EREDETI KÖZLEMÉNY
A T-lymphocyták jelátvitelének változásai hyperglykaemia hatására
Boldizsár Ferenc, Berki Tímea, Miseta Attila, Németh Péter
 
 
 
 


DR. BOLDIZSÁR FERENC (levelező szerző), DR. BERKI TÍMEA, DR. NÉMETH PÉTER, Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Immunológiai és Biotechnológiai Intézet, 7624 Pécs, Szigeti út 12., telefon: (72) 536-288, fax: (72) 536-289, e-mail: fboldizsar@hotmail.com;
DR. MISETA ATTILA, Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Klinikai Kémiai Intézet

Magyar Immunol/Hun Immunol 2002;1 (2): 4-10.

Érkezett: 2001. október 1.
Elfogadva: 2002. április 22.



ÖSSZEFOGLALÁS

CÉLKITŰZÉS - Az utóbbi években egyre több megfigyelés mutatja, hogy diabetes mellitusban zavart szenved a különböző sejtek (vörösvérsejtek, thrombocyták, neutrophil granulocyták) intracelluláris kalcium-anyagcseréje. Ismert, hogy károsodik az immunrendszer működése is, fokozva az infekciók iránti fogékonyságot. Ezeknek az elváltozásoknak az oka még tisztázatlan. A szerzők megvizsgálták a diabetes mellitusban fennálló egyik kóros anyagcsere-tényező, a hyperglykaemia in vitro hatását az immunkompetens sejtekre (Jurkat-sejtek - humán T-sejtes leukaemia). Ehhez a sejteket különböző glükózkoncentrációjú tápfolyadékokban tenyésztették egy hétig, majd vizsgálták a sejtek citoplazmatikus kalciumszintjét, kalciumszignálját specifikus és nem specifikus aktiváció után, illetve jelátviteli fehérjék foszforilációját.

ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK - A citoplazmatikus kalciumszintet és annak időbeli változásait ionszelektív fluoreszcens indikátorral áramlási citométeren vizsgálták. Aktivációra ionomycint (nem specifikus aktivátor) és monoklonális anti-CD3 antitestet (OKT3, specifikus T-sejt-aktivátor) használtak. A jelátviteli fehérjék tirozinfoszforilációját monoklonális antifoszfotirozin-antitesttel, intracelluláris indirekt immunfluoreszcens jelöléssel szintén áramlási citométeren vizsgálták. A sejten belüli fehérjék glükozilációját a fruktózaminszint meghatározásával mérték.

EREDMÉNYEK - A hyperglykaemiás körülmények mellett tenyésztett Jurkat-sejtekben nőtt a nyugalmi citoszolikus kalciumszint a kontrollokhoz viszonyítva. A sejtek aktiválhatósága (kalciumszignál) mind ionomycinnel, mind monoklonális anti-CD3 antitesttel való stimulációt követően csökkent. A tirozinfoszforiláció mértéke a magasabb glükózkoncentráción tartott sejtekben monoklonális anti-CD3-antitest-aktiváció után alacsonyabb volt, mint a kontrollokban. A hyperglykaemia hatására a sejtek lizátumában (a kontrollokhoz viszonyítva) emelkedett a fruktózaminszint.

KÖVETKEZTETÉSEK - A hyperglykaemia károsítja a Jurkat-sejtek citoplazmatikus kalcium-homeosztázisát és jelátviteli funkcióit (kalciumszignalizáció, illetve tirozinfoszforiláció). Ennek hátterében a hyperglykaemia miatt fokozódó nem enzimatikus glükoziláció állhat, amely károsíthatja a kalcium-homeosztázis fenntartásában szereplő membránfehérjék (kalciumtranszport-fehérjék) és az intracelluláris jelátvivő fehérjék funkcióját.

hyperglykaemia, T-lymphocyták, citoszolikus kalcium, kalciumjel, tirozinfoszforiláció, nem enzimatikus glükoziláció


Régóta ismert, hogy diabetes mellitusban szenvedő betegek körében az egészségesekhez képest gyakoribbak (1) és súlyosabb lefolyásúak a légúti, húgyúti (2) és bőrfertőzések (3). Bár az immunológiai működés zavarának háttere összetett (4), bizonyított, hogy a jelenség hátterében 1-es típusú diabetes mellitus esetén T-sejt-funkció-változások állnak, például az interleukin-2 (IL-2) csökkent termelése és osztódási képessége (5), illetve a CD95-expresszió változása (6); 2-es típusú diabetes mellitusban pedig a neutrophil granulocyták jelátvitelének megváltozását figyelték meg (7, 8). Az 1-es típusú diabetesben szenvedők perifériás T-sejtjeiben csökkent p56lck-expressziót találtak, amely a CD3 komplex zéta-láncának hipofoszforilációjához vezet (9). Streptozotocin indukálta diabetes mellitusban szenvedő egereknél a peritonealis macrophagokban csökkent phagocytafunkciót írtak le (10). Mindezen eredmények ellenére még nem tisztázott a diabetes mellitusban fennálló immunológiai működészavar molekuláris háttere. A fokozódó oxidatív stressz (11) és a plazmafehérjék (12, 13), illetve intracelluláris fehérjék10 nem enzimatikus glükozilációja két olyan lehetséges biokémiai folyamat, amely a diabetesben fennálló sejtszintű és molekuláris károsodások mögött állhat.

Az extracelluláris glükózkoncentráció növekedése - a fehérjék öregedését felgyorsító előrehaladott glükozilációs végtermékek (advanced glycosilation end products, AGE) keletkezésén keresztül  fokozott, nem enzimatikus glükozilációhoz vezet (14).

Az utóbbi években egyre több szerző foglalkozott diabetes mellitus esetén a különféle sejttípusok (15, 16) [például: endothel-, szívizom- (17), vesetubulus-sejtek (18), perifériásideg-sejtek (19), thrombocyták (20) és B-lymphocyták (21)] intracelluláris kalcium-anyagcseréjének változásával, ami károsíthatja a sejtek működését is. Ezeknek az adatoknak az ellenére sem tisztázott még a pontos biokémiai kapcsolat a megváltozott kalcium-anyagcsere és az immunkompetens sejtek működészavara között.

Jelen munkánkban megvizsgáltuk a magas extracelluláris glükózkoncentráció hatásait az in vitro tenyésztett humán T-sejt-vonal (Jurkat) nyugalmi citoszolikus kalciumszintjére, az aktiváló szerekkel kiváltott kalciumjelére és tirozinfoszforilációjára. Modellünk előnye, hogy kizárhatók olyan egyéb tényezők, amelyek in vivo befolyásolhatják ezeket a paramétereket (életkor, gyógyszerek, vérnyomás, hormonok stb.).
 

Anyagok és módszer

Anyagok

Egy hétig tenyésztettünk Jurkat-sejteket (ATCC TIB 152, humán akut T-sejtes leukaemiából származók) RPMI 1640 (Sigma R 6504) + 10% FCS (fetal calf serum) (Gibco) tartalmú tápfolyadékban, amelyet glükózzal vagy fruktózzal egészítettünk ki. Kontrollként a hagyományos RPMI + 10% FCS-t használtuk, amelynek glükózkoncentrációja 11,1 mmol. Ezt egészítettük ki glükózzal vagy fruktózzal 16,6, 22,2, illetve 27,7 mmol-os koncentrációra. A médiumok glükózkoncentrációját a tenyésztés során ellenőriztük és fenntartottuk. A Fluo-3 AM-et (acetoxi-metilésztert) (Molecular Probes Cat. No. F-1242) Pluronic-F127-tel (Sigma P 2443) kiegészített DMSO-ban (dimetil-szulfoxidban) oldottuk fel, 1 mg/ml-es koncentrációban. Az elpusztult sejtek elkülönítésére 7-amino-aktinomycin D-t (7-AAD) (Sigma A 9400) használtunk. A sejtek aktiválására 1 mg/ml etil-alkoholos ionomycint (Sigma I 0634) vagy 1,3 mg/ml egér anti-humán CD3 monoklonális antitestet PBS-ben (phosphate buffered saline) (IgG2a izotípus, OKT3, Ortho Biotech Inc.) használtunk. A cyclosporin A-t (100 mg/ml) a Novartis Kft. bocsátotta rendelkezésünkre. A tirozinfoszforilációt monoklonális antifoszfotirozin-antitesttel (IgG2b izotípus, PY20 klón, Transduction Laboratories) mértük. Az intracelluláris jelöléshez 4%-os paraformaldehid-PBS-fixálást követően 0,1%-os szaponin (Sigma S 4521) + 0,1% BSA (Sigma A 2153) + 0,1% NaN3 tartalmú PBS-puffert (szaponinpuffer) használtunk. A sejteket 0,1% BSA (bovine serum albumin) + 0,1% NaN3 PBS-pufferben (PBS-BSA-azid puffer) mostuk. Az áramlási citometriás foszfotirozin-mérések előtt a mintákat 0,1%-os formalinos PBS-ben vettük fel. Minden más finomvegyszerünk a Sigma cégtől származott.
 

Sejtfeltöltés fluoreszcens indikátorral

A sejtek citoszolikus kalciumtartalmát ionszelektív fluoreszcens indikátor (Fluo-3 AM) segítségével mértük Minta és munkatársai (22, 23) nyomán. Röviden: 106 sejtet 100 mikrol RPMI + 10% FCS-ben oldott 10 mikromol Fluo-3 AM-mel inkubáltuk 30 percig szobahőmérsékleten, majd a sejtszuszpenziót felhígítottuk 10 ml RPMI + 10% FCS-sel és további 30 percig inkubáltuk. Végül egyszer mostuk a sejteket RPMI + 10% FCS-ben és azonnal lemértük a mintákat Becton Dickinson FacsCalibur áramlási citométeren a Cell Quest program segítségével. Meghatároztuk az 526 nm-en (FL1 csatorna) mérhető átlagos fluoreszcenciaintenzitást, amely arányos a sejtek citoszolikus kalciumszintjével.
 

7-amino-aktinomycin-D jelölés

Az elpusztult sejtek elkülönítésére 7-AAD jelölést alkalmaztunk (24). A nem életképes sejtek felveszik a 7-AAD-t és magas fluoreszcenciát mutatnak 647 nm-en (FL3 csatorna), ennek alapján elkülöníthetők az élőktől. A mérések során kizártuk az elpusztult sejtek adatait.
 

A kalciumjel követése áramlási citométeren

Az élő sejtek Fluo-3 AM fluoreszcenciaintenzitását 526 nm-en (FL1 csatorna) detektáltuk, ami arányos a citoszolikus kalciumszinttel (21). Az aktivációhoz ionomycint (25, 26) (1 mikrog/minta) - nem specifikus aktiválószer - vagy monoklonális anti-CD3 antitestet (27) (26 mikrog/minta) - specifikus T-sejt-aktivátor - használtunk, amely a CD3 molekula e alegységét ismeri fel (20 kD tömegű glikoprotein). Az alapfluoreszcencia lemérése után az aktiváló szert hozzáadtuk a mintákhoz, majd folytattuk a mérést további 100 vagy 400 másodpercig, ez lehetővé tette a citoszolikus kalciumszint (FL1 fluoreszcenciaintenzitás) időbeni változásának követését. Egymást követő időpontokban leolvastuk és statisztikailag értékeltük a fluoreszcenciaintenzitások átlagát. Ezeket az értékeket az alapfluoreszcencia-értékekhez viszonyítottuk, így a fluoreszcencia intenzitásának változásait kaptuk meg.
 

A cyclosporin A-kezelés

A Jurkat-sejteket különböző koncentrációjú cyclosporin A-val (CsA) kezeltük, majd mértük a sejtek nyugalmi citoszolikus kalciumszintjét és anti-CD3-kezelés utáni aktiválhatóságát (kalciumjelét). 5×105 sejtet inkubáltunk 60, illetve 80 mikrog/ml CsA jelenlétében vagy a nélkül (kontrollként) RPMI + 10% FCS-tartalmú médiumban 1 órán át [más in vitro rendszerekben, például Sacharomyces cerevisiae esetén hasonló nagyságrendű CsA-dózisokat alkalmaznak (28)].
 

Áramlási citometriás tirozinfoszforiláció-mérés

Mintánként 106 sejtet stimuláltunk 26 mikrog anti-CD3 antitesttel 1 ml RPMI + 10% FCS-ben egy percig, 37 °C-on. Ezután a mintákhoz jéghideg PBS-t adtunk és ülepítettük a sejteket (1000 rpm, 5 perc). Az intracelluláris indirekt immunfluoreszcens jelölést a Prussin és munkatársai által leírt módszerrel végeztük (29). Röviden: a sejteket 4%-os paraformaldehid PBS-sel fixáltuk 20 percig szobahőmérsékleten, egyszer mostuk PBS-ben, majd szaponinpufferrel permeabilizáltunk. A jelölés a monoklonális antifoszfotirozin antitesttel (0,5 mikrog/ml) 100 mikrol szaponinpufferben történt fél órán keresztül jégen. Ezután kétszer mostuk (1000 rpm, 5 perc) a mintákat szaponinpufferben, majd anti-egér-FITC ellenanyaggal (1 mikrog/ml) inkubáltuk a mintákat 100 mikrol szaponinpufferben 30 percig jégen. Végül kétszer mostuk szaponinpufferben, egyszer pedig PBS-BSA-azidban a mintákat és felvettük 0,1% formalin-PBS-ben. A tirozinfoszforilációt - fluoreszcenciaintenzitásként - áramlási citométeren mértük az FL1 csatornán.
 

Fruktózaminszint-mérés

A sejtfehérjék glikációját a sejtek 1 N NaOH-os lízisét követően a fruktózaminszint mérésével jellemeztük. A méréshez mintánként 3-5×106 sejtet használtunk fel, amelyeket előzőleg egy hétig különböző glükózkoncentrációk mellett tenyésztettünk. Miután a mintákat kétszer megmostuk PBS-ben, a pelletet 1 N NaOH-ban vettük fel és egy napig 4 °C-on inkubáltuk, majd a pH-t 1 N HCl-dal 7-7,4-re korrigáltuk. A minták fehérjetartalmát Bradford-módszerrel (30), fruktózamin-tartalmukat a Johnson által leírt nitro-terazolium-blue módszerrel (31) határoztuk meg.
 

A kalciumtartalom mérése

A sejtek teljes kalciumtartalmát lángfotometriával vizsgáltuk (Eppendorf EFOX 5060). Ehhez 107 sejtet PBS-ben mostunk, majd 1 ml kalciummentes PBS-ben vettük fel és tíz percig 15000 rpm-mel centrifugáltuk. A felülúszót leszívtuk és lemértük a minták "nedves" súlyát. A pelletet (körülbelül 100 mg) egy éjszakán keresztül Speed-Vac készülékkel (Savant SC 110) liofilizáltuk, majd lemértük a "száraz" súlyukat. Ezután 1 N HCl-ban feloldottuk a mintákat és lángfotometriával mértük a kalciumkoncentrációt.
 

Statisztika

A kezelések hatásait statisztikailag Student-féle t-teszttel vizsgáltuk. A p<0,05 értéket tekintettük szignifikánsnak.
 

Eredmények

A Jurkat-sejtek nyugalmi citoszolikus kalciumszintje
 

1. táblázat. A Jurkat-sejtek citoszolikus alap kalciumszintje hyperglykaemia hatására megemelkedik. A táblázatban négy mérés eredményeit, illetve az ebből számított átlagokat és a szórásokat tüntettük fel. Szignifikáns emelkedést (*p<0,05) tapasztaltunk a citoszolikus alap kalciumszintben a 27,7 mmol glükózkoncentráció mellett tenyésztett sejtekben, a kontrollhoz (11,1 mmol glükózkoncentráció) viszonyítva. 
 

Összehasonlítottuk az egy hétig emelt glükózkoncentrációjú tápfolyadékban tenyésztett Jurkat-sejtek nyugalmi citoszolikus kalciumszintjét a kontrollként használt, RPMI + 10% FCS-ben tartott sejtekével. A magasabb extracelluláris glükóztartalom koncentrációfüggő módon a citoszolikus kalciumszint (FL1-fluoreszcencia) növekedését idézte elő (1. táblázat). Statisztikai analízissel szignifikáns pozitív korrelációt találtunk a tenyésztő médium glükózkoncentrációja és a citoszolikus kalciumszint között. A sejtek teljes kalciumtartalmát is megmértük, de nem találtunk szignifikáns változást a kontrollhoz képest. (Teljes kalciumtartalom a kontrollnál 0,82 mmol; 16,6 mmol glükózkoncentráció mellett 0,73 mmol; 22,2 mmol glükózkoncentráció mellett 0,77 mmol; 27,7 mmol glükózkoncentráció esetén 0,72 mmol).
 

Aktiválhatóság

A hyperglykaemiás körülmények mellett tenyésztett Jurkat-sejtek a kontrollhoz viszonyítva megváltozott választ mutattak ionomycin, valamint anti-CD3-antitest-stimulációra (1. ábra). Ionomycin-stimulációt követően minden sejtcsoportban azonnali kalciumbeáramlást tapasztaltunk, de a hyperglykaemiás sejtek kalciumjelének amplitúdója alacsonyabb volt, mint a kontrolloké (1. ábra).
 

1. ábra. A kalciumjel változása hyperglykaemia hatására. a: A Jurkat-sejtek kalciumjele, ionomycin-kezelés után 100 másodpercig követve. Az y tengelyen feltüntetett értékek Fluo-3AM fluoreszcenciaintenzitásátlag-hányadosok. b: Jurkat-sejtek kalciumjele monoklonális anti-CD3-antitest-kezelést követően 400 másodpercig követve. c: A kalciumjel kialakulásához szükséges idő megnyúlik hyperglykaemiás közegben tartott sejtekben, anti-CD3-kezelést követően.

 

A T-sejtek jelátviteli képességét a TcR/CD3 komplexen keresztül kiváltható kalciumszignállal is jellemeztük. Hyperglykaemiás tenyésztés után nemcsak a kalciumbeáramlás amplitúdója csökkent anti-CD3-stimuláció után, hanem a jel kialakulásához szükséges idő is megnyúlt. A kontrollsejtekben az anti-CD3 hozzáadása után 23 s-mal kezdődött meg a kalciumbeáramlás, míg hyperglykaemiás sejtekben 16,6 mmol glükózkoncentrációnál 26 s, 22,2 mmol glükózkoncentrációnál 40 s, 27,7 mmol glükózkoncentrációnál 48 s múlva indult be a kalcium-jelátvitel.

Annak kizárására, hogy eredményeinket az ozmotikus stressz okozta volna, a fenti kísérleteket azzal a változtatással is elvégeztük, hogy a glükózt fruktózzal helyettesítettük a tenyésztő folyadékokban. Ilyen körülmények mellett nem kaptunk szignifikáns eltéréseket sem a nyugalmi kalciumszintben (FL1-intenzitások a kontrollnál 24,67; 16,6 mmol koncentrációjú fruktóz esetén 26,9; 22,2 mmol fruktóz esetén 22,36; 27,7 mmol koncentrációjú fruktóz esetén 25,23), sem pedig az aktivációra bekövetkező kalciumjelben.
 

A cyclosporin A-kezelés hatásai

A CsA ismert specifikus inhibitora a kalcineurinnak; ez a foszfatáz központi helyet foglal el a T-sejtek kalcium-kalmodulin jelátviteli rendszerében. A nyugalmi citoszolikus kalciumszint (FL1-fluoreszcencia) szignifikánsan magasabb volt a CsA-kezelt sejtekben, mint a kontrollokban (2. ábra), míg az anti-CD3-stimulációra bekövetkező kalciumbeáramlás (FL1-fluoreszcencia-intenzitás-változás) amplitúdója alacsonyabb volt a CsA-val kezelt sejtekben, a kontrollokhoz viszonyítva.
 

2. ábra. Jurkat-sejtek cyclosporin A-kezelése. a: A CsA-kezelt sejtekben koncentrációfüggő módon (CsA60: 60 mikrog/ml; CsA80: 80 mikrog/ml) növekszik a citoszolikus kalciumszint (FL1-fluoreszcencia - y tengely) a kontrollokhoz képest. Az értékek négy független kísérletből származó adatok átlagát és standard deviációját jelölik. A citoszolikus kalciumszint-növekedés szignifikáns volt (*p<0,05, **p<0,1). b: A CsA-val kezelt sejtek csökkent amplitúdójú kalciumjelet mutattak anti-CD3 monoklonális antitesttel végzett kezelést követően, a kezeletlenekhez képest.

 
 

Tirozinfoszforiláció

A kontroll-Jurkat-sejtek anti-CD3 monoklonális antitesttel végzett kezelése a tirozinfoszforiláció szignifikáns fokozódását okozta a nyugalmi állapothoz képest (2. táblázat). Ehhez képest a hyperglykaemiás körülmények mellett tenyésztett sejtekben aktiváció hatására csökkent tirozinfoszforilációt találtunk. A tenyésztő tápfolyadékok glükózkoncentrációja és az anti-CD3-stimulációra bekövetkező tirozinfoszforiláció mértéke között negatív korreláció állt fenn.
 

2. táblázat. Hyperglykaemiás Jurkat-sejtekben csökken a tirozinfoszforiláció mértéke az anti-CD3 monoklonális antitesttel végzett stimuláció után, a kontrollhoz (11,1 mmol glükózkoncentráció) viszonyítva. A táblázatban három egymástól független mérés adatait tüntettük fel, a belőlük számolt átlagokkal és a standard deviációval. Stimuláció hatására szignifikáns (*p<0,05) növekedést tapasztaltunk a kontrollsejtekben, illetve a 16,6 és 22,2 mmol glükózkoncentrációjú médiumokban tenyésztett sejtekben (**p<0,1). 
 

A fruktózamin-tartalom változása

Diabeteses betegeknél a fruktózaminszintet rutinszerűen alkalmazzák a plazmafehérjék glükoziláltsági fokának ellenőrzésére. A magas glükóztartalmú tápfolyadékokban tenyésztett sejtek fehérjelizátumainak fruktózamin-tartalma magasabb volt, mint a normoglykaemiás kontrolloké (3. ábra), és a fruktózaminszint pozitív korrelációt mutatott a médiumok glükózkoncentrációjával.
 

3. ábra. A különböző glükózkoncentrációjú tápfolyadékokban tenyésztett Jurkat-sejtek lizátumainak fruktózamin-tartalma. Az adatok négy független mérés átlagát és a standard deviációt reprezentálják.
 

Megbeszélés

Korábbi közlemények már foglalkoztak diabetes mellitusban szenvedő betegekből származó különféle sejttípusok (például: vörösvértest, thrombocyta, adipocyta, osteoblast, szívizom-, vázizom-, vese-, aorta-, máj-, artéria-, szemlencse-, perifériásideg-sejt, agyi szinaptoszóma-, retina- és pancreas-béta-sejtek) megváltozott intracelluláris kalciummetabolizmusával (15-21).

Kísérleteink azt mutatták, hogy Jurkat-sejtekben (humán T-sejtek) nőtt a nyugalmi citoszolikus kalciumszint, ha növeltük az extracelluláris glükózkoncentrációt. Emellett mérséklődött a sejtek aktiválhatósága mind ionomycinnel, mind anti-CD3 antitesttel végzett stimuláció esetén (csökkent a kalciumjel amplitúdója, megnyúlt a kalciumbeáramlás megindulásához szükséges idő). Mivel a sejt teljes kalciumtartalma nem növekedett, az eltéréseket csak a citoszolikus kalciumszintben végbement változások okozhatták.

Modellünk előnye, hogy a hyperglykaemia hatásait minden más körülményt azonosan tartva tudtuk vizsgálni, ami in vivo modelleknél nem lehetséges, hiszen ott nagyon sok tényező (életkor, gyógyszerek, a betegség fennállásának tartama, kísérő betegségek stb.) befolyásolhatja az adott paramétereket, és így nehéz ok-okozati kapcsolatot keresni a biokémiai elváltozások és a sejtfunkciók között.

Cooke és munkatársai (32), valamint Healy munkacsoportja (33) kimutatták, hogy anergiás B-sejtekben növekszik a nyugalmi citoszolikus kalciumszint, illetve a B-sejt-receptoron keresztüli stimulációra csökkent kalciumbeáramlással reagálnak a sejtek. Eredményeinket ezekkel az adatokkal összevetve felvetődik, hogy a hyperglykaemia a T-sejteknél anergiához hasonló állapotot idéz elő.

Adataink szerint a megnövelt glükózkoncentrációjú tápoldatokban tenyésztett Jurkat-sejtek lizátumainak magasabb a fruktózaminszintje, mint a kontroll. A nem enzimatikus glükoziláció olyan általános folyamat, amely elvileg minden szabad aminocsoporttal rendelkező fehérjén végbemehet, ezért nagyon valószínű, hogy a kalciumtranszportban és jelátviteli folyamatokban szerepet játszó fehérjék is károsodnak. Ezt támogatják azok az adatok, amelyek a vörösvértest-kalciumpumpa szignifikánsan csökkent aktivitását mutatták in vitro glükozilációt követően (34). Mivel a kalciumpumpa központi szerepet játszik a citoszolikus kalciumszint alacsonyan tartásában, érthető, hogy a csökkent aktivitás a kalciumszint növekedéséhez vezet.

Wilson és munkatársai kimutatták, hogy humán vörösvértesteken hyperglykaemia hatására megváltozik a sejtmembránlipidek szokásos eloszlása: míg a foszfatidilszerin (PS) általában a belső membránrétegben lokalizálódik, a hyperglykaemiás körülmények közt tartott vörösvértestekben a foszfatidilszerin a külső membránrétegben is megjelenik (35). A sejtmembrán struktúrájának ilyen megváltozása természetesen befolyásolhatja az ionok transzportját is, ami végső soron a kalciumszint emelkedéséhez vezethet.

A kémiai stressz hatására változhat a kalcineurin által regulált kalciumszekvesztráló fehérjék aktivitása, ami a sejten belüli kalciumraktárak kalciumfelvéte-
lének zavarához vezethet. Ezt a lehetőséget támasztja alá az, hogy ha a Jurkat-sejteket cyclosporin A-val kezeltük, emelkedett citoszolikus kalciumszintet tapasztaltunk. Ugyanakkor valószínűnek látszik az is, hogy a kalcineurin a CD3 komplexen keresztüli jelátvitelt is szabályozza (csökkent kalciumjel észlelhető anti-CD3-kezelés hatására, CsA-kezelés után).

Az általunk is használt anti-CD3 monoklonális antitest a T-sejtek felszínén található CD3 komplex e-láncához kötődik. Ezután a kinázok (Fyn, Lck, ZAP-70) tirozincsoportjai foszforilálódnak, majd a jelátvitel során proteinkináz C aktiválódik, foszfatidil-inozitol-trifoszfát és diacil-glicerol keletkezik (36). Kísérleteinkben megmutattuk, hogy hyperglykaemia hatására romlanak a Jurkat-sejtek CD3-on keresztüli jelátviteli folyamatai. Ez korrelál azokkal a korábbi kísérleti adatokkal, amelyek szerint 1-es típusú diabetes mellitusban szenvedő betegekből származó T-sejtek in vitro a lektinnel, illetve anti-CD3 antitesttel borított gyöngyökkel végzett stimulációra csökkent válaszképességet mutattak (5), továbbá azzal, hogy csökkent a p56lck-expresszió T-sejtekben. Eredményeink szerint a jelátviteli utak legkorábbi lépése, a tirozinfoszforiláció mértéke is alacsonyabb volt a hyperglykaemiás Jurkat-sejtekben anti-CD3-stimuláció után. A jelátviteli pályák romlásához hozzájárulhat a lipidstruktúra megváltozása (35) a sejtmembránban, mivel a jelátviteli fehérjék közül több a membránhoz horgonyozva található (37), így a membránlipid-mikrodomének öszszetételének változásai a fehérjék működésére is hatással lehetnek.

Összegezve úgy gondoljuk, hogy a hyperglykaemia a nem enzimatikus glükoziláció növekedéséhez vezet, s ez olyan kulcsfontosságú fehérjéket érinthet, amelyek a citoszolikus kalciumszint alacsonyan tartásában, valamint a jelátvitelben játszanak szerepet. E fehérjék csökkent funkciója a T-sejtek fiziológiás funkciójának romlásához, ezen keresztül az im-munválasz hatékonyságának csökkenéséhez vezethet.

Köszönetnyilvánítás

Köszönetet mondunk dr. Lustyik Györgynek és dr. Csutora Péternek a kézirat kritikus átolvasásáért és a munka során nyújtott hasznos tanácsaikért.

Irodalom

  1. Joshi N, Caputo GM, Weitekamp MR, Karchmer AW. Infections in patients with diabetes mellitus. New Engl J Med 1999; 341(25):1906-12.
  2. Patterson JE, Andriole VT. Bacterial urinary tract infections in diabetes. Infect Dis Clin North Am 1997;11(3):735-50.
  3. Gleckman RA, al Wawi M. A review of selective infections in the adult diabetic. Compr Ther 1999;25(2):109-13.
  4. Geerlings SE, Hoepelman AI. Immune dysfunction in patients with diabetes mellitus (DM). FEMS Immunol Med Microbiol 1999;26(3-4):259-65.
  5. De Maria R, Todaro M, Stassi G, Di Blasi F, Giordano M, Galuzzo A, et al. Defective T cell receptor/CD3 complex signalling in human type1 diabetes. Eur J Immunology 1994;24:999-1002.
  6. Giordano C, De Maria R, Stassi G, Todaro M, Richiusa P, Giordano M, et al. Defective expression of the apoptosis-inducing CD95 (Fas/APO-1) molecule on T and B cells in IDDM. Diabetologia 1995;38(12):1449-54.
  7. Alexievicz JM, Kumar D, Smogorzewski M, Massry SG. Polymorphonuclear leukocytes in non-insulin dependent diabetes mellitus: abnormalities in metabolism and function. Ann Intern Med 1995;123(12):919-24.
  8. Fóris G, Paragh Gy, Dezső B, Keresztes T, Balogh Z, Szabó J. Altered postreceptor signal transduction of formyl-met-leu-phe receptors in polymorphonuclear leukocytes of patients with non-insulin dependent diabetes mellitus. Clin Immun and Immunopath 1998;86(1):95-101.
  9. Nervi S, Atlan-Gepner C, Kahn-Perles B, Lecine P, Vialettes B, Imbert J, et al. Specific deficiency of p56lck expression in T lymphocytes from type 1 diabetic patients. J. Immunology 2000;165:5874-83.
  10. Liu BF, Miyata S, Kojima H, Uriuhara A, Kusunoki H, Suzuki K, et al. Low phagocytic activity of resident peritoneal macrophages in diabetic mice. Relevance to the formation of advanced glication end products. Diabetes 1999;48:2074-82.
  11. Baynes JW. Role of oxidative stress in development of complications in diabetes. Diabetes 1991;40:405-12.
  12. Duell PB, Oram JF, Bierman EL. Nonenzymatic glycosylation of HDL and impaired HDL-receptor-mediated cholesterol efflux. Diabetes 1991;40:377-84.
  13. Li YM. Glycation ligand binding motif in lactoferrin. Implications in diabetic infection. Adv Exp Med Biol 1998;443:57-63.
  14. Brownlee M, Cerami A, Vlassara H. Advanced glycosylation end products in tissue and the biochemical basis of diabetic complications. New Engl J Med 1988;318(20):1315-21.
  15. Levy J. Abnormal cell calcium homeostasis in type 2 diabetes mellitus: a new look on old disease. Endocrine 1999;10(1):1-6.
  16. Resnick LM. Calcium metabolism in hypertension and allied metabolic disorders. Diabetes Care 1991;14(6):505-20.
  17. Lagadic-Gossmann D, Buckler KJ, Le Prigent K, Feuvray D. Altered Ca2+ handling in ventricular myocytes isolated from diabetic rats. Am J Physiol 1996;270:1529-37.
  18. Symonian M, Smogorzewski M, Marcinkowski W, Krol E, Massry SG. Mechanisms through which high glucose concentration raises [Ca2+]i in renal proximal tubular cells. Kidney Int 1998;54(4):1206-13.
  19. Kamei J, Taki K, Ohsawa M, Hitosugi H. Modulation of the formalin-induced nociceptive response by diabetes: possible involvement of intracellular calcium. Brain Res 2000;862(1-2):257-61.
  20. Ishii H, Umeda F, Hashimoto T, Nawata H. Increased intracellular calcium mobilisation in platelets from patients with type 2 (non-insulin dependent) diabetes mellitus. Diabetologia 1991;34(5):332-6.
  21. Alexievicz JM, Kumar D, Smogorzewski M, Massry SG. Elevated cytosolic calcium and impaired proliferation of B lymphocytes in type 2 diabetes mellitus. Am J Kidney Disease 1997;30(1):98-104.
  22. Minta A, Kap JP, Tsien RY. Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores. J Biol Chem 1989;264:8171-8.
  23. Gergely L, Cook L, Agnello V. A simplified method for Ca flux measurement on isolated human B cells that uses flow cytometry. Clin Diag Lab Immunol 1997;4:70-4.
  24. Schmid I, Krall WJ, Uittenbogaart CH, Braun J, Giorgi JV. Dead cell discrimination with 7-aminoactinomycin D in combination with dual colour immunofluorescence in single laser flow cytometry. Cytometry 1992;13:204-8.
  25. Mason MJ, Grinstein S. Ionomycin activates electrogenic Ca2+ influx in rat thymic lymphocytes. Biochem J 1993;296:33-9.
  26. Morgan AJ, Jacob R. Ionomycin enhances Ca2+ influx by stimulating store-regulated action entry and not by a direct action at the plasma membrane. Biochem J 1994;300:665-72.
  27. Adair JR, Athwal DS, Bodmer MW, Bright SM, Collins AM, Pulito VL, et al. Humanisation of the murine anti-human CD3 monoclonal antibody OKT3. Hum Antibodies Hybridomas 1994;5(1-2):41-7.
  28. Miseta A, Fu L, Kellermayer R, Buckley J, Bedwell DM. The Golgi apparatus plays a significant role in the maintenance of Ca2+ homeostasis in the vps33D vacuolar biogenesis mutant Sacharomyces cerevisiae. J Biol Chem 1999;274(9):5939-47.
  29. Prussin C, Metcalfe DD. Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine antibodies. J Immunol Methods 1995;188:117.
  30. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein. Anal Biochem 1976;72:248.
  31. Johnson RN, Metcalf PA, Baker JR. Relationship between albumin and fructosamine concentration in diabetic and non-diabetic sera. Clin Chim Acta 1987;164(2):151-162.
  32. Cooke MP, Heath AW, Shokat KM, Zeng Y, Finkelman FD, Linsley PS, et al. Immunoglobulin signal transduction guides the specificity of B cell-T cell interactions and is blocked in tolerant self reactive B. Cells J Exp Med 1994;179:425-38.
  33. Healy JI, Dolmetsch RE, Timmerman LA, Cyster JG, Thomas ML, Crabtree GR, et al. Different nuclear signals are activated by the B cell receptor during positive versus negative signalling. Immunity 1997;6:419-28.
  34. Gonzalez Flecha FL, Castello PR, Gagliardino JJ, Rossi JPFC. Molecular characterisation of the glycated plasma membrane calcium pump. J Membrane Biol 1999;171:25-34.
  35. Wilson MJ, Richter-Lowney K, Daleke DL. Hyperglykaemia induces a loss of phospholipid asymmetry in human erythrocytes. Biochemistry 1993;32:11302-10.
  36. Kane LP, Lin J, Weiss A. Signal transduction by the TCR for antigen. Curr Opin Immunol 2000;12:242-9.
  37. Ilanguraman S, He HT, Hoessli DC. Microdomains in lymphocyte signalling: beyond GPI-anchored proteins. Imm Today 2000;21(1):2-4.


Changes in the signal transduction of T-lymphocytes caused by hyperglycemia

AIMS - Lately the altered calcium balance of different cell types (eg.: erythrocytes, platelets, neutrophil granulocytes) was described in diabetes mellitus. It is also known that patients with diabetes mellitus suffer from various infections more often then healthy individuals because of immunological malfunctions. But the mechanism of these changes is still unclear. In order to investigate the effect of hyperglycemia on the function of immunocompetent cells we established an in vitro diabetes model by culturing human T cells (Jurkat cells) at different glucose concentrations for one week. Then we measured the basal cytosolic calcium level, the calcium signal after ionomycin or anti-CD3 treatment and the tyrosine-phosphorylation of signal transducing proteins as well as the fructosamine level of cellular proteins.

MATERIALS AND METHOD - Cytosolic free calcium levels were detected by flow cytometry using ion selective fluorescent indicator (Fluo-3 AM). Calcium signals of Jurkat cells were measured after ionomycin or monoclonal anti-CD3 antibody (OKT3) treatment. We also measured the tyrosine-phosphorylation on flow cytometer after anti-CD3 stimulation using indirect immunfluorescent labeling with monoclonal anti-phospho-tyrosine antibody. The non-enzymatic glycation of cellular proteins was determined by measuring the fructosamine levels of cell lysates.

RESULTS - The higher concentration of extracellular glucose resulted in concentration-dependent elevation of basal cytosolic free calcium level in Jurkat cells. Reduced calcium signal (activation capacity) was measured either after ionomycin or monoclonal anti-CD3 antibody treatments in cells kept at hyperglycemic conditions. In addition, the time kinetics of calcium signal following anti-CD3 activation was found prolonged in the hyperglycemic cells. The tyrosine-phosphorilation of hyperglycemic Jurkat cells also proved to be impaired. High glucose concentrations in tissue culture medium caused increase in the glycation of T-cell proteins.

CONCLUSIONS - We propose that increased glycation of proteins involved in calcium transport and/or intracellular signal transduction of T-cells may account for our observations.
 
Magy Immunol/Hun Immunol 2002;1(2):4-10.

Correspondence: DR. BOLDIZSÁR FERENC, Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Immunológiai és Biotechnológiai Intézet, 7624 Pécs, Szigeti út 12., telefon: (72) 536-288, fax: (72) 536-289, e-mail: fboldizsar@hotmail.com
 
hyperglycemia, T-lymphocytes, cytosolic calcium, calcium signal, tyrosine-phosphorilation, non-enzymatic glycation