus, azonban késői toxikus hatásait (például fibrózis) az in vitro tesztek segítségével nem ítélhetjük meg.

Támogatás: OTKA (T 033007/1999), ETT 2003-2005, NKFP 1/008/2001, FIBRETOX (QLK4 1999-01629).

The effect of asbestos and rockwool fibres on some chemokines and redox system of pulmonary alveolar macrophages and type II pneumocytes

Asbestos fibres are known to pose a carcinogenic hazard to humans therefore their substitution is very important task. The evidence regarding man made mineral fibres, such as rockwool, is a matter of debate. Effects of rockwool (Japanese standard) and UICC crocidolite at different concentrations on the primary culture of pulmonary alveolar macrophages (AM) and pneumocytes type II from rat lungs are revealed and compared: 1. their effect on the production of MIP-1a and MCP-1; 2. their impact on the membranes of the above cells; 3. their influence on redox system of these cells, since close connections are presumed betwwen the production of proinflammatory proteins and the release of free radicals. Immunological (ELISA), morphological (lectin histochemistry) and biochemical methods were applied.

Results: 1. All two fibres significantly increased the production of MIP-1a and MCP-1 although different degree. 2. Crocidolite resulted in membrane damage at the lowest concentration (1 mg.mL-1) while rockwool caused injury at medium concentration (5 mg.mL-1) in the membranes of alveolar macrophages and type II cells. 3. Crocidolite seriously decreased the activity of Cu/Zn-superoxide dismutase (SOD), c-glutamyl transferase (GGT), glutathione reductase, glutathione peroxidase causing imbalance of redox system in macrophages and pneumocytes. Rockwool decreased the activity of GGT and Cu/Zn-SOD especially in macrophages. Though this in vitro study provided useful insight the toxicity of the above fibres, especially rockwool, but we can not draw conclusions how to respond the intact pulmonary tissue on the exposure to these fibres, exclusively based on in vitro tests.

Supported by the Hungarian Scientific Research Fund (OTKA, T 033007/1999), Medical Research Council (ETT 2003-2005), National Research and Development Programme (NKFP 1/008/2001), FIBRETOX (QLK4-1999-01629).



73. Rheumatoid arthritises betegek szérumában és synovialis folyadékában kimutatott antifilaggrin autoantitestek peptidfelismerő mintázatának vizsgálata citrullin tartalmú szintetikus peptidek alkalmazásával (P33)
Tóbi Rita1, Brózik Márta2, Magyar Anna1, Szakonyi József3, Palkonyai Éva2, Bálint Géza2, Balogh Zsolt2, Polgár Anna2, Hudecz Ferenc1, Gergely Péter3, Merétey Katalin2
1MTA, Eötvös Loránd Tudományegyetem, Peptidkémiai Kutatócsoport;
2Országos Reumatológiai és Fizioterápiás Intézet;
3Semmelweis Egyetem, Központi Immunológiai Laboratórium, Budapest

Mai ismereteink szerint az antifilaggrin ellenanyagok családjába azokat az autoantitesteket soroljuk, amelyek citrullin tartalmú antigénepitópokat ismernek fel. Ezek az ellenanyagok jellegzetesen nagy mennyiségben fordulnak elő rheumatoid arthritises betegek szérumában; kimutatásuk 96-99%-os specificitással erősítheti meg a betegség diagnózisát. A termelődésüket kiváltó pontos mechanizmus nem ismert, igazolták azonban, hogy az antigénstimulus helye a synovium lehet, ahol a gyulladásos folyamatok során deiminálódó - citrullinná átalakult arginint tartalmazó - fibrin ellenanyag-termelődést válthat ki.

Munkánkban rheumatoid arthritises betegek szérumában és synovialis folyadékában termelődő antifilaggrin ellenanyagok epitópfelismerő mintázatát vizsgáltuk, szintetikus citrullin tartalmú peptidek alkalmazásával. A humán filaggrinfehérje
argininben gazdag aminosav-szekvenciáját (306-324) alapul véve készítettünk peptidvariánsokat, ezekben a különböző pozícióban lévő arginineket szisztematikusan citrullinnal helyettesítettük. A továbbiakban elkészítettük a peptid N- és C-terminális felől rövidített változatait is, valamint egy 14 tagú peptidszakaszt, amelyben az összes arginint citrullinnal helyettesítettük. Kontrollantigénként két, citrullint nem tartalmazó peptidszekvenciát készítettünk - egy 14 és egy 5 tagból állót -, bennük az arginin eredeti pozícióban fordult elő. Az elkészített 19 különböző szekvenciavariáns alkalmazásával rheumatoid arthritises (RA) betegek (n=25) szérumában és synovialis folyadékában lévő, IgG típusú antitestek reaktivitását vizsgáltuk. Az egyes peptidek RA-szenzitivitását egészséges véradók mintáinak meghatározása alapján számítottuk ki.

A peptidek szenzitivitása között jelentős különbségeket találtunk (5-68%); ez alátámasztja előző vizsgálataink adatait, miszerint a citrullin környezetében lévő aminosavak jellege fontos szerepet tölt be az antigénepitóp kialakulásában.

A továbbiakban azonos betegtől származó szérum- és synovialisfolyadék-mintákban vizsgáltuk és hasonlítottuk össze az ellenanyagok peptidfelismerő mintázatát a 19 különböző szekvencia alkalmazásával. A legtöbb beteg esetén a szérum és a synovialis folyadék IgG típusú ellenanyaga hasonló mintázatot adott. A rövidített peptidvariánsok esetén a szérum és a synovialis IgG a reaktivitás tekintetében heterogénebb képet mutatott. A vizsgálati adatok statisztikai elemzése folyamatban van, ennek segítségével igazolni kívánjuk, hogy a különböző peptidekkel reagáló synovialis és szérum-IgG-k azonos ellenanyag-populációt képviselnek-e. Ezek az eredmények adatokat szolgáltathatnak az antifilaggrin ellenanyagok eredetéről.

Támogatás: OTKA T 037876.

Investigation of the reactivity patterns of antifilaggrin antibodies in sera and synovial fluids from patients with rheumatoid arthritis using citrullinated synthetic peptides

Antifilaggrin antibodies comprise a heterogeneous population of antibodies directed to citrullinated proteins. Their production is highly specific for rheumatoid arthritis (RA). Recent studies have shown that the site of the initial antigenic trigger where these autoantibodies are produced is localised to the inflamed synovial tissue. The aim of our study was to screen and compare the reactivity and specificity of antibodies in sera and synovial fluids towards different citrullinated peptides.

Arginine rich peptide sequence corresponding to human profilaggrin (amino acid residues 306-324) and sequences with citrulline substitution at different positions were synthetised by mutipin peptide synthesis on solid supports. Shortened versions of that peptide were also produced by removal of amino acid residues from its N- and C-terminal as well. Completely citrullinated variant of the 14 amino acid (aa) long peptide was also prepared. Peptides with no citrulline replacement were used as control antigens. The reactivity of these peptides with IgG in sera (n=25) and synovial fluids of RA patients were determined. The sensitivity for RA of the individual epitopes was calculated using the results of sera of healthy controls (n=15).

Among the 19 sequence variants tested we found statistically different variations in their sensitivity for RA (from 5.0% up to 68%), reflecting our previous results that the surrounding amino acids play important role in creation of autoantigenic epitope.

Further we tested the reactivity of IgG in paired serum and synovial fluids. In most cases we found that the peptide recognition and reactivity pattern of serum and synovial IgG from the same individuals was similar. We used statistical analysis to test whether IgG in serum and synovial fluid comprise the same autoantibody population. These results may support further evidence of the synovial origin of this group of autoantibodies.

Supported by the Hungarian grant OTKA T037876.



74. A DN-áz-aktivitás csökkenése és a nukleoszóma elleni ellenanyag előfordulásának kapcsolata SLE-s betegek szérumában (E41)
Tumpek Judit, Kiss Emese, Sipka Sándor, Szegedi Gyula
Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum, III. Sz. Belgyógyászati Klinika

Háttér: A szisztémás lupus erythematosus (SLE) patomechanizmusának egyik tényezője az apoptotikus sejtekből származó DNS-protein komplexek, nukleoszómák kóros eltakarítása, ebben - többek között - a szérum DN-áz I csökkent aktivitása játszhat szerepet.

Cél: Összefüggést kerestünk a DN-áz aktivitásának csökkenése és a nukleoszóma elleni ellenanyag pozitivitása között, SLE-s betegek szérumában.

Betegek: 45 SLE-ben szenvedő beteg, 13 egyéb autoimmun betegségben (MCTD, NDC, Sjögren-szindróma) szenvedő és 17 egészséges kontrollszemély.

Módszerek: A DN-áz-aktivitás-csökkenést ELISA módszerrel (ORGENTEC), a nukleoszóma elleni ellenanyagot ELISA módszerrel (INOVA) mértük.

Eredmények: A nukleoszóma elleni ellenanyag mennyisége a nem SLE-s, autoimmun betegségben szenvedők esetében kis mértékben, az SLE-s betegek esetében pedig erősen szignifikánsan emelkedett. Ezzel szemben a DN-áz-aktivitás csökkenését csak az SLE-s betegek esetében tapasztaltuk, ahol az antinukleoszóma-ellenanyag és a DN-áz-aktivitás-csökkenés közepes mértékű volt, de szignifikáns korrelációt mutatott egymással. Ugyanakkor nem találtunk egymáshoz viszonyított különbséget a lupus nephritisre pozitív és negatív SLE-s betegek között.

Következtetés: SLE-s betegek szérumában pozitív korreláció áll fenn a DN-áz-aktivitás csökkenése és az antinukleoszóma-ellenanyag megjelenése között. Ugyanakkor a DN-áz-aktivitás csökkenése SLE-specifikus jelenségnek tűnik, míg a nukleoszóma elleni ellenanyag pozitivitása egyéb autoimmun kórképhez is társulhat.

Linkage between the decreased DN-ase activity and the antinucleosome antibody positivity in sera of patients with SLE

Background: In the pathomechanism of SLE the decreased clearance of DNA-protein complexes derived from apoptotic bodies can play a role. In this phenomenon the decreased activity of DN-ase in serum can be one of the factors.

Aim: To find a linkage between the decreased DN-ase activity and the anti-nucleosome antibody positivity in sera of SLE paients.

Patients: 45 SLE, 13 other autoimmune patiens included MCTD, NDC and Sjögren's syndrome, and 17 healthy control subjects.

Methods: Measurement of the decrease of DN-ase activity by ELISA (ORGENTEC), measurement of antinucleosoma antibody by ELISA (INOVA).

Results: In patients with autoimmune diseases of non-SLE type, the antinucleosome antibody positivity was found slighty but significantly elevated. The increase in antinucleosome antibody positivity was strongly significant in the patients with SLE. On the other hand, the decreased DN-ase activity could be observed only in the SLE patients. There was a medium sized but significant correlation between the occurence of antinucleosome antibody positivity and DN-ase activity decrease in the sera of SLE patients, but this correlation was independent of the lupus nephritis positivity or negativity of the patients.

Conclusion: There was some positive correlation between the appearance of antinucleosome antibody positivity and the decrease in DN-ase activity in sera of SLE patients. The decreased DN-ase activity, however, seemed to be a SLE specific marker, whereas the antinucleosome antibodies occured in other autoimmune diseases, out of SLE.



75. A stresszválasz és az akutfázis-reakció közötti párbeszéd molekuláris háttere (E7)
Udvarnoki Katalin1, Cervenak László1, 2, Füst György1, 2, Larry A. Potempa3, Prohászka Zoltán1, 2
1Semmelweis Egyetem, ÁOK, III. Sz. Belgyógyászati Klinika;
2Semmelweis Egyetem-MTA, Anyagcsere és Atherosclerosis Kutatócsoport, Budapest;
3ImmTech, Vernon Hills, IL, USA

A szervezet válasza egy őt ért inzultusra sokrétű; a védekezés érdekében több folyamat is beindul egymás mellett és egymással kölcsönhatásban. Ilyen általános védekezési folyamatok a szervezet és a sejtek stresszválasza, ez szorosan karöltve zajlik az immunrendszer aktiválásával és a felismerési folyamatok beindulásával. A szervezeti akutfázis-reakció beindulása biztosítja a gyulladásos folyamat lefékeződését, megnyugvását és a gyógyuláshoz vezető folyamatok aktiválását.

Munkánkban a stresszválasz és az akutfázis-reakció közötti molekuláris párbeszéd mechanizmusait vizsgáltuk; ennek során az egyik fő stresszfehérjét, a 60 kD-os hősokkfehérjét (Hsp60) és egy klasszikus akutfázis-fehérjét, a C-reaktív fehérjét elemeztük. Vizsgálatainkat ELISA rendszerben végeztük, tisztított vagy rekombináns fehérjék és specifikus antitestek segítségével.

A CRP komplementet aktiválni nem képes formája (natív CRP) a keringésben kimutatható, pentamer struktúrájú korong. A károsodott szöveti elemeken megjelenő ligandjaihoz való kötődés után a komplementrendszer első komponensének (C1q) megkötésére és aktiválására képes struktúrák jelennek meg a korong egyik felszínén. A CRP-nek ismert egy módosult formája is (mCRP), amelyet alegységeire bomlott pentamerstruktúra, megváltozott ligandkötő-képesség és jellegzetes epitópszerkezet jellemez.

Eredményeink arra utalnak, hogy a natív CRP nem, azonban a módosult CRP képes a humán Hsp60-at mint ligandot felismerni. A Mycobacterium bovis-Hsp65 fehérje is képes kötni az mCRP-t. Mindkét fehérje esetén dózisfüggő és gátolható összefüggést tapasztaltunk.

Ma még nem ismertek pontosan azok a hatások, amelyek a CRP korongstruktúrájának felbomlásához és a neoepitópok megjelenéséhez vezetnek. Az eddigi adatok azonban arra utalnak, hogy a natív CRP-, a ligandhoz kötött CRP- és a módosult CRP-molekulák egységes folyamat állomásait képezik. Eredményeink hozzájárulhatnak ennek a folyamatnak a megismeréséhez és a CRP biológiai funkcióinak alaposabb megértéséhez.

Molecular discussion between the stress response and the acute phase reaction

In response to different noxas the organism initiates multiple processes of parallel and interacting nature. An example for these protective processes is provided by the stress response of the cells and the organism which is accompanied by the activation of the immune system and the immune recognition process. The downregulation of the inflammation and reconstitution thereafter is mainly a result of activation of acute phase reaction.

The purpose of our study was to analyze the molecular discussion between stress response and acute phase reaction. To achieve this goal the interaction between the major stress protein, heat-shock protein 60 (Hsp60), and a classical acute phase reactant, C-reactive protein (CRP), was studied. We used solid phase ELISA system, recombinant or purified proteins and specific antibodies during the experiments.

The pentameric disc form of CRP ("native") in the circulation does not activate complement unless bound to its ligands on damaged cells or tissues. After fixation of CRP to the ligands binding sites for the first component (C1q) of the classical pathway are presented on the molecule resulting in the activation of the complement cascade. The modified form of CRP is less known and is characterized by loss of pentameric symmetry, different ligand binding property and neo-epitope structure.

Our results indicate that modification of CRP (either chemical or genetic engineering) results in an ability of CRP to bind to human Hsp60. Furthermore, the modified CRP binds to Hsp65 of Mycobacterium bovis, as well. However, the native form of the molecule does not recognize any of the Hsp. The binding of mCRP to Hsp is dose-dependent and can be competitively inhibited by free Hsp.

The effects resulting in the loss of pentameric symmetry and the appearance of new binding properties and epitopes of CRP are not well understood today. The accumulated knowledge indicates that the native CRP, the ligand-bound CRP and the modified CRP are different stops along the same process. Our results provide further data about this process and may help to understand the biological functions of CRP in more depth.



76. Különböző eredetű egérmacrophagok funkcionális összehasonlítása (P19)
Uzonyi Barbara1, 2, László Glória1, Prechl József1, Tóth Sára2, Erdei Anna1
1Eötvös Loránd Tudományegyetem, Immunológiai Tanszék;
2Semmelweis Egyetem, Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet, Budapest

A kórokozókkal szembeni hatékony védelemben az adaptív immunrendszer specifikus válasza mellett alapvető szerepet játszanak a természetes immunrendszer sejtjei és szolúbilis elemei. A macrophagoknak - a kórokozók fagocitózisa, intracelluláris elpusztítása és az immunválaszt szabályozó citokinek szekréciója mellett - a komplementtermelő, valamint antigénprezentáló képessége is elengedhetetlen a természetes és adaptív immunválasz szoros együttműködésében. A macrophagok a mikrokörnyezetből érkező jelektől függően kétféle aktivált fenotípust (M1 és M2) mutatnak. Az M1, illetve M2 irányba polarizálódott sejtek különböznek citokinszekréciójukban (IL-12, illetve IL-10), enzimexpressziójukban (iNOS, illetve argináz), sejtfelszíni molekulamintázatukban (Fcgamma-receptorok, illetve FcepszilonRII). A humán macrophagokon bizonyított a CR1 jelenléte, ezzel szemben az egérmacrophagok CR1/2-expressziója még mindig nem tisztázott.

Vizsgálatunkban különböző eredetű egérmacrophagokat jellemeztünk funkcionálisan és fenotípusukban. Kísérleteinkben monocyta/macrophag eredetű sejtvonalakat (J774A.1, P388D1, RAW264.7, WEHI-3), különbözőképpen kezelt egerekből izolált peritonealis macrophagokat és csontvelőből, illetve embrionális őssejtvonalakból differenciáltatott sejteket használtunk. Többféle stimulus esetében (LPS, IFNgamma, IL-4, anti-CR1/2, anti-FcgammaR) vizsgáltuk a sejtfelszíni molekulák (CR-ek, FcR-ek, MHCII, B7-1, B7-2) expressziójára, a C3-szintézisre, az NO-termelésre, a citokinszekrécióra és a T-sejt-aktiváló képességre gyakorolt hatást.

Kísérleteink eredményei szerint a peritonealis macrophagok, a csontvelőből M-CSF-fel differenciáltatott macrophagok és néhány sejtvonal felszínén (7G6 és 8C12 monoklonális ellenanyagokkal) kimutatható a CR1/2. Eredményeink azt mutatják, hogy a különböző stimulusok más-más változást indukálnak, amelyek összhangban állnak a macrophag fenotípusával. A C3-termelés növekedésével, amely az M2-es fenotípusra jellemző, fokozódott a sejtek T-sejt-aktiváló képessége.

Functional comparison of murine macrophages derived from various sources

Macrophages are known to play an important role both in uptake and destruction of pathogens and also in regulation of pro- and anti-inflammatory responses. These phagocytes represent an extremely heterogeneous cell-population and depending on their microenvironmental signals they can be polarized (M1 versus M2) reflected by their cytokine-secretion (e.g. IL-12 versus IL-10), enzyme-expression (e.g. iNOS versus arginase), and cell surface receptors (FcgRs versus FceRII). Macrophages are also known to produce and cleave complement C3, leading to regulation of various cellular functions, including antigen presentation. While human macrophages are known to express complement receptor type 1 (CR1), expression of CR1/2 by murine macrophages is still controversial.

Our aim was to phenotypically and functionally characterize mouse macrophages of different origin. In addition to various cell lines (J774A.1, P388D1, RAW264.7, WEHI-3), peritoneal macrophages, and macrophages differentiated from either bone marrow or embryonic stem cell lines were studied. After various stimuli (such as LPS, IFNg, IL-4, anti-CR1/2 and anti-FcgR) the following features were compared: expression of CRs, FcRs, MHCII, B7-1 and B7-2; synthesis of C3; production of NO; secretion of various cytokines; T-cell activating capacity.

We report here that peritoneal macrophages, cells differentiated from bone marrow by M-CSF, and some of the cell lines tested express CR1/2 (detected using mAb 7G6 and 8C12) in contrast to cells differentiated from bone marrow by GM-CSF+IL-4+IL-3, and some cell lines. We also found that various stimuli induce different functions, correlating to the phenotype of the macrophages - i.e. production of complement C3 is demonstrated to parallel the cells' T-cell activating capacity, which is related to the M2 phenotype.



77. A C1q elleni antitestek vizsgálata hereditaer angioneuroticus oedemás betegek szérumában (E42)
Varga Lilian1, Kollár Tímea1, Visy Beáta2, Németh Éva1, Fekete Béla1, Harmat György2, Füst György1, Farkas Henriette1
1Semmelweis Egyetem, III. Sz. Belgyógyászati Klinika;
2Fővárosi Önkormányzat Madarász utcai Gyermekkórház és Rendelőintézet, Budapest

A hereditaer angioneuroticus oedema (HANO) kórképet hipokomplementémia jellemzi, mert a C1-inhibitor örökletes hiánya miatt a C4 és a C2 elfogy, bár a C1-szint többnyire normális. A klasszikus reakcióút csökkent működése az autoimmun betegségek kialakulásának oka és következménye is lehet; a C1-inhibitor-hiány is gyakran társul SLE-vel. A komplementrendszer működését a komplementfehérjék ellen termelődött antitestek is befolyásolhatják. Az SLE-s betegek harmadánál veseszövődmény kialakulására utaló, C1q elleni autoantitestek detektálhatók. Korábban a HANO-s betegek egy részénél emelkedett szintű C1-inhibitor elleni antitesteket találtunk, és e betegeknél a HANO-s rohamok gyakoribbak és súlyosabbak voltak.

Munkánk során azt vizsgáltuk, hogy az Országos Angiooedema Centrumban gondozott HANO-s betegek szérumaiban milyen gyakorisággal fordulnak elő kórosan magas titerű C1q elleni autoantitestek, illetve ezeknek az antitesteknek van-e hatása a betegek komplementstátusára és klinikai paramétereire (oedemás rohamok súlyossága, veseszövődmény, autoimmunitás előfordulása).

A 2001 óta folyó követéses vizsgálat során a 95 HANO-s beteg közül 15 betegnél detektáltunk kórosan magas anti-C1q-szintet. Ez magasabb, mint az egészséges populációban való előfordulás (19/95; 16,8% versus 5/241, 2,1%; p<0,0001). Az anti-C1q antitestek jelenléte nem függött öszsze sem a betegek szérumaiban mérhető komplementparaméterek szintjével, sem a C1-inhibitor elleni antitestek előfordulásával. Ellentétben az anti-C1-inhibitor antitestekkel, az anti-C1q antitestek megjelenése nem korrelált az oedemás rohamok súlyosságával és gyakoriságával sem. Bár 7/15 beteg esetében különböző típusú, alacsony szintű autoantitest-titereket (ANA, RF) detektáltunk, a betegek között sem manifeszt autoimmun beteg, sem vesebeteg nem fordult elő. A C1q elleni antitestek klinikai szerepe még nem világos HANO-ban, gyakoribb előfordulásuk szükségessé teszik a betegek nyomonkövetését autoimmun, illetve veseszövődmény irányában.

Támogatás: ETT 522/2003, ETT 194/2003.

Autoantibodies against C1q in hereditary angioedema

Hypocomplementemia is a characteristic feature in hereditary angioedema (HAE) as a consequence of inherited C1 inhibitor deficiency, C4 and C2 complement components are consumed, while the level of C1 is usually normal. Reduced function of the classical pathway can be either a reason for or an outcome of the development of autoimmune diseases. Deficiency of C1 inhibitor is frequently associated with SLE. Autoantibodies binding specifically to complement proteins can also modify the function of complement. One third of patients with SLE develop antibodies against C1q and these antibodies have prognostic value on renal diseases. Previously elevated level of anti-C1 inhibitor antibodies were found in the sera of patients with HAE, and presence of anti-C1 inhibitor is correlated with the frequency and severity of edematous attacks.

Our aim was to study the frequency of anti-C1q antibodies present in the sera of 95 patients with HAE followed up at the Outpatient Clinic of National Angioedema Centre and to analyze the correlation between complement (the levels of CH50 C1q, C4, C1 inhibitor in sera) or clinical (severity of HAE symptoms, development of autoimmunity, renal diseases) status.

Since 2001 in a prospective study we detected anti-C1q (IgG) antibodies more frequently in patients with HAE than in healthy subjects (15/95; 16.8% versus 5/241; 2.1%; p<0.0001). The presence of anti-C1q antibodies does not correlate either with the level of complement proteins or with the presence of anti-C1 inhibitor antibodies. In contrast to patients with elevated anti-C1-inhibitor titers patients with elevated anti-C1q titers had no more severe clinical symptoms than those without anti-C1q. Although in 7/15 patients developed low titers of autoantibodies (ANA, RF) none of these patients have showed clinical symptoms of autoimmune or renal diseases. However the clinical value of antibodies against C1q has not proven in HAE, significantly higher occurrence may indicate autoimmune or renal involvement and following up of the patients is suggested.

Supported by ETT 522/2003, ETT 194/2003.



78. A TNF-alfa-polimorfizmus vizsgálata tumoros betegeink között (E19)
Vatay Ágnes, Tóth Éva Katalin, Laki Judit, Kocsis Judit, Prohászka Zoltán, Karádi István, Füst György
Semmelweis Egyetem, III. Sz. Belgyógyászati Klinika, Budapest

Cél: Ismert, hogy a TNF-a jelentős szerepet játszik a tumorellenes immunitás szabályozásában. Ugyanakkor ellentmondásosak a TNF-alfa-expresszió és a daganatok kialakulása, illetve progressziója közötti összefüggésre vonatkozó adatok. Tumoros betegeink között két olyan TNF-alfa-promóter-polimorfizmust vizsgáltunk, amelyek befolyásolják a TNF-alfa-expresszió mértékét.

Módszerek: A TNF-alfa -238-as és -308-as pozícióban lévő polimorfizmusát 84 tumoros és 138 kontroll egészséges egyén DNS-mintájában vizsgáltuk. A betegek átlagos életkora 63,2±4,1 év volt. A daganatok megoszlása a következő volt: 53 colorectalis, nyolc emlő-, hét gyomor-, négy epeút- és 12 egyéb tumor.

Eredmények: A -238-as pozícióban lévő polimorfizmus esetében a variáns A allél szignifikánsan gyakrabban fordult elő a daganatos betegségben szenvedő egyéneknél (0,071), mint az egészséges kontrollegyéneknél (0,018, p=0,0085). A -308-as pozícióban lévő polimorfizmust vizsgálva nem találtunk szignifikáns különbséget a két csoport között az allélfrekvencia tekintetében.

Következtetések: Az irodalmi adatok szerint a -238-as pozícióban lévő vad allél (G) nagyobb TNF-alfa-expresszióval jár, míg a variáns A allél jelenléte csökkent TNF-alfa-expresszióhoz vezet. További vizsgálatok szükségesek annak tisztázására, hogy ez a genetikai variáció milyen összefüggésben áll az egyes daganatos megbetegedések kialakulásával.

The relationship between the TNFalpha promoter polymorphism and malignant diseases

Aims/hypothesis: The TNFalpha plays an important role in the regulation of antitumour immunity. The aim of the study was to determine the prevalence of the tumour necrosis factor a (TNF alpha) promoter polymorphisms at position -238 and -308 in malignant diseases and healthy population.

Methods: The TNFalpha promoter polymorphisms were determined by PCR-RFLP method. Samples of 84 patients with malignant diseases and 138 Healthy Hungarian volunteers were examined. The mean age was 63.2±4.1 years in the patient group, while 41.2±2.1 years in the control group. In the patient group 53 colorectal, eight breast, seven stomach, four biliary tract cancers were registered, and 12 had other types of tumours.

Results: The G => A substitution at position -238 (designated the TNFA allele) was significantly more frequent among patients with malignant diseases (0.071) compared to the control population (0.018, p=0.0085). No difference in the G => A substitution at position -308 was observed.

Conclusion: The increased frequency of the TNFA allele (known to be associated with decreased TNFalpha expression) in malignant diseases could be one of the factors which contribute to the pathogenesis of antitumor immunity. Further studies are required to show the validity of this relationship.



79. A GL7- (Ly77-) specifikus ellenanyag egy szialidázérzékeny epitópot ismer fel (P20)
Weiszhár Zsóka, Pozsgai Mónika, Prechl József, László Glória
Eötvös Loránd Tudományegyetem, Immunológiai Tanszék, Budapest

A GL7 molekulát eredetileg egy 35 kDa molekulatömegű, az egér in vitro aktivált B- és T-lymphocytáin megjelenő, aktivációs antigénként írták le. A molekula differenciált jelenléte kimutatható mind a B-sejt-fejlődés egyes stádiumaiban, a csontvelőben, mind a thymocyták egyes alpopulációin. Az anti-GL7 és a PNA azonos kötődést mutat a lépben és a nyirokcsomókban, de a csontvelőben nem fed át a két antigén jelenléte. A lymphocyták fejlődése és aktiválódása során talált GL7-mintázat és a felismerő ellenanyag IgM izotípusa alapján felmerült az epitóp szénhidráttermészete és adhéziós szerepe.

Az itt bemutatott kísérletekben egyrészt összefüggést kerestünk a GL7 és más, az adhéziós, illetve aktiválódási folyamatokban szerepet játszó molekulák sejtfelszíni expressziója között, másrészt vizsgáltuk az epitóp kémiai természetét.

A vizsgálatok során különböző eredetű (B-, T- és monocyta-macrophag) sejtvonalakon, valamint in vitro aktivált lépsejteken néztük a GL7 mellett a CD11a-, -b-, -c-, CD18-, CD24-, CD43-, CD44-, CD45-, CD49d-, CD62L-, CD80-, CD86-, CD138-, PNA-, hialuronsav- és P-szelektin-epitóp jelenlétét.

A lymphoid és a monocyta eredetű sejteken kimutatható GL7-et immunprecipitációs módszerrel azonos molekulatömegűnek találtuk. A tunikamicinkezelés vagy a szialidázzal végzett emésztés valamennyi vizsgált sejttípus esetében eltüntette az anti-GL7 ellenanyagunk által felismert epitópot.

GL7 (Ly77) specific antibody recognizes a sialidase sensitive epitope

GL7, a 35 kDa activation antigen was originally described on activated mouse spleen B- and T-cells. Differential expression of GL7 has been shown during T-cell development and also following B-cell development in the bone marrow. The staining pattern for GL7 and PNA has been found to be similar in the lymph nodes but not in the bone marrow. The carbohydrate nature and the possible role in adhesion of the epitope is suggested based on the staining pattern and the IgM isotype of the recognizing antibody.

The aim of this study was to find correlations between the expression of GL7 and other mouse lymphocyte markers playing a role in activation or/and adhesion and to get some information about the chemical nature of the epitope.

Cell lines of various origin (mouse B, T, monocyte-macrophage) and also in vitro activated spleen cells were stained for CD11a, -b, -c, CD18, CD24, CD43, CD44, CD45, CD49d, CD62L, CD80, CD86, CD138, PNA, hyaluronan and P-selectin epitope in correlation with lineage markers and GL7 expression.

Immunoprecipitation of GL7 from lymphoid or monocyte cell lines revealed identical molecular weight. GL7 epitope could be removed of all types of cells by sialidase and also by tunikamycin treatment showing that sialic acid residues might be involved in the antibody binding site.



80. A Max és az NFkappaB szinergisztikusan indukálja a FasL-promótert humán, nem kissejtes tüdőráksejtekben (E27)
Wiener Zoltán1, Edgar Ontsouka2, Ralph Torgler2, Falus András1, 3, Thomas Brunner2
1Semmelweis Egyetem, ÁOK, Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet, Budapest;
2Institut für Pathologie, Bern, Svájc,
3MTA-Semmelweis Egyetem, Molekuláris Immunológiai Kutatócsoport, Budapest

A Fas (CD95/APO-1) ligand a TNF-család egyik tagja; főleg az aktivált T-sejteken expresszálódik, apoptózist indukáló képessége által a célsejtek elpusztításának egyik fő mechanizmusát biztosítja. A T-sejtek aktiválódása során megjelenő FasL-expresszió különböző transzkripciós faktorok, köztük az NFkappaB és a c-Myc/Max szigorú szabályozása alatt áll. A c-Myc protoonkogén; tumorokban gyakran amplifikálódik, befolyásolja a sejtproliferációt kontrolláló géneket, és hatását a Max-szel alkotott heterodimeren keresztül fejti ki. Bár a FasL jelenlétét bizonyos tumortípusokban is kimutatták, tumorbeli expressziójának szabályozásáról keveset tudunk. Kísérleteinkben a FasL-promóter indukciójának szabályozását vizsgáltuk két humán tüdőráksejtvonalban.

Eredményeink szerint 1. a FasL-promóter alapaktivitása humán, nem kissejtes tüdőráksejtekben nem növelhető a c-Myc túlzott mértékű expresszáltatásával; 2. a Max túlzott mértékű expresszáltatása a spontán promóteraktivitás növekedését eredményezte, valamint szinergisztikusan serkentette a doxorubicin és a forbolészter által indukált, NFkappaB által közvetített promóteraktivitást; 3. eredményeinket az endogén FasL-expresszió vizsgálata is megerősítette.

Vizsgálataink szerint a Max magas szintje és az NFkB indukciója a FasL megnövekedett expressziós szintjéhez vezet humán tüdőráksejtekben, ami a Fas-sal való kölcsönhatás által apoptózist idézhet elő.

Synergistic induction of the Fas ligand promoter by Max and NFkappaB in human non-small lung cancer cells

Fas (CD95/APO-1) ligand is a member of the tumor necrosis factor family and a potent inducer of apoptosis. Fas ligand is expressed in activated T cells and represents a major cytotoxic effector mechanism by which T cells kill their target cells. Activation-induced Fas ligand expression in T cells is under the stringent control of various transcription factors, including nuclear factor kappaB (NFkappaB) and c-Myc/Max. c-Myc is a proto-oncogene, which is often amplified in tumors. Together with its heterodimerization partner Max, c-Myc forms a transcription factor complex and mediates its tumor-promoting properties through the induction of growth control genes. There is accumulating evidence that Fas ligand is also expressed by various tumor cells, however, little is known regarding Fas ligand regulation in tumor cells.

In this study, we have analyzed the regulation of the Fas ligand gene promoter induction in two non-small cell lung cancer cell lines, with a major focus on the role of the c-Myc/Max transcription factors. Our results revealed that inhibition of c-Myc/Max did not reduce basal levels of Fas ligand promoter activity, nor did overexpression of c-Myc significantly enhance basal promoter activity. In contrast, we have found that overexpression of Max resulted in a marked increase in spontaneous promoter activity and synergistically enhanced phorbolester- and doxorubicin-induced NFkappaB-mediated Fas ligand promoter activity. These results were confirmed by analyzing endogenous Fas ligand transcription. We conclude that high levels of Max and stress-induced NFkappaB activation may result in elevated expression of Fas ligand in human lung cancer cells and its binding to Fas may initiate apoptosis.



81. A párosujjú IgD - a hiányzó láncszem (E15)
Zhao Yaofeng1, Kacskovics Imre1, 2, Pan-Hammarström Qiang1, Liberles David A.3, Geli János1, 2, Rabbani Hodjattallah4, Hammarström Lennart1
1Karolinska Institute, Department of Bioscience at Novum, Center for Biotechnology and Center for Oral Biology, Stockholm, Svédország;
2University of Veterinary Science, Department of Physiology and Biochemistry, Budapest;
3Stockholm University, Department of Biochemistry and Biophysics and Stockholm Bioinformatics Center;
4Cancer Center Karolinska, Karolinska Hospital, Immune and Gene Therapy Laboratory, Stockholm, Svédország

Az IgD-molekula a korábbi feltevések alapján az evolúciós közelmúltban fejlődött ki, csak rágcsálókban, illetve főemlősökben található. E feltételezéssel szemben munkacsoportunk legújabban izolálta a szarvasmarha, juh és a sertés Igd-géneket és kimutatta, hogy ezek RNS-szinten is megjelennek, azaz transzkripcióra képesek.

A cDNS-molekulákból származtatott aminosav-szekvencia alapján azt találtuk, hogy a párosujjúak IgD nehézlánca szerkezetileg az emberi IgD nehézláncához hasonlít, azaz a szarvasmarha-, juh- és sertés-IgD nehézlánc konstans régiója három doménből, valamint egy kapocsrégióból áll. Filogenetikai elemzéseink alapján megállapítottuk, hogy a Cd gén a Cm gén megduplázódása révén, több mint 300 millió évvel ezelőtt keletkezhetett. A szarvasmarha és a juh dCH1 doménje nagyfokban hasonlít a mCH1 doménhez (~96%), amely egy második, mintegy 20 millió évvel ezelőtt lezajlott génkettőződés következménye. Ennek során a mCH1 és az azt megelőző génszakasz a d génbe úgy épült be, hogy lecserélte az ott lévő dCH1-régiót, és ez által hasonló IgM és IgD nehézláncstruktúrát alakított ki. Ez a génduplikáció az Sm-szakaszt is érintette, és egy rövid, ám funkcionálisan ép Sd-régiót eredményezve biztosította a közvetlen IgD-osztályváltást (Zhao et al. J Immunol 2002;169:4408.; Zhao et al. J Biol Chem 2003;e-pub).

Párosujjú rokonaihoz hasonlóan, a sertés-dCH1 és környezete is kicserélődött a µCH1-régióval. Figyelemreméltó különbség azonban, hogy ebben az állatfajban a transzkripció során mind a mCH1, mind pedig a dCH1 domént tartalmazó, kétfajta IgD-nehézlánc is keletkezik (VDJ-mCH1-H-dCH2-dCH3 vagy VDJ-dCH1-H-dCH2-dCH3). Hasonló jelenséget korábban nem mutattak ki gerincesek esetén (Zhao et al. J Immunol 2003;171:1312.).

A párosujjú állatok Cd génjeinek jelenléte, valószínűleg a többi emlőshöz hasonlóan, arra utal, hogy az IgD az IgM-től független, túlélési előnyt biztosító biológiai funkcióval rendelkezik.

Artiodactyl IgD - the missing link

IgD has been suggested to be a recently developed Ig class, only present in rodents and primates. However, we have recently identified the cow, sheep, and pig Igd genes and shown that they are transcriptionally active.

The deduced amino acid sequences from their cDNAs show that artiodactyl IgD H chains are structurally similar to human IgD, where the cow, sheep, and pig IgD H chain constant regions all contain three domains and a hinge region. According to a phylogenetic analysis, the Cm gene appears to have been duplicated from the Cm gene >300 million years ago. In cows and sheep, the dCH1 is highly homologous (~96%) to its respective mCH1 sequences due to a duplication of the mCH1 and its upstream sequence ~20 million years ago. The duplicated segment was introduced into the d gene, replacing the pre-existing dCH1, resulting in a similar structure of the H chain of both IgM and IgD in these species. The duplication also involved the Sm region and led to the formation of a short, but functional, Sd region, which can direct IgD class switching (Zhao et al. J Immunol 2002; 169:4408.; Zhao et al. J Biol Chem 2003;e-pub).

Similarly to its artiodactyl relatives the porcine genomic dCH1 exon has been replaced by even a more recent duplication of the mCH1 and its flanking sequences. However, a unique feature exists in pigs, either of the two CH1 exons (m and d) could be observed in the expressed porcine IgD H chain cDNA sequences (VDJ-mCH1-H-dCH2-dCH3 or VDJ-dCH1-H-dCH2-dCH3), showing a pattern that has not been observed previously in vertebrates (Zhao et al. J Immunol 2003; 171:1312.).

The presence of Cd genes in artiodactyls, possibly in most mammals, suggests that IgD may have some as yet unknown biological properties, distinct from those of IgM, conferring a survival advantage.