EREDETI KÖZLEMÉNY
Az anti-CD44-immunterápia sejtbiológiai vonatkozásai
Gál István, Glant T. Tibor, Mikecz Katalin
 
 
 
 

Dr. Gál István, Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum, III. Sz. Belgyógyászati Klinika, Debrecen és Rush University at Rush-Presbyterian-St. Luke's Medical Center, Department of Orthopedic Surgery, Section of Biochemistry and Molecular Biology, Chicago, Illinois, USA;
Dr. Glant T. Tibor, Dr. Mikecz Katalin (levelező szerző) Rush University at Rush-Presbyterian-St. Luke's Medical Center, Department of Orthopedic Surgery, Section of Biochemistry and Molecular Biology, 1653 W. Congress Parkway, 60612, IL, Chicago, USA, telefon: (1)-312-942-5767, fax: (1)-312-942-8828, e-mail: kmikecz@rush.edu

Magyar Immunol/Hun Immunol 2002;1 (1): 21-25.

Érkezett: 2001. szeptember 17.
Elfogadva: 2001. december 10.



ÖSSZEFOGLALÁS

BEVEZETÉS - A CD44 molekula - a fiziológiás hialuronsav-receptor - a gyulladásos leukocytainfiltráció egyik kulcsfontosságú adhéziós mediátora. Állatkísérletekben autoimmun jellegű ízületi gyulladásos folyamatokban alkalmazva a parenteralis anti-CD44-antitest-kezelés drámai gyulladáscsökkentő hatású, ugyanakkor nagy dózisban akut leukopeniát okoz. A szerzők ezen jelenség sejtbiológiai magyarázatát szeretnék feltárni jelen tanulmányukban.

Módszerek - Vizsgálati módszereik között szerepelnek a Western blot, az immunprecipitáció, sejtadhéziós tesztek, áramlásikamra-vizsgálatok (a leukocyták guruló mozgására), valamint a cytoskeleton fluoreszcens jelölését követő mikroszkópos vizsgálat.

Eredmények - A CD44-et expresszáló leukocyták adhéziója az immobilizált hialuronsavhoz nem jár alapvető sejtmorfológiai eltérésekkel. Immobilizált anti-CD44 antitesten inkubálva viszont a sejtek szétterülnek, aktincytoskeletonjuk reorganizálódik, a sejtek a felszínre szorosan letapadnak. Ezek hátterében szignáltranszdukciós mechanizmusokat vizsgálva azt tapasztalták, hogy az anti-CD44-gyel történő kapcsolódás a sejten belül cytoskeletalis regulátor proteineken - mint ezrin, ankirin, spektrin, fokális adhéziós kináz - keresztül a CD44, s így általában a sejtmembrán aktincytoskeletonnal való fokozott asszociációjához vezet. A sejtek erős adhéziója az immobilizált anti-CD44-hez meggátolja a sejtek azon, hialuronsav-CD44-mediálta guruló (rolling) mozgását is, amivel megközelítik a gyulladás helyét, mielőtt átvándorolnának az érfalon.

Következtetés - A kapott eredmények az anti-CD44 antitest gyulladásgátló hatásának magyarázatához szolgálhatnak adalékul. Ezen és más kutatók által közölt eredményekre alapozva az anti-CD44 antitest a biológiai antireumatikus terápia egyik potenciális fegyverévé válhat.

CD44, sejtadhézió, aktincytoskeleton, hialuronsav, anti-CD44 antitest


A CD44 sejtfelszíni transzmembrán adhéziós molekula, amely az emlősök szervezetének számtalan sejttípusán fellelhető, például leukocytákon, endothelsejteken, fibroblastokon, illetve tumorsejteken is (1). A molekula fő fiziológiás ligandja a hialuronsav (2), ami az extracelluláris mátrix egyik fő glükózaminoglikán komponense.

A CD44 - mint a sejtmigráció irányítója - többféle alapvető biológiai folyamatban vesz részt, így az embryomorphogenesisben (3), a szöveti szerkezetváltozásokban (remodelling) (4), a lymphohaematopoesisben (1), a leukocyták aktivációjában (5), a gyulladás területére való eljutásukban (6-8), valamint az angiogenesisben (9) és a tumormetasztázisok képződésében is (8, 10).

Korábbi tanulmányainkban számoltunk be arról, hogy egérmodellt használva proteoglikán- vagy kollagénindukálta arthritis esetén a parenteralisan alkalmazott anti-CD44 antitesttel (IM7) végzett kezelés az arthritises aktivitást drámai módon csökkenti, ami az arthritises ízületek duzzanatának mérséklésében, valamint a leukocytainfiltráció eltűnésében mutatkozik meg (6, 11). Ugyanakkor a parenteralis anti-CD44-kezelés gyulladáscsökkentő hatását egyéb autoimmun kórképekben is sikerült igazolni, például experimentális encephalomyelitisben (12) és 1-es típusú diabetes mellitus állatmodelljében (13). Saját újabb kísérleteinkben az arthritises állatok nagy dózisú IM7-kezelése során a gyors terápiás hatás mellett akutan fellépő leukopeniát tapasztaltunk (Mikecz K., nem közölt adatok). Jelen tanulmányunkban az anti-CD44-kezelésnek a sejtadhézióra kifejtett hatását vizsgáljuk.
 

Anyagok és módszerek

Reagensek, antitestek

Az általunk használt humán, köldökzsinór eredetű hialuronsav gyártója az ICN (USA). Anti-CD44 egérantitesteket termelő IM7 és KM81 patkányhybridomákat az American Type Culture Collectiontől szereztük be (ATCC, USA). Az antitest tisztítását és biotinilálását a korábban leírtak szerint végeztük (14). Immunprecipitációs és egyéb immundetekciós kísérletekhez ezrin-, spektrin-, talin-, RhoGDI- és fokális adhéziós kináz (FAK) elleni antitesteket (Santa Cruz, USA), antiankirin antitestet (Calbiochem, USA), fluoreszcein-izotiocianáttal (FITC) és phyco-erythrinnel (PE) -konjugált streptavidint (Pharmin-gen, USA), tormaperoxidáz-konjugált streptavidint (Zymed, USA), TRITC-phalloidint (Sigma, USA), protein-G-szefarózt (Amersham-Pharmacia, USA) és tisztított patkány-IgG-t (Sigma, USA) használtunk.

Sejtadhéziós vizsgálatok

In vitro vizsgálatainkhoz CTLL-2 sejteket - egy IL-2-dependens CD44-negatív egér T-sejt-vonalat - az ATCC-től szereztük be. A CTLL-2-sejtek stabil transzfekción estek át a teljes vad típusú CD44-et kódoló cDNS-konstrukttal (CTLL-2/CD44WT) (14), míg az eredeti sejtvonalat negatív kontrollként használtuk.

A sejtadhéziós vizsgálatokat a korábbiakban leírtaknak megfelelően végeztük (14). A módszer röviden: a hialuronsavat 250µg/ml-es, az IM7 anti-CD4 antitestet 25 µg/ml-es koncentrációban, karbonát pufferben (15 mmol Na2CO3, 35 mmol NaHCO3, pH 9,6) immobilizáltuk műanyag sejttenyésztő edényekben. A sejteket 5, 15, illetve 30 percig inkubáltuk a felszínen. A sejtülepedés felgyorsítására rövid centrifugálást végeztünk, 800-szoros g mellett.
 

Áramlásikamra-vizsgálatok

A leukocyták guruló mozgásának vizsgálatára áramlási kamrát használtunk (Parallel Plate Flow Chamber, Glycotech, USA). A folyadékáramlást infúziós pumpával tartottuk fenn (Model 22, Harvard Inc., USA). A fiziológiás tartományba eső áramlás nyíróereje 2 dyn/cm2 volt, amit esetenként 0,1 és 30 dyn/cm2 között változtattunk. A rendszert a kísérlet ideje alatt 37 °C-on tartottuk. Az immobilizált hialuronsav koncentrációja 200 µg/ml, az IM7 anti-CD44 antitesté 25 µg/ml volt. A videofelvételek
analízisét Metaview szoftverrel (Fryer Co., USA) végeztük.
 

Az aktincytoskeleton jelölése

Az aktincytoskeleton megjelölése előtt a sejteket hialuronsav (500 µg/ml) vagy IM7 (250 µg/ml) megszárított cseppjein 30-120 percig inkubáltuk eltávolítható üvegkamrás tárgylemezeken (Nunc, USA), majd 10%-os formaldehiddel fixáltuk és 0,2%-os Triton X-100-zal permeabilizáltuk, a korábban közöltek alapján (14). Harmincperces TRITC-phalloidin-kezelést követően a phalloidinnel jelölt aktincytoskeletont Nikon Microphot epifluoreszcens mikroszkóp alatt vizsgáltuk.
 

Immunprecipitáció és Western blot

Az immobilizált hialuronsavon és anti-CD44-en történő adhéziós inkubációs periódust sejtlízis követte, 0,1% nátrium-dodecil-szulfát, 1% Nonidet-P40, 0,2% nátrium-deoxikolát, 150 mmol NaCl, 50 mmol TRIS (pH 8,0) összetételű pufferrel, proteinázinhibitorok jelenlétében. A sejtlizátumok ekvilibrációját a fehérjetartalom alapján, BCA protein esszé kit (Pierce) segítségével végeztük. A lizátumokból mintánként 5 µg antitesttel végeztük az immunprecipitációt. Protein-G-szefarózt használtunk a precipitátumok megkötésére. A proteineket erről, extenzív mosást követően, elektroforézis-mintapufferben történő forralással eluáltuk. A poliakrilamidgél-elektroforézist Mini-Protean II apparátussal (Bio-Rad, Hercules, CA) végeztük. Ezt követte a minták átvitele nitrocellulóz membránra (Bio-Rad), valamint immunoblot, amelyhez biotinilált KM81 anti-CD44 antitestet használtunk. A blottolt fehérjéket ECL reagensek és Hyperfilm ECL (Amersham-Pharmacia) segítségével mutattuk ki.
 

Eredmények

Sejtadhézió immobilizált CD44-szubsztrátokhoz

A vad típusú CD44-et hordozó CTLL sejtek (CTLL/CD44WT) immobilizált anti-CD44 antitesten fáziskontraszt mikroszkóppal vizsgálva egy óra inkubáció után szétterülnek, sötétté válnak, látszólagos méretük megnő, alakjuk irregulárissá válik. Az immobilizált hialuronsavon inkubált sejteknek nincsenek morfológiai eltéréseik, a sejtek kicsik, gömbölyűek, világosak (1. ábra).
 

1. ábra. Fáziskontraszt mikroszkópos felvétel immobilizált CD44-szubsztrátokon inkubált sejtekről. 
a: Az immobilizált hialuronsavon a sejtek megtartják gömbölyű alakjukat, fényesek, kicsik. 
b: Az anti-CD44 antitesten azonban a sejtek szétterülnek, méretük látszólag megnő, alakjuk irregulárissá válik, sötétek.

 
 

Áramlásikamra- és sejtrolling kísérletek különböző CD44-ligandokkal

A vad típusú CD44-et expresszáló CTLL sejtek immobilizált hialuronsavon - rövid ülepítést követően - nagy arányban végeznek guruló (rolling) mozgást (az áramlás erősségétől függően 30-100%-ban) a folyadékáramlási viszonyok fiziológiás tartományban tartása mellett (2. a ábra). Ugyanakkor, immobilizált anti-CD44-en a sejtek szorosan a felszínre tapadnak a folyadékáramlás széles tartományain belül, s guruló mozgást nem végeznek (2. b ábra). Negatív kontrollként CD44-et nem expresszáló sejtek szolgáltak, amelyek hialuronsavon guruló mozgást nem végeznek, a felszínhez nem tapadnak, s emiatt a folyadékáramlás magával sodorja őket (2. c ábra).
 

2. ábra. Átfedő ábra különböző CD44-szubsztrátokon ülepített, 2 dyn/cm2 erősségű folyadékáramlásnak kitett sejtek viselkedéséről. A sejtek kiindulási állapotát (áramlás előtt) piros színnel, a végállapotot (áramlás után) zölddel jelöltük. A helyzetüket nem változtató sejtek sárgák, mivel a két szín esetükben keveredik. 
a: Vad típusú CD44-et expresszáló sejtek jelentős része immobilizált hialuronsavon guruló mozgást végezve a helyzetét változtatja, tehát mind piros, mind zöld sejtek láthatók.
b: Immobilizált anti-CD44-en a letapadt sejtek mozgást nem végeznek, ezért az ábrán csak átfedő színű (sárga) sejteket látunk. 
c: A CD44-et nem expresszáló sejteket az áramlás elsodorja, emiatt csak a kiindulási állapotnak megfelelő piros színű sejteket látunk a képen.

 

Aktincytoskeleton-mintázat

TRITC-phalloidin jelöléssel az immobilizált hialuronsavon inkubált sejtek aktincytoskeletonja csaknem homogén eloszlású a sejten belül. Immobilizált anti-CD44-en inkubált sejtek aktincytoskeletonja reorganizálódik, a sejtek membránkitüremkedéseiben (lamellipodiumok, filopodiumok) akkumulálódik (3. ábra).
 

3. ábra. Aktincytoskeleton-jelölés TRITC-phalloidinnel. 
a: Az immobilizált hialuronsavon inkubált sejtek aktincytoskeletonja homogén submembranosus eloszlású 
b: Az anti-CD44-en inkubált sejtekben az aktin reorganizálódik, s membránkitüremkedésekben dúsul fel, mint lamellipodiumok (nyíl) és 
c: filopodiumok (nyíl).

 

Asszociáció az aktincytoskeleton regulációjában részt vevő molekulákkal

Koimmunprecipitációval vizsgálva a hialuronsavon inkubált sejtekben a CD44 kevéssé kapcsolódik az ezrinnel, ankirinnel, spektrinnel, amelyek az aktincytoskeletonnal közvetlen kapcsolatban lévő, arra szabályozó hatást kifejtő proteinek (15, 16). Hasonló alapszintű asszociáció figyelhető meg a CD44 és az integrinszignalizációban részt vevő fokális adhéziós kináz (FAK) és talin között (17). A cytoskeletalis regulációban ugyancsak részt vevő Rho proteinek (18) GDP-diszszociációjának gátló faktora, a Rho-GDI asszociációja (19) is kis mértékű a CD44-gyel és a CD44-hez kapcsolódó ezrinnel, immobilizált hialuronsavon inkubált sejtekben. A fenti molekulák immobilizált anti-CD44 antitesten inkubált sejtekben igen kifejezett asszociációs hajlamot mutatnak a CD44-gyel (4. a ábra). Ezen intermolekuláris kölcsönhatások megelőzik a sejtmorfológiai változásokat, mivel már ötperces inkubáció után is észlelhetőek.
 

4. ábra. Az ezrin, az ankirin, a spektrin, a FAK és a Rho-GDI koimmunoprecipitációja CD44-gyel. 
a: Valamennyi molekula asszociációjának mértéke jelentősen megnő immobilizált anti-CD44-en inkubált sejtekben, az immobilizált hialuronsavon inkubált sejtekhez hasonlítva. 
b: Ezrin-CD44 koimmunoprecipitáció sejtlizátumban. 
HS: hialuronsav, IM7: anti-CD44 antitest, IP: immunprecipitáció, FAK: fokális adhéziós kináz, RhoGDI: a Rho proteinek GDP-disszociációjának inhibitora

 

Érdekes módon azt találtuk, hogy az ezrin és a CD44 közötti kapcsolódás nem igényel aktív közreműködést a sejt jelátviteli apparátusa részéről, mivel a jelenséget mind intakt, élő sejtek, mind pedig sejt-lizátumok anti-CD44-en inkubálása során észleltük (4. b ábra).
 

Megbeszélés

Izolált in vitro rendszerekben néhány irodalmi adat rendelkezésre áll a hialuronsav (16, 20) és az anti-CD44 antitest (21) célsejtre kifejtett hatásairól, bár az indukált szignáltranszdukciós mechanizmusok kevéssé ismertek. A CD44 két ligandja, a hialuronsav és az anti-CD44 hatásának összehasonlításáról jelenleg csak morfológiai vonatkozású adat áll rendelkezésünkre (14). Célunk volt tehát a két ligand sejtbiológiai hatásainak összehasonlítása, különös tekintettel az aktincytoskeletont érintő szignáltranszdukciós mechanizmusokra, valamint ezen változások morfológiai és funkcionális következményeire, szem előtt tartva az anti-CD44 in vivo rendszerekben kifejtett hatásait.

Eredményeink szerint az immobilizált anti-CD44-en inkubált sejtekben a CD44 bizonyos, az aktincytoskeletonnal kölcsönható molekulákkal (ezrin, ankirin, spektrin) (15, 16) nagy asszociációs hajlamot mutat. Hasonló mondható el az integrinfunkciók regulációjában részt vevő talinról és a fokális adhéziós kinázról is, ami felveti integrinmediált mechanizmusok (17) aktiválódását is anti-CD44-kezelés esetén, s így a CD44 és integrin eredetű szabályozó mechanizmusok sejten belüli keveredésére adhat módot. A Rho-GDI részvétele a multimolekuláris asszociációkban a cytoskeletonkontrollban széles körű szereppel bíró Rho típusú GTP-ázok (18) érintettségére utal az anti-CD44-kezelés kapcsán kialakuló magasabb szintű aktincytoskeleton-organizációban. Mivel az anti-D44-kezelés a fenti protein-protein asszociációkat öt percen belül képes kiváltani, ezzel lehetőséget ad a gyors és dinamikus cytoskeletonszabályozásra.

Az a tény, miszerint a fenti szignálesemények nem igénylik a sejt életképességét, hiszen sejtlizátumban is megfigyelhetők, arra utal, hogy a CD44-mediált molekuláris szintű interakciók pusztán a CD44-nek a liganddal történő kapcsolódása során bekövetkező - az anti-CD44 esetében valószínűleg radikális - konformációváltozás következményei.

Immobilizált hialuronsavon inkubált sejtek és immobilizált anti-CD44-en inkubált sejtek között egy óra távlatában drámai morfológiai különbségeket tapasztalhatunk. Mindezek hátterében a kétféle CD44-ligand (hialuronsav és anti-CD44) aktincytoskeletonra kifejtett közvetett reguláló hatása közti különbségek állhatnak. Ugyanakkor a kétféle ligand sejtszintű hatása közötti különbség akkor is megmutatkozik, amikor a sejteket egy in vivo közeli rendszerben, azok guruló mozgása közben tanulmányozzuk. Mivel ez a típusú, a CD44 és a hialuronsav interakciója által mediált mozgás előzi meg a leukocyták gyulladásos régióba való emigrációját (22), felmerül, hogy az anti-CD44-kezelés egyik támadáspontja ez lehet.

Konklúzióként jelen tanulmányunkban a cytoskeleton-plazmamembrán interakciók jellegzetességeinek különbségeire világítunk rá, lymphoid sejtek különböző típusú CD44-ligandokkal - immobilizált hialuronsav és anti-CD44 antitest - való kezelése során. Eredményeink szerint az anti-CD44 antitest nagyfokú aszszociációt vált ki a CD44 és olyan fehérjék között, amelyek a CD44 és az aktincytoskeleton kölcsönhatását segítik vagy regulálják. Ez a jelenség részben magyarázhatja a parenteralis anti-CD44-kezelés kifejezett antiinflammatórikus hatását, amennyiben az antitest a célsejtek cytoskeletonjának masszív átrendeződését, s a sejtek mobilitását, így migrációs aktivitását csökkentené. Ugyanakkor az is elképzelhető, hogy a sejtfelszínen kötődött anti-CD44-célsejtet más sejtekhez (például a CD44-et ugyancsak expresszáló endothelhez) keresztköti, kivonva ezzel az adott sejtet a cirkulációból. Ebbe a koncepcióba illeszkedhet az anti-CD44-kezelés során tapasztalható dózisfüggő leukopenia is, ami a felszínükön anti-CD44-et kötött leukocyták endothelhez való kitapadásának következménye lehet. A jelenség pontos mechanizmusának tisztázása a közeljövő feladata.

Irodalom

  1. Lesley J, Hyman R, Kincade PW. CD44 and its interaction with extracellular matrix. Adv Immunol 1993;54:271-335.
  2. Aruffo A, Stamenkovic I, Melnick M, Underhill CB, Seed B. CD44 is the principal cell surface receptor for hialuronate. Cell 1990;61:1303-13.
  3. Wheatley SC, Isacke CM, Crossley PH. Restricted expression of the hialuronan receptor, CD44, during postimplantation mouse embryogenesis suggests key roles in tissue formation and patterning. Development 1993;119:295-306.
  4. Yamazaki M, Nakajima F, Ogasawara A, Moriya H, Majeska RJ, Einhorn TA. Spatial and temporal distribution of CD44 and osteopontin in fracture callus. J Bone Joint Surg Br 1999;81:508-15.
  5. Lesley J, Howes N, Perschl A, Hyman R. Hialuronan binding function of CD44 is transiently activated on T cells during an in vivo immune response. J Exp Med 1994;180:383-7.
  6. Mikecz K, Brennan FR, Kim JH, Glant TT. Anti-CD44 treatment abrogates tissue oedema and leukocyte infiltration in murine arthritis. Nat Med 1995;1:558-63.
  7. Halloran MM, Szekanecz Z, Barquin N, Haines GK, Koch AE. Cellular adhesion molecules in rat adjuvant arthritis. Arthritis Rheum 1996;39:810-9.
  8. Lesley J, Hyman R, English N, Catterall JB, Turner GA. CD44 in inflammation and metastasis. Glycoconj J 1997;14:611-22.
  9. Trochon V, Mabilat C, Bertrand P, Legrand Y, Smadja-Joffe F, Soria C, et al. Evidence of involvement of CD44 in endothelial cell proliferation, migration and angiogenesis in vitro. Int J Cancer 1996;66:664-8.
  10. Herrlich P, Zoller M, Pals ST, Ponta H. CD44 splice variants: metastases meet lymphocytes. Immunol Today 1993;14:395-9.
  11. Mikecz K, Dennis K, Shi M, Kim JH. Modulation of hialuronan receptor (CD44) function in vivo in a murine model of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 1999;42:659-68.
  12. Brocke S, Piercy C, Steinman L, Weissman IL, Veromaa T. Antibodies to CD44 and integrin alpha4, but not L-selectin, prevent central nervous system inflammation and experimental encephalomyelitis by blocking secondary leukocyte recruitment. Proc Natl Acad Sci 1999;96:6896-901.
  13. Weiss L, Slavin S, Reich S, Cohen P, Shuster S, Stern R, et al. Induction of resistance to diabetes in non-obese diabetic mice by targeting CD44 with a specific monoclonal antibody. Proc Natl Acad Sci 2000;97:285-90.
  14. Kim JH, Glant TT, Lesley J, Hyman R, Mikecz K. Adhesion of lymphoid cells to CD44-specific substrata: the consequences of attachment depend on the ligand. Exp Cell Res 2000;256:445-53.
  15. Tsukita S, Yonemura S. ERM (ezrin/radixin/moesin) family: from cytoskeleton to signal transduction. Curr Opin Cell Biol 1997;9:70-5.
  16. Bourguignon LY, Lokeshwar VB, Chen X, Kerrick WG. Hialuronic acid-induced lymphocyte signal transduction and HA receptor (GP85/CD44)-cytoskeleton interaction. J Immunol 1993;151:6634-44.
  17. Giancotti FG, Ruoslahti E. Integrin signaling. Science 1999;285:1028-32.
  18. Nobes CD, Hall A. Rho, rac, and cdc42 GTPases regulate the assembly of multimolecular focal complexes associated with actin stress fibers, lamellipodia, and filopodia. Cell 1995;81:53-62.
  19. Takahashi K, Sasaki T, Mammoto A, Takaishi K, Kameyama T, Tsukita S, et al. Direct interaction of the Rho GDP dissociation inhibitor with ezrin/radixin/moesin initiates the activation of the Rho small G protein. J Biol Chem 1997;272:23371-5.
  20. Entwistle J, Hall CL, Turley EA. HA receptors: regulators of signalling to the cytoskeleton. J Cell Biochem 1996;61:569-77.
  21. Kelleher D, Murphy A, Feighery C, Casey EB. Leukocyte function-associated antigen 1 (LFA-1) and CD44 are signalling molecules for cytoskeleton-dependent morphological changes in activated T cells. J Leukoc Biol 1995;58:539-46.
  22. DeGrendele HC, Estess P, Siegelman MH. Requirement for CD44 in activated T cell extravasation into an inflammatory site. Science 1997;278:672-5.


Relevances of anti-CD44 immunotherapy for cellular biology

INTRODUCTION - The CD44 molecule - the physiologic hialuronic acid receptor - is one of key mediators that direct the traffic of leukocytes into inflamed tissues. When applied in animal models of autoimmune arthritis, parenteral anti-CD44 antibody treatment exerts a dramatic antiinflammatory effect, but at high doses also a leukopenic effect. The goal of the present work is to elucidate the cellular basis of these phenomena.

Methods - In this study the authors used Western blot, immunoprecipitation, cell adhesion studies, flow chamber system studies (leukocyte rolling) and fluorescence microscopy following fluorescent labeling of actin cytoskeleton.

Results - Adhesion of CD44-expressing leukocytes to immobilized hialuronic acid does not result marked changes in cellular morphology. When incubated on immobilized anti-CD44 antibody, however, these cells spread, reorganize the actin cytoskeleton, and they adhere strongly to the surface. Studying the mechanisms of signal transduction, the authors found that engagement of CD44 with anti-CD44 antibody results in its enhanced association with numerous cytoskeletal regulator proteins, including ezrin, ankyrin, spectrin and focal adhesion kinase, thereby increasing the interaction between the cytoskeleton and the plasma membrane. Strong adhesion of the cells to immobilized anti-CD44 also prevents the rolling movement of these cells, mediated by CD44-hialuronic acid interactions, which precedes the extravasation of leukocytes to sites of inflammation.

Conclusion - These results may provide insight into the antiinflammatory mechanisms of anti-CD44 antibody treatment. Based on these results and results published by other investigators, anti-CD44 antibodies may be uselful in the immunotherapy of rheumatic diseases.
Magy Immunol/Hun Immunol 2002;1(1):21-25.

Correspondence: Dr. Gál István, Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum, III. Sz. Belgyógyászati Klinika, Debrecen and Rush University at Rush-Presbyterian-St. Luke’s Medical Center, Department of Orthopedic Surgery, Section of Biochemistry and Molecular Biology, Chicago, Illinois, USA;
Dr. Glant T. Tibor, Dr. Mikecz Katalin, Rush University at Rush-Presbyterian-St. Luke’s Medical Center, Department of Orthopedic Surgery, Section of Biochemistry and Molecular Biology, 1653 W. Congress Parkway, 60612, IL, Chicago, USA, telefon: (1)-312-942-5767, fax: (1)-312-942-8828,
e-mail: kmikecz@rush.edu
 
CD44, cell adhesion, actin cytoskeleton, hialuronic acid, anti-CD44 antibody