ÖSSZEFOGLALÓ KÖZLEMÉNY

A 70 kDa-os hősokkfehérje molekuláris biológiája és egyes immunológiai folyamatokban játszott szerepe
Kocsis Judit, Füst György, Prohászka Zoltán
 
 
 
 

DR. KOCSIS JUDIT: Semmelweis Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, III. Sz. Belgyógyászati Klinika, DR. PROHÁSZKA ZOLTÁN (levelező szerző), DR. FÜST GYÖRGY, MTA-Semmelweis Egyetem, Anyagcsere-, Genetikai és Immunológiai és Atherosclerosis Kutatócsoport, valamint III. Sz. Belgyógyászati Klinika, 1125 Budapest, Kútvölgyi út 4., e-mail: prohoz@kut.sote.hu

Magyar Immunol/Hun Immunol 2003;2 (2): 5-15.

Érkezett: 2002. november 15.
Elfogadva: 2003. május 6.



ÖSSZEFOGLALÁS

A hősokkfehérjék vagy stresszfehérjék védőfunkcióik révén alapvető szerepet töltenek be a sejt túlélésében. Nagymértékben konzervatív szerkezetüknek köszönhetően ideális hírvivői a sejt stresszválaszának. A stresszfehérjék egyik legismertebb képviselője a 70 kDa-os hősokkfehérje (Hsp70); ennek intra- és extracelluláris funkciója egyre ismertebb. A szerzők bemutatják a hsp70 gén expressziójának szabályozását, a hsp70 gének polimorfizmusait, ezek öszszefüggéseit bizonyos kórállapotokkal, továbbá a Hsp70 és az immunválasz közötti többrétű kapcsolatot. Utóbbi keretén belül elemzik a Hsp70 tumorellenes immunitásban betöltött jelentős sze-repét, a Hsp70-ellenes antitestek jelenlétét és egyes betegségekkel való összefüggését. Kitérnek a Hsp70-nel kapcsolatos vizsgálataik eredményeire: kimutatták, hogy a Hsp70-ellenes autoantitestek minden felnőtt szérumában jelen vannak, szintjük nem áll összefüggésben a súlyos koszorúér-betegség fennállásával; in vitro a humán Hsp70 molekula antitestektől függetlenül képes aktiválni a komplementrendszer klasszikus útvonalát, a C1q direkt kötése révén.

stresszfehérje, Hsp70, polimorfizmus, antitest, komplementrendszer


Evolúciós szempontból a stresszválasz a sejt ősi, általánosan előforduló, alapvető túlélési reakciója. Ez a sejtműködés véd a környezeti stressz károsító hatásaitól, többek között az intracelluláris fehérjék kitekeredésével - denaturációjával - szemben. A védőmechanizmusok egyik molekuláris bástyáját egy erre szakosodott fehérjecsalád, az úgynevezett molekuláris chaperonok képezik. A molekuláris chaperonok kis koncentrációban ugyan, de olyan sejtekben is expresszálódnak, amelyeket nem ér stresszhatás, és fontos szerepet töltenek be a sejtciklusban, a differenciációban és a növekedésben. Részt vesznek továbbá az anyagcsere-folyamatokban - a fehérjék összeszerelése és transzportja révén -, a programozott sejthalálban, illetve befolyásolják az enzimek és a receptorok aktivációját. A molekuláris chaperonokat gyakran nevezik hősokkfehérje (Hsp) vagy stresszfehérje néven, mivel a környezet hőmérsékletváltozásainak (hősokk) hatására indukálódhatnak. A környezeti stressz modellezésére legszélesebb körben használt nem letális hősokk speciális változásokat indít el a sejt működésében és a génexp-resszióban, ezt a sejt stresszválaszának nevezzük. Hősokk hatására - a sejtfunkcióban bekövetkezett változások eredményeképpen - gátlódik a DNS-szintézis és -transzkripció, az RNS-szintézis és -transzláció; leállnak a sejtciklus folyamatai; denaturálódnak és összecsapzódnak a fehérjék; a proteosomákban és a lysosomákban fokozódik a fehérjék degradációja, felbomlanak a cytoskeletalis struktúrák; az anyagcsere változása nettó ATP-szint-csökkenéshez, a membrán áteresztőképességének megváltozása a sejtben az intracelluláris Na+-, H+- és Ca++-szint emelkedéséhez vezet (1). Az emlősök sejtjeiben a nem letális hősokk a génexpresszió és az expresszálódó fehérjék aktivitásának változását idézi elő. Ez az - átmenetileg fokozott hősokkfehérje-expresszióval járó - válasz jellegzetesen javítja a termotoleranciát, azaz a sejt azon képességét, amelynek birtokában túléli a következő, a korábbinál súlyosabb hősokkot. A sejt stresszválaszát egyéb tényezők - toxinok (például arzén), bakterális lipopoliszacharidok stb. - is kiválthatják (1. táblázat), az egyik stressztényező által keltett válasz pedig gyakran kereszttoleranciát eredményez a másik tényezővel szemben (2). Az egyre súlyosabb mértékű stressz apoptotikus folyamatokat indít el, extrém esetekben a sejt nekrotizál.
 

1. táblázat. A hősokkfehérjék fokozott expressziójához vezető állapotok. 
 

Nagymértékben konzervált jellegüknél és indukálhatóságuknál fogva a hősokkfehérjék a sejt stresszválaszának ideális hírvivői. Szinte az összes eddig vizsgált patogén mikroorganizmus rendelkezik hőhatásra indukálódó stresszfehérjegénekkel; a fertőzés, hő, valamint egyéb tényezők okozta stresszhatásokra fokozott hősokkfehérje-expresszióval válaszol. A magasabb rendű szervezetek veleszületett módon, a természetes immunitás révén képesek a stresszjelekre válaszolni. Alapvetően ugyanazok a molekulák jelzik a gazdaszervezet stresszválaszát, így sejtnekrózis során például a megváltozott saját molekulát jelölhetik "veszélyesnek" (3). A hősokkfehérjék természetes szerepe azonban az adaptív immunitás új kihívásai során veszélyeket rejthet magában. A specifikus receptorok - antitestek és T-sejt-receptorok - megjelenésével egy időben a felülexpresszált és konzervatív stresszfehérjék az autoimmunitás első számú célpontjaivá válhatnak, az infekció kapcsán kialakult molekuláris mimikri révén. Az összes emlőssejtben megtalálható, nagymértékben konzervált hősokkfehérjék tehát speciális védelemre szorulnak az "adaptív világban". Jól ismert Cohen immunológiai homunculus elmélete, miszerint az autoantigénekkel reaktív autoantitestek és autoimmun T-sejtek hálózata az egészséges immunrendszer részét képezi, megfelelő szabályozásuk megelőzi az autoimmun betegség kialakulását (4). Valóban születtek olyan tanulmányok, amelyek arra utalnak, hogy ennek a védelemnek a károsodása jelentős szerepet tölt be a fertőzések hatására kialakult autoimmun betegségekben. Ebben az összefoglalóban - a Hsp70 példáján bemutatva - áttekintést szeretnénk adni a hősokkfehérjék molekuláris biológiájáról és egyes hősokkfehérje-felismerő mechanizmusokról, a komplementrendszerrel és specifikus antitestekkel kapcsolatos összefüggésekre kiterjedően.
 

A hősokkfehérjék molekuláris biológiája

Osztályozás
 

2. táblázat. A hősokkfehérjék legismertebb családjai és lokalizációjuk a humán genomban. 
HSP: hősokkprotein
 

A hősokkfehérjéket - hagyományos módon - molekulatömegük szerint osztályozzák. A legjobban ismert hősokkfehérjék a 110, 90, 70, és 60 kDa molekulatömegű családokba tartoznak (2. táblázat). Hősokk hiányában ezek a fő hősokkfehérjék 37 oC-on expresszálódnak. Külön csoportot képeznek a minor hősokkfehérjék, idetartoznak a 34, 47, 56, 75, 78, 94 és 174 kDa molekulatömegű, glükózregulált fehérjék (glucose regulated proteins, grp), amelyek glükózmegvonás hatására termelődnek. A hősokkfehérjék harmadik csoportját a kisméretű, mintegy 20 kDa molekulatömegű hősokkfehérjék alkotják. A hősokkfehérjéknek - fehérje természetükből adódó-an - három fő biokémiai szerepük van:

- Dajkafehérje-aktivitásuk révén meggátolják a denaturálódott fehérjék összetapadását, és segítik viszszanyerni a denaturált fehérjék natív konformációját. Néhány dajkafehérje-funkciójú hősokkfehérje stresszhelyzet hiányában is részt vesz a naszcens polipeptidek natív konformációjának létrehozásában a fehérjeszintézis során. Annak köszönhetően, hogy a fehérjéket speciális konformációban tudják tartani, számos sejtregulációs folyamatban - például a sejtcikluskontrollban, a szteroid- és D-vitamin-receptor-feldolgozásban és az antigénprezentációban - vesznek részt. A legrégebben ismert dajkafehérje-aktivitású hősokkfehérje a Hsp70, Hsp90 és a Hsp60.

- Szabályozzák a sejt redox állapotát, ennek legjobb példáját a Hsp32, ismertebb nevén a hemoxigenáz-1 nyújtja.

- Harmadik alapvető biokémiai szerep a fehérjeturnover szabályozása. Példaképpen az ubiquitint említjük; ez nyugalmi körülmények között is expresszálódik a sejtben, hősokk hatására nagyobb mennyiségben termelődik, és molekuláris toldalékként a proteosomában lebontásra kerülő fehérjék kijelölésére szolgál. Meg kell azonban jegyezni, hogy a hősokkfehérjék összes felsorolt szerepe ATP-igényes folyamat, az ATP hidrolízisét pedig maga a hősokkfehérje katalizálja.
 

A génexpresszió szabályozása a transzkripció szintjén

Szinte az összes fajta hősokkfehérjegént klónozták már, különféle szervezetekből. A legtöbbet vizsgált humán hősokkfehérjegén, a hsp70 genetikai ujjlenyomata arra derített fényt, hogy hősokk hatására igen gyorsan hősokktranszkripciós faktorok (heat shock transcription factor: HSF) kötődnek az öt nCGAAn szekvenciát tartalmazó, úgynevezett hősokkelemekhez (heat shock element: HSE). A gerincesekben eddig leírt négy hősokktranszkripciós faktor, a HSF-1, -2, -3 és -4 a főszereplője egy nemrégiben megjelent nagy összefoglaló tanulmánynak (5). A hő hatására létrejött aktiváció előtt a HSF-1 monomer formában található a citoplazmában. Úgy tűnik, hogy a hősokk során megjelenő denaturált fehérjék hidrofób doménjei adják a kezdő lökést a HSF-1 aktivációjához. Tudjuk, hogy a sejt nyugalmi állapotában a citoplazmatikus HSF-1 döntő többsége Hsp70 és Hsp90 molekulákkal képez komplexet, illetve a hősokkfehérjék előszeretettel kötődnek denaturált fehérjékhez. Elképzelhető tehát, hogy a nyugalomban lévő sejtben a HSF-1 hősokkfehérjékhez kötődik; a HSF-1 aktivációja kompetíció eredményeképpen valósul meg: a hősokk hatására a citoplazmában nagyobb koncentrációban jelen levő denaturált fehérjék leszorítják ezt a transzkripciós faktort a hősokkfehérjékről. Hőstressz okozta aktiváció után a HSF-1 elsősorban a nucleolusban, trimer formában található. A HSF-1 aktivált, trimer formája kötődik a hősokkelemhez, és hőstressz során részt vesz a hősokkfehérjegének fokozott transzkripciójában. Foszforiláltsági állapotától függően a HSF-1 hősokkelemekhez való kötődése nem indukál minden esetben transzkripciót. Ez egy olyan kulcsszerepet játszó jelátviteli útvonalat feltételez a sejtben, ami valószínűleg módosítja a HSF-1 közvetítette transzkripciót. A HSF-1 ezenkívül azt a fajta transzkripciót is befolyásolhatja, amelyhez nincsen szükség a gén promóterével való közvetlen kapcsolatra (6). A hősokkelemek HSF-1 révén megvalósuló pozitív szabályozásán kívül ezen promóter elem negatív szabályozó szerepét is bizonyították egerekben, egy konstitutívan kifejeződő fehérje, a hősokkelemhez kötődő faktor (HSE binding factor: HSE-BF) segítségével. Ennélfogva a HSF-1 transzkripciót aktiváló képességét nemcsak a foszforiláltság mértéke, hanem azon szabályozó folyamatok is módosíthatják, amelyek befolyásolják a HSE-BF hősokkelemhez való kötődését.

A homozigóta hsf-1(-/-) nulla mutációt hordozó (hsf-1 génkiütött) egerek esetében végzett vizsgálatok a transzkripciós rendszer kiemelkedő szerepét hangsúlyozzák a túlélésben és a stresszhez való adaptációban (7). A hsf-1 génkiütött egerek sejtjeiben nem tudtak HSF-1 fehérjét kimutatni, számos hősokkfehérje expressziója in vitro és in vivo hősokk hatására egyaránt kisebb mértékben emelkedett a vártnál, jóllehet alapállapotban a hősokkfehérjék expressziója viszonylag változatlan maradt. Nemrégiben Kallio és munkatársai számoltak be hsf-2(-/-) egerekről (8). A hsf-1 génkiütött egerekhez hasonlóan ezek az állatok is elmaradtak a növekedésben, központi idegrendszeri károsodásokat mutattak ki náluk, illetve mind a hím, mind a nőstény egyedek teljes mértékben infertilisek voltak.

Úgy tűnik, hogy összetett folyamatok szabályozzák a hősokkfehérjék expressziós szintjét nagy valószínűséggel meghatározó hősokktranszkripciós faktorok lebontásának mértékét. A konstitutív Hsc70 szintéziséért felelős hsp70 gén szabályozása nem teljesen ismert, de a hősokktranszkripciós faktorok valószínűleg nem vesznek részt benne.
 

Az intracelluláris hősokkfehérjeszint szabályozása

A hősokk nem az egyetlen olyan inger, amely befolyásolja a hősokkfehérjegének transzkripcióját (1. táblázat); a hősokkfehérjegének pedig nem az egyedüli olyan gének, melyek különböző stresszhatásokra válaszolnak. A hősokkfehérje-aktiváció mértéke függ a károsító hatás jellegétől, annak mértékétől, és az expozíció időtartamától. A hősokkfehérje-szintézis a hősokk után 3-5 órával éri el tetőpontját, majd nyolc órával később befejeződik. A Hsp70 szintje sokkal nagyobb mértékben emelkedik, mint a Hsp90 szintje, ez valószínűleg abból következik, hogy a Hsp90 nyugalmi szintje eleve magasabb, vagy a Hsp90 nem kifejezetten a sejt védőmechanizmusaiban vesz részt. Vizsgálati módszertől függően a hősokkot követő napokban, hetekben a hősokkfehérjék szintje a nyugalmi szinthez képest magasabb marad. In vivo azonban számos tényező befolyásolhatja a hősokkválasz mértékét és a hősokkfehérjék szintjének emelkedését, mint például a hsp gének polimorfizmusa (9), a hősokkfehérjék eltérő nyugalmi szintje, például a Hsp70/Hsc70 aránya (10).

Alapjában véve a hősokkfehérjék egy-két kivételtől eltekintve nem polimorf fehérjék. A Hsp90 családban eddig még nem írtak le polimorfizmust. Csak egyetlen tanulmány számolt be arról, hogy a hirtelen bölcsőhalál áldozataiban jelentős különbséget találtak a hsp60-specifikus génszakaszok MspI-gyel emésztett mintáiban az egészséges kontrollokhoz képest (32). Sokkal többet vizsgálták a HLA-kapcsolt hsp70 gének polimorfizmusait (11-31) (3. táblázat). A humán hsp70-1 gén cisz regulációs szekvenciájában a biallélikus polimorfizmus a hősokkelemen belül található. Kézenfekvőnek tűnt ezért elvégezni azt a kísérletet, amelynek során ezen régióban történt nukleotidszubsztitúció hatását vizsgálták a promóter erősségére és a transzkripciós aktivitásra (12, 33). Favatier és munkatársainak eredményei azonban azt mutatták, hogy a hsp70-1 promóterpolimorfizmus nem befolyásolja a hősokktranszkripciós faktorok kötődését, a Hsp70 mRNS-akkumulációját vagy -szintézisét az EBV-vel transzformált humán sejtvonalakban. Hasonló eredményt kaptak Schroeder és munkatársai, akik a hsp70-2 gén polimorfizmusa és a Hsp70-mRNS-expresszió közötti kapcsolatot elemezték. Azt találták, hogy a gén PstI-polimorfizmusa ex vivo nem befolyásolja az mRNA-expressziót (34).
 

3. táblázat. A hsp70 génpolimorfizmusok összefüggései egyes emberi betegségekkel (11-31). 
BMI: testtömegindex, B/K: A vizsgált betegek és kontrollok száma, IBD: gyulladásos bélbetegség, SLE: szisztémás lupus arythematosus, TL: tuberkuloid lepra
 

Bár klinikai tanulmányokban eddig még nem sikerült alátámasztani a hsp70 gén polimorfizmusának a Hsp70-szintre kifejtett közvetlen szabályozószerepét, az állatkísérletek egyértelműen arra utalnak, hogy a hősokkfehérjék emelkedett szintje előnyös hatású bizonyos kórfolyamatok megelőzésére. A patkány indukálható hsp70 génjét hordozó transzgenikus egerekről szóló korábbi beszámolók szerint ezeknek az állatoknak a szíve kevésbé érzékeny az ischaemiás károsodással szemben (35). Később ezen eredmények megerősítéseképpen a humán hsp70 géneket hordozó transzgenikus egerek egészséges szívében gyorsabb gyógyulást írtak le ischaemiát követően az azonos alomból származó, nem transzgenikus egerekhez képest. A hősokkfehérjék cardioprotectiv szerepét nemrégiben foglalták össze (36). Számos in vitro és in vivo állatkísérlet (legutóbb Bruemmer-Smith összefoglalója [37]) támasztja alá a magas Hsp70-szint védőszerepét a kísérletesen kiváltott szepszis jobb prognózisában és kimenete-lében. Egy korábban lezajlott hősokk súlyos szepszisben például csökkenti a mortalitást és a szervi károsodást, ez a fokozott Hsp70-expresszióval magyarázható. Mindent összevetve: az egyéb gének serkentése nélkül, kifejezetten a hsp gének indukálását célzó terápiás megközelítések alapjaiban változtathatják meg a kezelések kelléktárát a jövőben. Ennek ellenére számos alap- és klinikai jellegű kutatást kell még végezni ahhoz, hogy a hősokkválasz pontos összetevőit és szabályozását megismerjük az emberben.
 

A 70 kD-os hősokkfehérje és egyes immunológiai tényezők összefüggései

A Hsp70 szerepe a tumorellenes immunitásban

A hősokkfehérjék kulcsfontosságú szerepet játszanak a tumorellenes immunválaszban. Kimutatták, hogy a vírussal fertőzött, illetve tumoros sejtekből származó Hsp90 és Hsp70 specifikus immunitást tud kiváltani az ellen a sejt ellen, amelyből a Hsp származik (38). Ez csak abban az esetben következik be, ha a Hsp70-hez egy, a tumorból származó peptidelegy is kötődik, ez a komplex képes aktiválni a specifikus celluláris immunválaszt. A jelenlegi elképzelés szerint a Hsp-hez kötődött antigén, a Hsp-peptid komplex a CD91 és Toll receptorkomplexen keresztül jut be az antigénprezentáló sejtekbe (39), majd azok a nyirokcsomóba jutnak és aktiválják a CD8+ T-lymphocytákat. Mivel a hősokkfehérjék aktiválják a célsejteket, egyéb immunológiai stimulus nélkül képesek immunizálni, ezért úgynevezett természetes adjuvánsoknak tartják őket (40). Számos adat bizonyítja, hogy a normális szövetekkel ellentétben a különféle tu-morok felszínén fokozott a Hsp70-expresszió (41). A Hsp70-membrán expressziója korrelált az NK-sejtekkel szembeni fokozott érzékenységgel, ez tovább fokozódott, ha az NK-sejteket IL-2-vel és rekombináns Hsp70-nel inkubálták (42). Ménoret és munkatársai primer tumorokból származó klónok esetében azt találták, hogy csak azon klónok esetében történt rejekció, amelyek indukálható Hsp70-et tudtak szintetizálni. Ugyanakkor a progresszív növekedést mutató tumoroknál nem tudtak Hsp70-szintézist kimutatni (43). Ugyanez a munkacsoport mutatta ki, hogy a nem letális hőstressznek kitett tumor immunogenitása fokozódik, s a specifikus T-sejt-mediált citotoxicitás korrelál a hőstressz által indukált Hsp70-expresszióval (43). Még nem ismert, hogy a fent említett, tumorrejekciós folyamatokban szerepet játszik-e a Hsp70 komplementaktiváló képessége.

A hősokkfehérjék - így a Hsp70 - elsődleges intracelluláris feladata a sejt védelme a különféle külső behatásokkal szemben. A Hsp70-expresszió fokozódása ezért védelmet is nyújthat a daganatsejt számára, például a citosztatikus vagy irradiációs kezelés során (44). A tumor Hsp70-expressziója a hőterápiával szemben is rezisztenssé teheti a tumort. Wang és munkatársai kimutatták, hogy a termorezisztens tumorok a HSF-1 transzkripciós faktor gátlásával termoszenzitívvé tehetők (45). Jaattela és munkatársai a Hsp70-expresszió és a tumorsejtek TNF-szenzitivitása közötti kapcsolatot vizsgálva megállapították, hogy a Hsp70 fokozott expressziója védi a daganatsejtet a TNF és a monocyták okozta citotoxikus károsodással szemben (46).

A Hsp70 tehát

- védi és rezisztenssé teheti a daganatsejtet a külső behatásokkal szemben,
- a Hsp70-tumorfehérje komplex aktiválja a természetes és az adaptív immunrendszert, specifikus immunválaszt váltva ki.

Utóbbi a tumorellenes vakcinák alapját képezheti, míg előbbi egy ma még nem kellően ismert tényező, s befolyásolhatja a vakcinák sikerességét.
 

Specifikus anti-Hsp70 antitestek előfordulása egyes megbetegedésekben

Több munkacsoport is vizsgálta a Hsp70-ellenes antitestek előfordulását különféle kóros állapotokban, illetve egészséges egyénekben (47-62) (4. táblázat). Az alkalmazott metodikától függően egészséges embereknél eltérő arányban tudták kimutatni a humán Hsp70 elleni antitestek jelenlétét. Pockley és munkatársainak (47) eredményei arra utalnak, hogy ezek az antitestek minden egyénnél kimutathatók, így nagy valószínűséggel a természetes antitest-repertoár részét képezik (48). Különféle autoimmun és egyéb betegségekben találtak emelkedett anti-Hsp70-szintet, így például SLE-ben, rheumatoid arthritisben, kevert kötőszöveti betegségben, Graves-Basedow-kórban, autoimmun hepatitisben, schizophreniában stb. Ez arra utalhat, hogy ezen autoantitestek kóroki szerepet is játszhatnak (4. táblázat).
 

4. táblázat. Hsp70-ellenes antitestek előfordulásának vizsgálata egyes kórállapotokban. 
AIH: autoimmun hepatitis, CAD: koszorúérbetegség DCM: dilatatív cardiomyopathia, DM: diabetes mellitus, GD: Graves-Basedow-kór, GVHD:  graft versus host betegség, IBD: gyulladásos bélbetegség, MCTD: kevert kötőszöveti betegség, PBC: primer biliáris cirrhosis, SLE: szisztémás lupus erythematosus, vs: versus
 

Külön figyelmet érdemel a Hsp70-ellenes antitestek vizsgálata cardiovascularis betegségek esetén, a Hsp70 esetleges kardioprotektív szerepe miatt. Az utóbbi évek kutatásai alapján bebizonyosodott, hogy a Hsp60- és Hsp65-ellenes autoantitestek - autoimmun folyamatok révén - szerepet játszanak az atherosclerosis kialakulásában. A Hsp70-ellenes immunitás atherosclerosisban betöltött szerepéről jóval kevesebbet tudunk. Számos tanulmányban kimutatták a Hsp70-expresszió atherosclerosissal és érsérüléssel kapcsolatos fokozódott expresszióját (63), a Hsp70-ellenes antitestszintekről egyelőre kevés adatot publikáltak. Perifériás érbetegségben (50) és hypertoniában (47) emelkedettnek találták a Hsp70-ellenes antitestek szintjét.
 

Saját vizsgálataink

Anti-Hsp70 antitestek vizsgálata

Munkacsoportunk súlyos koszorúér-betegségben szenvedő egyének szérumából vizsgálta a humán, 70 kDa-os hősokkfehérje- (Hsp72-) ellenes autoantitesteket (64). Az antitestek kimutatására ELISA módszert használtunk. Rekombináns humán Hsp70-nel fedtük a lemezeket, a szérumok 1:100-as hígításban kerültek a lemezekre. Az anti-Hsp-antitestek kötődését peroxidázzal jelzett gamma-lánc-specifikus nyúl anti-humán IgG-vel, majd a jel felerősítése céljából kecske nyúl elleni IgG-POX hozzáadásával detektáltuk. Standardként magas antitestszintű savó hígítási sorozatát használtuk, az egyes OD-értékeket ehhez viszonyítottuk. Kilencvenkilenc, coronariabetegségben szenvedő és 99 egészséges kontrollegyén szérumát vizsgáltuk. Minden szérumban ki tudtuk mutatni az antitest jelenlétét, ezek log-normális eloszlást követtek (1. ábra). Az antitestszint medián (25-75 percentilis) értéke a két csoportban közel azonosnak bizonyult: a koszorúérbetegek csoportjában 653 AU/ml (400-1141), a kontrollcsoportban 630 AU/ml (326-1152) volt. A két csoport Hsp70-ellenes antitestszintjei között az életkor, nem, testtömegindex és szérumlipidértékek illesztése után sem mutatkozott szignifikáns különbség.
 

1. ábra. Hsp70-ellenes antitestek előfordulása koszorúér-betegségben szenvedő (n=99) és egészséges egyének (n=99) szérumában. A két csoport közötti különbség nem szignifikáns. 

AU: arbitrary unit (a standard alapján számított önkéntes egység), CAD: koszorúérbetegség

 

A Hsp70 komplementaktiváló képességének jellemzése

Az utóbbi években számos adat igazolta a Hsp70 és a természetes immunitás közötti sokrétű kapcsolatot. Kimutatták például, hogy a Hsp70 egy receptorkomplexen keresztül - melynek biztosan részét képezik a Tollreceptorok egyes tagjai és a CD14 moleku-la - különböző proinflammatorikus citokinek termelését képes fokozni (65). Az endogén Hsp70 - a Hsp60-hoz és bizonyos patogénasszociált molekulákhoz hasonlóan - aktiválja az ősi Toll-receptorszignál útvonalat; ez az újabb kutatások szerint a dendritikus sejtek számára potens érési stimulust jelent (66). Munkacsoportunk a Hsp70 komplementaktiváló képességét elemezte egy, a laboratóriumunkban kifejlesztett ELISA módszer alkalmazásával (67). Kezdeti vizsgálatainkkal kimutattuk, hogy a humán rekombináns Hsp70-nel fedett lemezeket normál humán szérummal (1:1 arányban veronal-pufferben hígítva) inkubálva szignifikáns C4b-, illetve C3b-kötődést tudtunk detektálni. A komplementrendszer aktivációja specifikus volt, mivel hővel inaktivált (56 oC-on 30 percig) szérumban nem történt szignifikáns C4-hasítás és -kötés. Az aktiváció Hsp70-ellenes antitestek jelenlététől független - agammaglobulinaemiás szérumban is végbemegy -, s mértéke nem mutat összefüggést a Hsp70-ellenes antitestek szintjével67. Az aktivációban az alternatív útvonal alárendelt szerepet játszik, mivel Mg++-EGTA jelenlétében nem észleltünk szignifikáns C4b-, illetve C3b-hasítást, -kötődést.

A továbbiakban a humán indukálható Hsp70 (Hsp72) molekula különböző, rekombináns módon előállított fragmenseivel lokalizálni kívántuk a komplementaktiváció beindításáért felelős szakaszokat. Az eddig elvégzett vizsgálataink azt mutatták, hogy a komplementaktiváló képességért elsősorban a molekula N-terminális régiója (1-437), illetve az azon található ATP-áz domén (1-383) felelős (5. táblázat). Ez utóbbi két fragmens szignifikáns módon, a teljes Hsp70 fehérjéhez hasonló mértékben aktiválta a klasszikus komplement-reakcióutat, szemben a fehérjekötő domént tartalmazó C-terminálissal (386-640) (5. táblázat). Ezt követően a Hsp70 C1q-kötő képességét elemeztük, mint az egyik lehetséges faktort, amely beindíthatja az antitestektől független aktivációt. A különböző koncentrációjú Hsp70-szakaszokkal fedett lemezekhez - különböző töménységben - tisztított C1q-t adtunk. A Hsp70, valamint a molekula N-terminális szakasza, illetve ATP-áz doménje dózisfüggő módon megkötötte a C1q-t, a kötődést szignifikáns mértékben nagyobbnak találtuk, mint a C-terminális szakasz, illetve kísérletsorozatunkban irreleváns fehérjeként alkalmazott GST (glutation-S-transzferáz), valamint a fedetlen terület C1q-kötése (6. táblázat).
 

5. táblázat. A Hsp70-fragmensek C4b-kötése ELISA rendszerben. 

A számok két párhuzamos mérés átlagos esélyhányados-értékei ± szórás. Egy reprezentatív mérés három hasonló mérés közül. 
*p<0,0001 Hsp70, ATP-áz, illetve N-terminális vs. GST, illetve háttér (ANOVA). 
GST: glutation-S-transzferáz, ns: nem szignifikáns (C-terminális vs. GST, illetve háttér; ANOVA).

6. táblázat. A Hsp70-fragmensek C1q-kötése ELISA rendszerben (fedés: 1 mikrogramm/ml). 

A számok két párhuzamos mérés átlagos esélyhányados-értékei ± szórás. Egy reprezentatív mérés, három hasonló mérés közül. 
*p<0,0001 Hsp70, illetve N-terminális vs. GST, illetve háttér (ANOVA). 
GST: glutation-S-transzferáz, ns: nem szignifikáns

 
 

Eredményeink összefoglalása

Eredményeink alátámasztják a hősokkfehérjék, köztük a Hsp70 természetes immunitással való szoros kapcsolatát. Vizsgálataink alapján a Hsp70-ellenes autoantitestek minden felnőtt szérumában jelen vannak, szintjük - a 60 kDa-os hősokkfehérjék elleni antitestekkel szemben - nincs összefüggésben a koszorúér-betegséggel. Kimutattuk, hogy a humán Hsp70 indukálható formája a C1q direkt kötése révén aktiválja a komplementrendszer klasszikus útvonalát, s ezért a képességért a molekula N-terminális szakasza felelős.

Ma még nem ismert az irodalomban, hogy a Hsp70 fehérje mely formája és milyen orientáltsággal fordul elő a keringésben vagy a sejtfelszínen, s a komplementfehérjék és antitestek képesek-e reagálni ezekkel az epitópokkal. További vizsgálatok szükségesek annak eldöntésére, hogy in vivo is jelentős-e a Hsp70 interakciója a humorális immunrendszer fent említett tényezőivel.

Köszönetnyilvánítás

Hálásan köszönjük Szigeti Antalné áldozatos munkáját a kísérletek kivitelezésének segítésében, valamint prof. dr. Rick Morimotónak (NorthWestern University, Illinois, USA), hogy rendelkezésünkre bocsátotta a Hsp70 molekulafragmenseket.
 

IRODALOM

  1. Sonna LA, Fujita J, Gaffin SL, Lilly CM. Molecular biology of thermoregulation. Invited review: Effects of heat and cold stress on mammalian gene expression. J Appl Physiol 2002;92:1725-42.
  2. Kiang JC, Tsokos GC. Heat shock protein 70 kDa: Molecular biology, biochemistry and physiology. Pharmacol Ther 1998;80:183-201.
  3. Matzinger P. The danger model: a renewed sense of self. Science 2002;296:301-5.
  4. Cohen IR, Young DB. Autoimmunity, microbial immunity and the immunological homunculus. Immunol Today 1992;12:105-10.
  5. Pirkkala L, Nykanen P, Sistonen L. Roles of heat shock transcription factors in regulation of the heat shock response and beyond. FASEB J 2001;15:1118-31.
  6. Chen C, Xie Y, Stevenson MA, Auron PE, Calderwood SK. Heat shock factor 1 represses Ras-induced transcriptional activation of the c-fos gene. J Biol Chem 1997;272:26803-6.
  7. Xiao X, Zuo X, Davis AA, McMillan DR, Curry BB, et al. HSF1 is required for extra-ambryonic developement, postnatal growth and protection during inflammatory responses in mice. EMBO J 1999;18:5943-52.
  8. Kallio M, Chang Y, Manuel M, Alastalo TP, Rallu M, et al. Brain. abnormalities, defective meiotic chromosome synapsis and female subfertility in HSF2 null mice. EMBO J 2002;21:2591-601.
  9. Favatier F, Bornman L, Hightower LE, Günther E, Polla BS. Variation in Hsp gene expression and Hsp polymorphism: do they contribute to differential disease susceptibility and stress tolerance? Cell Stress Chap 1997;2:141-55.
  10. Boshoff T, Lombard F, Eiselen R, Bornman JJ, Bachelet M, et al. Differential basal synthesis of Hsp70/Hsc70 contributes to interindividual variation in Hsp70/Hsc70 inducibility. Cell Mol Life Sci 2000;57:1317-25.
  11. Rajalingam R, Mehra NK, Singal DP. Polymorphism in heat shock protein 70-1 gene promoter region and susceptibility to tuberculoid leprosy and pulmonary tuberculosis in Asian Indians. Indian J Exp Biol 2000;38:658-62.
  12. Aron Y, Busson M, Polla BS, Dusser D, Lockhart A, et al. Analysis of hsp70 gene polymorphism in allergic asthma. Allergy 1999;54:165-70.
  13. Ramos-Arroyo MA, Feijoo E, Sanchez-Valverde F, Aranburu E, Irisarri N, et al. Heat shock protein 70-1 and HLA class II gene polymorphisms associated with celiac disease susceptibility in Navarra (Spain). Hum Immunol 2001;62:821-5.
  14. Partanen J, Milner C, Campbell RD, Maki M, Lipsanen V, Koskimies S. HLA-linked heat shock protein 70 (HSP70-2) gene polymorphism and celiac disease. Tissue Antigens 1993;41:15-9.
  15. Bolla MK, Miller GJ, Yellon DM, Evans A, Luc G, Cambou JP, et al. Analysis of the association of a heat shock protein 70-1 gene promoter polymorphism with myocardial infarction and coronary risk traits. Dis Mark 1998;13:227-35.
  16. Pablos JL, Carreira PE, Martin Villa JM, Montalvo G, Arnaiz-Villena A, Gomez-Reino JJ. Polymorphism of the heat shock protein gene HSP70-2 in systemic lupus erythematosus. Br J Rheumatol 1995;34:721-3.
  17. Vargas-Alarcon G, Granados J, Martinez-Laso J, Gomez-Casado E, Zuniga J, et al. Lack of association between the polymorphism at the heat shock protein (HSP70-2) gene and systemic lupus erythematosus (SLE) in the Mexican mestizo population. Genes Immun 2000;1:367-70.
  18. Jarjour W, Reed AM, Gauthier J, Hunt S, Winfield JB. The 8.5-kb PstI allele of the stress protein gene, Hsp70-2. An independent risk factor for systemic lupus erythematosus in African Americans? Hum Immunol 1996;45:59-63.
  19. Vargas-Alarcon G, Londono JD, Hernandez-Pacheco G, Gamboa R, Castillo E, et al. Heat shock protein 70 gene polymorphisms in Mexican patients with spondyloarthropathies. Ann Rheum Dis 2002;61:48-51.
  20. Vinasco J, Beraun Y, Nieto A, Fraile A, Paeja E, Mataran L, Martin J. Heat shock protein 70 gene polymorphisms in rheumatoid arthritis. Tissue Antigens 1997;50:71-3.
  21. Ratanachaiyavong S, Demaine AG, Campbell RD, McGregor AM. Heat shock protein 70 (HSP70) and complement C4 genotypes in patients with hyperthyroid Graves disease. Clin Exp Immunol 1991;84:48-52.
  22. Schulte CM, Dignass AU, Goebell H, Rocher HD, Schulte KM. Genetic factors determine extent of bone loss in inflammatory bowel disease. Gastroenterology 2000;119:909-20.
  23. Schroeder S, Reck M, Höft A, Stuber F. Analysis of two human leukocyte antigen-linked polymorphic heat shock protein 70 genes in patients with severe sepsis. Crit Care Med 1999;27:1265-70.
  24. Esaki M, Furuse M, Matsumoto T, Aoyagi K, Jo Y, et al. Polymorphysm of heat shock protein gene HSP70-2 in Crohn disease: possible genetic marker for two forms of Crohn disease. Scand J Gastroenterol 1999;34:703-7.
  25. Pugliese A, Awdeh ZL, Galluzzo A, Yunis EJ, Alper CA, Eisenbarth GS. No independent association between HSP70 gene polymorphism and IDDM. Diabetes 1992;41:788-91.
  26. Kawaguchi Y, Ikegami H, Fukuda M, Fujioka Y, Shima K, Ogihara T. Polymorphism of HSP70 gene is not associated with type 1 (insulin-dependent) diabetes mellitus in Japanese. Diab Res Clin Pract 1993;21:103-7.
  27. Pociot F, Ronningen KS, Nerup J. Polymorphic analysis of the human MHC-linked heat shock protein 70 (HSP70-2) and HSP-Hom genes in insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM). Scand J Immunol 1993;38:491-5.
  28. Chuang LM, Jou TS, Wu HP, Tai TY, Lin BJ. A rapid method to study heat shock protein 70-2 gene polymorphism in insulin-dependent diabetes mellitus. Pancreas 1996;13:268-72.
  29. Chouchane L, Danguir J, Beji C, Boussida K, Camoin L, et al. Genteic variation in the stress protein Hsp70-2 gene is highly associated with obesity. Int J Relat Metab Disord 2001;25:462-6.
  30. Mestiri S, Bouaouina N, Ahmed SB, Khedhaier A, Jrad BB, et al. Genetic variation in the tumor necrosis factor-alpha promoter region and in the stress protein Hsp70-2: susceptibility and prognostic implications in brest carcinoma. Cancer 2001;91:672-8.
  31. Westman P, Partanen J, Leirisalo-Repo M, Koskimies S. HSP70-HOM NcoI polymorphysm and HLA-associations in the Finnish population and in patients with ankylosing spondylitis or reactive arthritis. Eur J Immunogenet 1994;21:81-90.
  32. Rahim RA, Boyd PA, Patrick WJA, Burdon RH. Human heat shock protein gene polymorphisms and sudden infant death syndrome. Arch Dis Child 1996;75:451-2.
  33. Favatier F, Jacquier-Sarlin MR, Swierczewski E, Polla BS. Polymorphism in the regulatory sequence of the human Hsp70-1 gene does not affect heat shock factor binding or heat shock protein synthesis. Cell Mol Life Sci 1999;56:701-8.
  34. Schroeder S, Reck M, Lehmann LE, Book M, Hoeft A, Stuber F. The PstI polymorphism of the endotoxin-inducible heat-shock protein gene does not affect messenger RNA level in human whole-blood culture. Intensive Care Med 2000;26:1139-43.
  35. Marber MS, Mestiril R, Chi SH, Sayen MR, Yellon DM, Dillmann WH. Overexpression of the rat inducible 70-kD heat shock protein in a transgenic mouse 38, increases the resistance of the heart to ischemic injury. J Clin Invest 1995;95:1446-56.
  36. Latchman DS. Heat shock proteins and cardiac protection. Cardiovasc Res 2001;51:637-46.
  37. Bruemmer-Smith S, Stüber F, Schroeder S. Protective functions of intracellular heat shock protein (HSP) 70-expression in patients with severe sepsis. Int Care Med 2001,27:1835-41.
  38. Srivastava PK, Menoret A, Basu S, Binder RJ, McQuade KL. Heat shock proteins come of age: primitive functions acquire new roles in an adaptive world. Immunity 1998;8:657-5.
  39. Vabulas RM, Braedel S, Hilf N, Singh-Jasuja H, Herter S, et al. The endoplasmic reticulum-resident heat shock protein Gp96 activates dendritic cells via the Toll-like receptor 2/4 pathway. J Biol Chem Jun 2002;7;277(23):20847-53.
  40. Blachere NE, Li Z, Chandawarkar RY, Suto R, Jaikaria NS, et al. Heat shock protein-peptide complexes, reconstituted in vitro, elicit peptide-specific cytotoxic T lymphocyte response and tumor immunity. J Exp Med 1997;168:1315-22.
  41. Multhoff G, Botzler C, Wiesnet M, Müller E, Meier T, et al. A stress-inducible 72-kDa heat-shock protein (HSP72) is expressed on the surface of human tumor cells, but not on normal cells. Int J Cancer 1995;61:272-9.
  42. Multhoff G, Mizzen L, Winchester CC, Milner CM, Wenk S, et al. Heat shock protein 70 (Hsp70) stimulates proliferation and cytolytic activity of NK cells. Exp Hematol 1999;27:1627-36.
  43. Clark PR and Ménoret A. The inducible hsp70 as a marker of tumor immunogenicity. Cell Stress & Chaperones 2001;6(2):121-5.
  44. Hosoi N, Itoh H, Koyama K, Tashima Y. Overexpression of the heat shock protein 70 confers protection against oxidative injury in HEPG2 cells. Transplant Proc 2002;34(7):2647-9.
  45. Wang JH, Yao MZ, Gu JF, Sun LY, Shen YF, Liu XY. Blocking HSF1 by dominant-negative mutant to senzitise tumor cells to hypertermia. Biochem Biophys Res Commun 2002;290(5):1454-61.
  46. Marja Jaattela. Overexpression of major heat shock protein hsp70 inhibits tumor necrosis factor-induced activation of phospholipase A2. The Journal of Immunology 1993;151:4286-94.
  47. Pockley A, de Faire U, Kiessling R, Lemne C, Thulin T, Frostegard J. Circulating heat shock protein antibody levels in established hypertension. Journal of Hypertension 2002;20:1-6.
  48. Rea IM, McNerlan S, Pockley AG. Serum heat shock protein and anti-heat shock protein antibody levels in aging. Experimental Gerontology 2001;36:341-52.
  49. Wright BH, Corton JM, El-Nahas AM, Wood RFM, Pockley AG. Elevated levels of circulating heat shock protein 70 (Hsp70) in peripheral and renal vascular disease. Heart and Vessels 2000;15:18-22.
  50. Chan YC, Shukla N, Abdus-Samee M, Berwanger CS, et al. Anti-heat-shock protein 70 kDa antibodies in vascular patients. Eur J Vasc Endovasc 1999;18:381-5.
  51. Portig I, Pankuweit S, Maisch B. Antibodies against stress proteins in sera of patients with dilated cardiomyopathy. J Mol Cell Cardiol 1997;29:2245-51.
  52. Prummel MF, van Pareren Y, Bakker O, Wiersinga WM. Anti-heat shock protein (hsp)72 antibodies are present in patients with Graves' disease (GD) and in smoking control subjects. Clin Exp Immunol 1997;110:292-5.
  53. Conroy SE, Faulds GB, Williams W, Latchman DS, Isenberg DA. Detection of autoantibodies to the 90 kDa heat shock protein in systemic lupus erythematosus and other autoimmun diseases. British Journal of Rheumatology 1994;33:923-6.
  54. Minota S, Cameron B, Welch WJ, Winfield JB. Autoantibodies to the constitutive 73-kD member of the hsp70 family of heat shock proteins in systemic lupus erythematosus. J Exp Med 1988;168:1475-80.
  55. Arora SK, Singh G, Sehgal S. Comparative evaluation of anti-heat shock protein antibodies in SLE and healthy controls. Scan J Rheumatol 1995;24:160-3.
  56. Hayem G, Bandt M, Palazzo E, Roux S, Eliaou JF, et al. Anti-heat shock protein 70 kDa and 90 kDa antibodies in serum of patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis 1999;58:291-6.
  57. Schwarz MJ, Riedel M, Gruber R, Ackenheil M, Müller N. Antibodies to heat shock proteins in schizophrenic patients: implications for the mechanism of the disease. Am J Psychiatry 1999;156:1103-4.
  58. Rauch SD, Zurakowski D, Bloch DB, Bloch KJ. Anti-heat shock protein 70 antibodies in Meniere's disease. The Laryngoscope 2000;110:1516-21.
  59. Shingai R, Maeda T, Onishi S, Yamamoto Y. Autoantibody against 70 kDa heat shock protein in patients with autoimmune liver diseases. J Hepatol 1995;23:382-90.
  60. Figueredo A, Ibarra JL, Rodroguez A, Molino AM, Gomez-de la Concha E, et al. Increased levels of IgA antibodies to hsp70 protein in patients with diabetes mellitus: the relationship with vascular complications. Ciln Immunol Immunopathol 1996;79(3):252-5.
  61. Ludwig D, Stahl M, Ibraham M, Wenzel B, Drabicki D, et al. Enhanced intestinal expression of heat shock protein 70 in patients with inflammatory bowel diseases. Dig Dis Sci 1999;44:1440-7.
  62. Goral J, Shenoy S, Mohanakumar T, Clancy J. Antibodies to 70 kD and 90 kD heat shock proteins are associated with graft-versus-host disease in peripheral blood stem cell transplant recipients. Clin Exp Immunol 2002;127(83):553-9.
  63. Roma P, Catapano AL. Stress Proteins and Atherosclerosis. Atherosclerosis 1996;127(2):147-54.
  64. Kocsis J, Veres A, Vatay Á, Duba J, Karadi I, et al. Antibodies against the human heat shock protein Hsp70 in patients with severe coronary artery disease. Immunol Invest 2002;31(3-4):219-31.
  65. Asea A, Kraeft SK, Jones EA, Stevenson MA, Chen LB, et al. Hsp70 stimulates cytokine production through a CD-14 dependent pathway, demonstrating its dual role as a chaperone and cytokine. Nature Medicine 2000;6(4):435-42.
  66. Vabulas RM, Ahmad-Nejad P, Ghose S, Kirschning CJ, Issels RD, Wagner H. Hsp70 as endogenous stimulus of the Toll/Interleukin-1 receptor signal pathway. Journal of Biol Chem 2002;277(17):15107-12.
  67. Prohászka Z, Singh M, Nagy K, Kiss E, Lakos G, et al. Heat-shock protein 70 is a potent activator of the human complement system. Cell Stress&Chaperones 2002;7(1):17-22.


Molecular biology of 70 kD heat shock protein and its role in certain immunological processes

Heat-shock proteins, or stress proteins play important role in cellular survival owning to their protective function. Their highly conserved structure renders them ideal messengers of cellular stress response. One of the best known representative of these proteins is the 70 kDa heat-shock protein (Hsp70), there is increasing amount of data about the intra- and extracellular functions of this stress protein. In the present review the regulation of hsp70 gene expression, and hsp70 polimorfisms, the possible impact of polymorphisms to certain diseases, and the multilevel relationship between Hsp70 and the immun response are discussed. The authors review the role of Hsp70 in anti-tumor immunity, and the presence of anti-Hsp70 antibodies and their possible association with certain diseases. Here they present some of their recent observations: they detected the presence of anti-hsp70 antibodies in all adult sera and found no correlation between these antibody levels and the presence of severe coronary heart disease. Recently we also showed, that human Hsp70 can activate the classical pathway of complement system in vitro, by direct binding of the first complement C1q.

Magy Immunol/Hun Immunol 2003;2(2):5-15.

Correspondence: DR. PROHÁSZKA ZOLTÁN: MTA-Semmelweis Egyetem, Anyagcsere-, Genetikai és Immunológiai és Atherosclerosis Kutatócsoport, valamint III. Sz. Belgyógyászati Klinika, 1125 Budapest, Kútvölgyi út 4., e-mail: prohoz@kut.sote.hu
 
tress protein, Hsp70, polymorphism, antibody, complement system